Extracto
Antecedentes
Los heparán sulfato proteoglicanos (HSPGs) son elementos de control en la señalización de Wnt, que se unen a extracelularmente Wnt ligandos y regular su capacidad de interactuar con los receptores de transducción de señales en la superficie celular. Sulf-1 y Sulf-2 son nuevos sulfatasas extracelulares que actúan sobre modificaciones dentro HSPGs glucosamina-6-sulfato interna (6S) y de ese modo modulan las interacciones HSPG con diversas moléculas de señalización, incluyendo ligandos Wnt. Nuevas pruebas indican la importancia de la señalización de Wnt reactivado en un número de cánceres, incluyendo el adenocarcinoma de páncreas.
resultados principio
Tanto las proteínas Sulf se upregulated en tumores de adenocarcinoma pancreático humano y se expresaron en términos generales en el páncreas humano líneas celulares de adenocarcinoma. Expresión de sulfatasas extracelulares humanos Sulf-1 y Sulf-2 mejorado la señalización de Wnt en un sistema reconstituido. Tres de las cuatro líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas ensayados exhibieron autocrina de señalización Wnt, en el que los ligandos Wnt extracelular se requiere para iniciar la señalización de Wnt aguas abajo. La exposición de estas células de adenocarcinoma pancreático a una forma catalíticamente inactiva de Sulf-2 o siRNA mediada por silenciamiento de endógena Sulf-2 inhibió tanto el crecimiento Wnt de señalización y celular. Sulf-2 silenciamiento en dos de estas líneas dio como resultado la reducción en la tumorigénesis marcadamente en ratones inmunodeficientes.
Conclusiones /Importancia
Hemos identificado la Sulfs como potenciadores de la señalización de Wnt autocrina en células de cáncer de páncreas y tienen demostrado su contribución al crecimiento y la tumorigenicidad de estas células. Desde los Sulfs son enzimas extracelulares, serían objetivos atractivos para la terapia del cáncer de páncreas. Nuestros resultados van en contra de la opinión predominante en la literatura que los Sulfs son reguladores negativos de la tumorigénesis
Visto:. Nawroth R, Van Zante A, Cervantes S, M McManus, Hebrok M, Rosen SD (2007) extracelular sulfatasas, Elementos de la vía de señalización de Wnt, positivamente regulan el crecimiento y la tumorigenicidad de células de cáncer pancreático humano. PLoS ONE 2 (4): E392. doi: 10.1371 /journal.pone.0000392
Editor Académico: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 18 Marzo, 2007; Aceptado: March 28, 2007; Publicado: 25 Abril 2007
Derechos de Autor © 2007 Nawroth et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación el apoyo de una Susan Komen Breast cáncer beca de la Fundación PDF0402844 (RN y DEG), la Beca de la Fundación alemana de Investigación NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte del Gobierno español (SC) y el Instituto Nacional de Salud Subvenciones GM57411 (DEG), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) y CA112537 (MH). La preparación de los lentivirus fue subvencionado por el Fondo para Sandler Lentivirus Core en la UCSF. Los patrocinadores no tuvo ningún papel en el diseño y realización del estudio, en la recopilación, análisis e interpretación de los datos, y en la preparación, revisión o aprobación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
adenocarcinoma de páncreas es la forma más común de cáncer de páncreas y uno de los tumores malignos más mortales con una tasa de supervivencia a 5 años del 3% y una mediana de supervivencia de menos de 6 meses [1]. Ha habido un interés reciente en el papel de vías de señalización embrionarias en cáncer. Una considerable evidencia ha demostrado que estas vías siguen siendo funcionales en un número limitado de células dentro del adulto y que la desregulación de estas vías contribuye a la formación y persistencia de tumores [2], [3]. En este sentido, la reactivación de Notch, Hedgehog y Wnt vías han atraído el interés reciente en los cánceres del tracto gastrointestinal, incluyendo adenocarcinoma de páncreas [2], [4], [5].
La desregulación de la señalización de Wnt en el adenocarcinoma de páncreas es el foco de este estudio. Wnts comprenden una gran familia de proteínas secretadas, que regulan el crecimiento celular, la apoptosis, la motilidad y la diferenciación durante el desarrollo embrionario [3]. En resumen, la activación de la vía Wnt canónica se inicia por la unión de ligandos Wnt a la señal de transducción de los receptores en la superficie celular, lo que conduce a la acumulación de no fosforilados β-catenina en el citoplasma. Después de su translocación al núcleo, β-catenina forma un complejo con miembros de la familia TCF /LEF de factores de transcripción, y activa los genes diana [3].
señalización Wnt estaba implicado primero en el cáncer mediante el análisis de tumorigénesis glándula mamaria inducida por el virus de tumor mamario de ratón (MMTV) [6]. Una alta proporción de los tumores se deben a la activación de la expresión de Wnt1 través de la inserción del provirus de MMTV en el
Wnt1
gen. Tumorigénesis se cree que está basado en una vía de transformación Wnt autocrino en el que la expresión del ligando Wnt por las células epiteliales mamarias proporciona un estímulo de crecimiento de las mismas células. Recientemente autocrina de señalización Wnt se demostró en el cáncer de mama, el cáncer y las líneas celulares de mieloma de ovario, [7], [8]. Este mecanismo, en el que ligandos Wnt extracelulares proporcionan un estímulo esencial para la proliferación celular, es distinta de la que se encuentra comúnmente en el cáncer de colon humano y varias otras formas de cáncer, en el que la activación constitutiva de la señalización de Wnt es una consecuencia de mutaciones en elementos citoplasmáticos aguas abajo tales como
APC, CTNN1
(que codifica la β-catenina) o
AXIN2
[3].
Estas mutaciones características en Wnt aguas abajo moléculas de señalización son muy raros en el adenocarcinoma de páncreas [9 ]. Sin embargo, la activación aberrante de la señalización de Wnt es una característica importante de adenocarcinoma pancreático humano, según lo revelado por la localización nuclear de β-catenina en una fracción significativa (30-65%) de los tumores [9], [10]. Consistente con la evidencia histoquímica, análisis bioquímico ha establecido una marcada elevación de β-catenina total y el aumento de su localización nuclear en dos tercios de los adenocarcinomas de páncreas [9]. Además, en estudios mecanísticos con líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas, la inhibición de la señalización de Wnt resultó en la proliferación celular y la supervivencia reducida in vitro [11].
Un área de interés actual son los elementos reguladores extracelulares en la vía de señalización Wnt. Entre éstas se secretan antagonistas de Wnt como las proteínas relacionadas Frizzled (sFRP), el factor inhibidor de Wnt (WIF) y la familia Dickkopf (DKK) [12]. Regulación a la baja de cualquiera de estos antagonistas inicia la activación Wnt y contribuye a varias formas de cáncer [12]. Una clase de proteínas extracelulares que regula positivamente la actividad de Wnt son proteoglicanos de sulfato de heparán (HSPGs). Glypicans, por ejemplo, se requieren para la señalización de Wnt durante el desarrollo en Drosophila y vertebrados [13]. HSPGs son también necesarios en los ejemplos de la formación de Wnt dependiente de tumor [14], [15]. La miríada de funciones de HSPG en el crecimiento y diferenciación de las células [16] están mediadas a través de su capacidad para unirse a un repertorio diverso de factores de crecimiento y los morfógenos. La unión depende del patrón de sulfatación de glucosamina (N-, 3-O, y las posiciones 6-O) y ácido urónico (2-O-posición) dentro de las cadenas de heparán sulfato adjuntos. [dieciséis]. 6-O-sulfatación (6S) de la glucosamina es de particular importancia en la unión de muchos ligandos importantes para HPSGs, incluyendo el Wnts [17] - [19]. Un mecanismo recién apreciado para la regulación de la señalización de estos ligandos es por "edición de" post-sintético de la pauta 6S de HSPG a través de la acción de una clase de sulfatasas extracelulares conocido como el Sulfs [20].
QSulf-1 , el primer miembro de la familia Sulf que se describirá, se descubrió en un análisis del desarrollo del músculo en el embrión de codorniz [20]. Esto fue seguido por la descripción de sus ortólogos en rata [21], el ratón y humano [22] y el descubrimiento del homólogo estrechamente relacionado, Sulf-2 [22]. Los Sulfs son endosulfatases óptimos de pH neutro que eliminan 6-O-sulfato de glucosamina a partir de residuos internos en subdominios altamente sulfatados de heparina /HSPGs [18], [19], [22], [23]. Los estudios iniciales de QSulf-1 revelaron un papel positivo en la regulación de la señalización de Wnt durante la especificación muscular en el embrión de codorniz [20]. Esta actividad depende de la capacidad de QSulf-1 para reducir la interacción de ligandos Wnt con HSPG. Los autores proponen un modelo de dos estados en los que las cadenas de HS forman un complejo HS-Wnt alta afinidad, que secuestra Wnt de la interacción con sus receptores de transducción de señales. La afinidad de Wnt para SA se debilita cuando QSulf-1 modifica el patrón 6S de las cadenas de HS, que permite el inicio de la señalización de Wnt [19].
promoción Sulf dependiente de la señalización de Wnt también se ha observado en otras eventos de desarrollo [24]. En pruebas in vitro sugieren que los Sulfs puede promover otras vías de señalización, incluyendo la angiogénesis y BMP de señalización [23], [25]. Es importante destacar que,
sulf
null ratones muestran una reducción de la masa corporal [26], [27]. Este fenotipo es consistente con papeles reguladores positivos para los Sulfs durante el desarrollo normal.
El descubrimiento de que la señalización Wnt canónica se activa en el adenocarcinoma de páncreas (véase más arriba) se ha centrado nuestra atención en la posible participación de la Sulfs en este tipo de cáncer . En el presente estudio, hemos demostrado la regulación positiva de ambas proteínas Sulf en tumores de adenocarcinoma pancreático. El uso de líneas celulares de cáncer de adenocarcinoma de páncreas humano, establecemos un papel para Sulf-2 en la promoción de la señalización de Wnt autocrina, el crecimiento in vitro de células y tumorigenicidad. Esta contribución positiva de una Sulf al crecimiento del tumor Wnt-dependiente es en fuerte contraste con varios informes en los que la expresión forzada de Sulfs antagoniza otras vías de señalización (por ejemplo, FGF-2, y HGF) en células tumorales y suprime el crecimiento celular [28] - [34].
resultados
Sulf-1 y Sulf-2 están regulados por incremento en el cáncer de páncreas humano
Extracción de DNA microarrays de datos públicas y un estudio cuantitativo de PCR establecen que
SULF1
transcripciones son regulados por incremento en el cáncer pancreático humano (Tabla 1). El último estudio encontró que el nivel medio de
SULF1
mRNA fue 22,5 veces mayor en el tejido de cáncer (n = 31) que en el páncreas normal (n = 19) [31].
In situ
hibridación localizada expresión de
SULF1
a estructuras tubulares, es probable que representa un carcinoma invasivo.
Para determinar si las proteínas Sulf fueron expresadas por el adenocarcinoma de páncreas en especímenes quirúrgicos , teñidas secciones de siete casos archivados con Sulf-1 y Sulf-2 anticuerpos y un control de IgG (Figura 1 A y B). conductos interlobulares benignos en las mismas secciones de tejido como el carcinoma invasivo sirve como un control interno. En 7/7 de los casos, las células epiteliales malignas generalmente mostraron moderada a fuerte tinción para Sulf-1 (Figura 1B). Para Sulf-2, 4/7 de los casos mostraron una fuerte tinción de estas células, 2/7 de los casos tenían tinción moderada y 1 caso fue negativo. La mayoría de los conductos benignos mostraron ninguna tinción o único rastro tinción para Sulf-1 (≈54%) o Sulf-2 (≈88%). tinción focal para Sulf-1 o Sulf-2 fue visto en una minoría de los conductos benignos. Difusa débil tinción de los fibroblastos para ambos Sulfs se observó en algunas zonas de estroma, por lo general en asociación con células inflamatorias. No había ninguna tinción con el control de IgG
A:. De serie de secciones representativas de adenocarcinoma pancreático se tiñeron con Sulf-1, Sulf-2 y el control de IgG. conductos benignos se compararon con áreas de carcinoma invasivo en la misma sección. B: Tabulación cuantitativa de Sulf inmunohistoquímica resultados en los casos de adenocarcinoma pancreático (0 = sin dejar rastro o manchas, 1 = tinción moderada, 2 = tinción fuerte, ND = no determinado). C: Se aisló el ARN de las líneas celulares de adenocarcinoma de 24, se preparó ADNc y se sometió a PCR con cebadores para
SULF1
y
SULF2
y β-
actina como control de carga
. D: inmunotransferencias se realizaron en lisados de células y medio (CM) condicionados utilizando anticuerpos contra Sulf-1 (panel superior) y Sulf-2 (en el medio y el panel inferior). Sólo la proteína Sulf-2 se detectó en el CM.
A continuación, se determinó la expresión de los Sulfs en líneas celulares de adenocarcinoma pancreático humano mediante el uso de RT-PCR para encuestar a un panel de 24 líneas celulares. Estos se derivan de cualquiera de los adenocarcinomas de páncreas primarios o metastásicos [5].
SULF1
transcripciones fueron detectados por RT-PCR en 12/24 y
SULF2
transcripciones en 21/24 de estas líneas (Figura 1C). Para examinar la expresión a nivel de proteínas, se investigó 4 de estas líneas celulares, 3 de los cuales fueron positivos para ambos
SULF
transcripciones (CFPAC-1, Hs766T, L3.6sl) y 1, que era positivo para solamente
SULF2 gratis (BxPC-3). Se realizó inmunotransferencias en lisados de detergente y medio condicionado (CM) derivadas de estas células (Figura 1D). se detectó proteína Sulf-1 en una única línea celular (células Hs766T), mientras que la proteína Sulf-2 estaba presente en todos 4. En lisados de detergente, el peso molecular de las especies principales era 130 kDa, que corresponde a una forma no procesada por tanto proteínas [22]. proteína Sulf-2 fue lanzado en CM por las 4 líneas celulares. Por el contrario, Sulf-1 no se detectó en Hs766T CM. Como ya se observó durante varias líneas celulares de carcinoma de mama [25], se detectó la proteína Sulf-2 en CM como un componente de procesado 75 kDa.
Sulf-1 y Sulf-2 promueven la señalización Wnt
QSulf-1 se ha demostrado que la promoción de la activación de vías de señalización de Wnt en respuesta a ligandos Wnt exógenos [20]. Elegimos estudiar los efectos de la Sulfs humano sobre la señalización de Wnt en un sistema reconstituido similares [20]. Overexpressed la Sulfs en células HEK 293T y co-cultivadas con fibroblastos estas células que expresan Wnt1 ya sea o Wnt4. actividad de señalización Wnt se midió por el sistema de TCF-informador de luciferasa (TOPflash /FOPFLASH), un método estándar para medir-catenina dependiente de β activación transcripcional [20]. La expresión de cada Sulf aumentada de señalización Wnt en respuesta a cualquiera ligando Wnt, mientras que las células HEK 293T transfectadas de manera simulada no respondieron (Figura, la Fig. S1). De este modo, tanto HSulfs, como QSulf-1 [20], puede promover la señalización de Wnt.
Expresión de sFRP-2 inhibe la señalización Wnt en las líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas
El trabajo previo ha establecido la señalización de Wnt activa dentro de una serie de las líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas, incluyendo las 4 líneas anteriores [M. Pasca di Magliano y M. Hebrok, observaciones no publicadas]. Para determinar si la señalización de Wnt en estas 4 líneas era autocrino en la naturaleza, se emplearon secretada relacionada con Frizzled proteína-2 (sFRP-2) como un antagonista de Wnt extracelular [35], [36]. Estamos transfectadas transitoriamente las líneas de células con un ADNc para sFRP-2 o con el vector vacío (ctrl) y la actividad de Wnt medida por el ensayo de indicador de TCF-luciferasa. sFRP-2 expresión disminuida de señalización Wnt ≈60% en 3 de las líneas pero no tuvo ningún efecto sobre CFPAC-1 células (Figura 2). Estos resultados establecen que el BxPC-3, las células Hs766T y L3.6sl posee una vía de señalización Wnt autocrina.
Las líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas indicadas fueron transfectadas con sFRP-2 cDNA (sFRP-2) o el control de vector ( ctrl) y el sistema reportero TOP /FOPFLASH. Wnt actividad fue determinada por la actividad de luciferasa. Los valores mostrados son las medias ± SD es para 3 determinaciones independientes. Las diferencias entre sFRP y el control fueron significativas en la prueba t de Student con valores de p & lt;. 0.002 para BxPC-3, Hs766T y L3.6sl
catalíticamente inactiva la proteína sulfatasa humana inhibe el crecimiento celular y la señalización de Wnt
a continuación pregunta si los Sulfs endógenos en estas líneas celulares estaban involucrados directamente en la señalización de Wnt. Cuando overexpressed la Sulfs, no hubo efecto de la señalización de Wnt (datos no mostrados). Puesto que todas estas células expresaron niveles significativos de la Sulfs, próxima pregunta si puede haber efectos inhibitorios si expresamos formas catalíticamente inactivos de estas proteínas. Hemos demostrado previamente que la mutación de dos cisteínas en el dominio de sulfatasa de cada Sulf eliminado actividad sulfatasa [22]. Estamos transfectadas un ADNc que codifica inactiva Sulf-1 (S1ΔCC), Sulf-2 (S2ΔCC) o vector vacío (ctrl) en cada una de las 4 líneas celulares y la actividad de Wnt nuevamente medido. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión de ya sea inactivo Sulf inhibió la actividad de Wnt ≈50% en todos menos en células CFPAC-1. Las 3 líneas respondieron fueron los mismos que exhibió la señalización de Wnt autocrina (Figura 2). El hecho de que sea inactivo Sulf ejerce efectos equivalentes en estas líneas celulares de cáncer pancreático sugiere redundancia funcional de las dos enzimas
A:. Cuatro líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas como se indica fueron transitoriamente transfectadas con ADNc que codifican ya sea una forma catalíticamente inactiva de Sulf-1 ( "S1ΔCC") o una forma catalíticamente inactiva de Sulf-2 ( "S2ΔCC") o con el vector vacío ( "control"). Los mutantes fueron hechos por la sustitución de dos cisteínas adyacentes con alaninas. la señalización de Wnt se determinó utilizando el sistema indicador TOP /FOPFLASH. Los valores mostrados son la media ± SD de determinaciones independientes para 4 y las diferencias entre las células mutantes y de control fueron estadísticamente significativas con valores de P & lt; 0,02 para BxPC-3, las células Hs766T y L3.6sl (t de Student). B: Las líneas celulares de adenocarcinoma pancreático se cultivaron con medio condicionado derivado de cada uno de los siguientes: células HEK-293 parentales ( "control"), las células HEK 293T que expresan establemente de tipo salvaje Sulf-2 (denotados "Sulf-2"), o expresar una forma catalíticamente inactiva de Sulf-2 ( "S2ΔCC"). De tipo salvaje Sulf-2 de proteínas y el mutante estaban presentes en el medio de las dos células que producen a aproximadamente niveles equivalentes acondicionado. la señalización de Wnt se determinó como antes con el ensayo indicador de TCF-luciferasa. Los valores mostrados son las medias ± SD es para 3 determinaciones independientes y las diferencias entre Sulf-2 mutante y control fueron estadísticamente significativas para BxPC-3 (p = 0,002), Hs766T (p = 0,01) y L3.6sl (p = 9 × 10
-6) (prueba t de Student). C: Las líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas se cultivaron en un sistema transwell sobre capas de alimentación consistentes en: medio solo ( "Medium"); HEK 293T células parentales ( "HEK 293T"); células HEK 293T que producen de forma estable de tipo salvaje Sulf-2 ( "Sulf-2"); o una forma catalíticamente inactiva de Sulf-2 ( "S2ΔCC"). El crecimiento celular se controló por recuento de hemocitómetro para 4 días. Los valores mostrados son las medias ± SD es para 3 determinaciones independientes.
A continuación pregunta si la adición exógena de proteína Sulf catalíticamente inactiva también podría interferir con la señalización de Wnt. Como fuente de proteína Sulf-2, se utilizó células HEK 293T que fueron transfectadas de forma estable ya sea con el tipo salvaje humana Sulf-2 (S2) o catalíticamente inactivada Sulf-2 (S2ΔCC) [25]. También usamos las células HEK 293T parentales (293T) como controles. Los transfectantes estables secretan los Sulfs activos e inactivos a niveles comparables (datos no mostrados). Se incubaron las células de adenocarcinoma de páncreas durante 16 horas con CM partir de estas células o con medio de control y de señalización Wnt en comparación. La exposición a la proteína inactiva Sulf-2 (S2ΔCC) inhibe la señalización de Wnt en las mismas 3 líneas celulares que eran sensibles a la transfección con el S2ΔCC cDNA (Figura 3B), mientras que las células CFPAC no mostraron un efecto. La adición de medio acondicionado con proteína activa Sulf-2, no promovió la señalización Wnt sobre el nivel basal.
A continuación, hemos creado un sistema de co-cultivo para examinar los efectos de la proteína recombinante Sulf sobre el crecimiento celular de las mismas líneas celulares. Las células del cáncer pancreático se sembraron a baja densidad en filtros transwell por encima de capas de alimentación, que consistían en células HEK 293T parentales o células HEK 293T que expresan activo o inactivo Sulf-2. Los recuentos de células fueron controlados durante los próximos días. Los resultados en paralelo el efecto supresor observamos en la señalización de Wnt. Por lo tanto, en comparación con medio de control, S2ΔCC CM inhibió el crecimiento de células L3.6sl (Figura 3C) BxPC-3, Hs766T y pero no tuvo efecto sobre las células CFPAC-1. Por el contrario, activa Sulf-2 no promover o inhibir el crecimiento celular de cualquiera de las líneas.
Lentiviral shRNA silenciamiento de Sulf-2 en células de adenocarcinoma de páncreas reduce la señalización de Wnt, la proliferación celular, y la supervivencia celular
para investigar más a fondo el papel de Sulf-2 en la señalización de Wnt y el crecimiento celular, se utilizó la metodología de shRNA para silenciar la expresión de Sulf-2 en estas células. Empleamos tres shRNA construye: dos construcciones independientes dirigidas a Sulf-2 (1413 y 1143) y un control (Ctrl). Estas construcciones se utilizan en diferentes fondos de vector en el que la presencia o ausencia de GFP permite controlar de expresión del shRNA (ver Materiales y Métodos). Las células transducidas se clasificaron para la expresión de GFP y posteriormente analizadas para Sulf-2 de expresión. Los 1143 y 1413 constructos (PLV-1143, PLV-1413) produjeron 80% y 90% de reducción de la proteína Sulf-2, respectivamente, en células L3.6sl, en relación con el control de shRNA (PLV-ctrl) (Figura 4A). No hubo una reducción de la proteína en las células tratadas PLV-ctrl en relación con las células sin tratar (datos no mostrados). La construcción de PLV-1413 produjo una reducción similar en células BxPC3 en dos fondos de vector diferentes (PLV y psico).
La inactivación de Wnt resultados en la disminución de los niveles de β-catenina activa de señalización (N-terminal no fosforilada) en el núcleo [3]. Por lo tanto, hemos aislado la fracción nuclear de Sulf-2 células silenciadas y control (BxPC-3 y L3.6sl) y se analizaron los niveles de β-catenina activa. Hubo una disminución ≈80% de β-catenina en las células BxPC-3 Sulf-2 silenciados, y una reducción ≈30% en las células L3.6sl (Figura 4B). También se cuantificó la actividad de Wnt utilizando el sistema informador de TCF-luciferasa. De acuerdo con el resultado de β-catenina, este ensayo confirma que la señalización de Wnt se inhibió sustancialmente en los Sulf-2 células silenciadas en relación con células de control tratadas tanto para células L3.6sl (Figura 4C) BxPC-3 y. Una vez más, BxPC-3 células mostraron una inhibición más fuerte (52% con PLV-1413) que las células L3.6sl (inhibición del 35% con PLV-1413 o PLV-1143)
A:. Las células fueron transducidas con el condicional (psico) o no condicional lentivirus (pLVTHM) de codificación, ya sea Sulf-2 específica (1413, 1143) o control (ctrl) shRNAs. Las células se lisaron y cantidades iguales de proteínas se sometieron a SDS-PAGE. En el caso de la psico, las células se lisaron 10 días después de la transfección cre. Sulf-2 niveles de proteína se determinaron mediante la realización de inmunotransferencias y los mismos lisados se sondaron con anticuerpo anti actina como control de carga. B: 100 g de proteína total de la fracción nuclear de las células se aplica a SDS-PAGE y las cantidades de activo beta-catenina se detectaron utilizando un anticuerpo contra no fosforilada beta-catenina. Como control de carga, los mismos lisados se analizaron con un anticuerpo anti histona. C: células transducidas de los padres, PLV-ctrl, PLV-1413 y PLV-1143 fueron transfectadas con el reportero sistema FOP /TOPflash y se detectó la actividad de luciferasa 48 horas más tarde. Los valores mostrados son las medias ± SD es para 3 determinaciones independientes y las diferencias entre ctrl y 2 Sulf-células silenciadas fueron estadísticamente significativas (BxPC-3, p = 0,002 y (L3.6sl, p = 0,013 y 0,017 para los dos vectores de silenciamiento) .
se determinó los efectos de Sulf-2 silenciamiento sobre la proliferación celular midiendo la incorporación de 5-bromodesoxiuridina (BrdU) en las células. Hubo una reducción del 25-30% de las células sometidas a S- fase en la L3.6sl, BxPC3, y las células Hs766T, y sólo una reducción del 5% en las células CFPAC-1 (Figura 5). Además, hemos realizado ensayos de apoptosis mediante la medición de la tinción de anexina V. Los Sulf-2 silenciados células BxPC-3 mostraron un aumento de la apoptosis del 33%, mientras que las células L3.6sl mostró incrementos del 65% y el 79% con dos shRNAs independiente (Figura 5B)
a:. las celdas indicadas fueron transducidas con el control (pLV-ctrl ) o Sulf-2 shRNA (pLV-1413, pLV-1143). Las células se incubaron con BrdU durante una hora y la incorporación de BrdU se detectó por análisis de citometría de flujo. Los valores que se muestran son para 2 experimentos independientes de la media +/- SD. Las diferencias en la absorción de BrdU entre ctrl y células Sulf-2 silenciados fueron estadísticamente significativas para BxPC-3 (p & lt; 0,005), L3.6sl (p & lt; 0,007) y Hs766T (p & lt; 0,001). B: las células pancreáticas BxPC-3 y L3.6sl se transdujeron con control (PLV-ctrl) o Sulf-2 shRNA (PLV-1413, PLV-1143) se recogieron y se incubaron con conjugado con PE V. anexina Posteriormente las células se sometieron a citometría de flujo análisis. Las diferencias entre células y entre ctrl Sulf-2 silenciados fueron estadísticamente significativas con valores de p de 0,0001 para BxPC-3 y P & lt; 0,004 para L3.6sl. C y D: células L3.6sl fueron transducidas con poblaciones ya sea PLV-1413, PLV-1143 o PLV-ctrl y mixtas de siRNA y las células que expresan los no-siRNA fueron co-cultivadas. Ratios de transducidas a las células no transducidas se midieron con el tiempo por la expresión de GFP. BxPC-3 células fueron transducidas con cualquiera psico-ctrl o psico-1413 y transfectadas transitoriamente con cre-recombinasa para activar la expresión del shRNA. Las poblaciones mixtas resultantes de células con activado (GFP) y (GFP +) expresión shRNA inactivada fueron co-cultivadas. Ratios de GFP + a GFP células, utilizando la citometría de flujo se analiza como una función del tiempo. La expresión de GFP no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento celular en la población control.
Para examinar el crecimiento celular a través del tiempo en las células Sulf-2 silenciados, se comparó el crecimiento de las células en las que fue silenciado Sulf-2 con no transduced células de los padres en un cultivo mixto. En co-cultivos paralelos, se comparó el crecimiento de las células transducidas con shRNA de control con células parentales no transducidas. Para ambos de los Sulf-2 shRNAs específicas, las células L3.6sl no silenciada parentales alcanzaron progresivamente las células silenciadas con el tiempo en cultivo. Se observaron resultados similares con las células BxPC-3 (Figura 5D). En contraste, no hubo cambios en la proporción de las células de control transducidas a células de los padres con el tiempo (Figura 5C).
El silenciamiento de Sulf-2 inhibe el crecimiento tumoral in vivo
Para determinar los efectos de Sulf-2 silenciamiento de la tumorigenicidad de las células y L3.6sl BxPC-3
in vivo
, se comparó el crecimiento de los tumores que se formó en ratones inmunodeprimidos con o sin el silenciamiento de Sulf-2. Los ratones desnudos (CD-1) fueron inyectados por vía subcutánea con células transducidas ya sea PLV-ctrl o PLV-1413 1 semana después de la transducción. El tamaño del tumor se siguió con el tiempo mediante la palpación externa. Al final del experimento, los animales se sacrificaron y se midieron los pesos tumorales. Como se muestra en la Figura 6, los tumores derivados de Sulf-2 células silenciadas (L3.6sl o BxPC-3) crecieron a una tasa notablemente más lento que los derivados de las células de control (Figura 6B). Los tumores recogidos a partir de células silenciadas se redujeron en consecuencia en el peso sin superposición de los dos grupos para ninguna línea celular (Figura 6C).
L3.6sl y BxPC-3 células fueron transducidas con cualquiera PLV-1413 o pLV -Ctrl y se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos a 5 x 10
6 por sitio. A: tumores L3.6sl derivados recogidos de ratones después de 17 días de crecimiento B: El tamaño del tumor se controló con el tiempo y los valores representan la media (+/- SEM) de 4 ratones para las células L3.6sl y 6 (PLV-ctrl) o 5 (pLV-1413) ratones para BxPC-3 células. C: Los animales se sacrificaron y se examinó el peso del tumor. La diferencia en pesos de los tumores entre los dos grupos fue significativa para las células L3.6sl con un valor de p de 0,01 y para BxPC 3-células con un p-valor de 0,029 (t de Student).
Discusión
la opinión predominante en la literatura ha sido que los Sulfs son reguladores negativos del crecimiento de células tumorales. Un número de informes demostrado que la sobre expresión de Sulf-1 [28] - [34] o Sulf-2 del factor de crecimiento [32] en el tumor líneas celulares inhibe la señalización en respuesta a varios factores, como el FGF-2, HB-EGF, y HGF. Por otra parte, se redujo la tumorigenicidad de las células en ratones inmunocomprometido Sulf-overexpressing [31], [32], [34]. Los efectos negativos de Sulfs en FGF-2 de señalización son consistentes con el requisito conocido por 6S en HSPG en el FGF-2 complejo de señalización [37]. Estos hallazgos línea celular han llevado a la sugerencia de que la baja regulación de Sulfs podría proporcionar células tumorales con una ventaja de crecimiento en ciertas configuraciones. Este modelo puede tener validez para el subconjunto significativo (dos tercios) de los casos de cáncer de ovario [28] y el subconjunto menor (29%) de los casos de carcinoma hepatocelular [30] en el que
SULF1
expresión está regulado por disminución en relación con que en el tejido normal. Sin embargo, el modelo es problemático para los subconjuntos considerables de varios tipos de cáncer que muestran incrementos en
SULF
expresión. Así, por ejemplo,
SULF1
es upregulated en subconjuntos significativos de cáncer de mama [38], cáncer de páncreas [31], [39] (Tabla 1) adenocarcinoma de pulmón [40] y carcinoma hepatocelular [30], mientras
SULF2
está regulada al alza en el mieloma múltiple [32], cáncer de mama y cánceres del sistema nervioso central [41].
Para entender el significado de upregulated
SULF
expresión en un cáncer, nos optó por centrarse en los adenocarcinomas de páncreas debido a la evidencia clara que asocian este tipo de cáncer con canónica de señalización Wnt, una vía de señalización que se sabe están regulados positivamente por los Sulfs durante el desarrollo (véase más arriba). Consistente con los datos de transcripción de expresión (Tabla 1), se encontró que ambos Sulfs se expresaron fuertemente a nivel de proteínas por las células epiteliales malignas en adenocarcinoma de páncreas. Para facilitar la investigación de estas enzimas en el cáncer de páncreas, examinamos
SULF
expresión en un gran panel de líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas y encontró su expresión generalizada, en especial de
SULF2
. Elegimos 4 líneas para el estudio, todos los cuales expresan la proteína Sulf-2 y uno de los cuales expresan tanto Sulfs. Estudios anteriores han demostrado que la proliferación y la supervivencia de 3 de estos (BxPC-3, Hs766T y L3.6sl) dependen de activado señalización Wnt [M. Pasca di Magliano y M. Hebrok, observaciones no publicadas]. Hemos demostrado que la señalización de Wnt fue marcadamente inhibida por la sobreexpresión de sFRP-2 recombinante en estas líneas celulares. Por otra parte, la sobreexpresión de catalíticamente inactiva Sulf-2 en las mismas líneas resultó en una marcada inhibición de la actividad de Wnt, y la exposición de las células a inactivo proteína Sulf-2 durante el cultivo inhibió tanto la señalización de Wnt y el crecimiento. Estos resultados son consistentes con el crecimiento Wnt-ligando depende de estas células (la "señalización Wnt autocrina"), que es modulada por el Sulfs extracelular. Es plausible que la línea celular CFPAC-1, que fue refractario a todos estos tratamientos, lleva una mutación activadora en elementos aguas abajo de la vía de señalización Wnt que evite la necesidad de ligandos Wnt extracelulares y la Sulfs. Cabe señalar que los Sulfs representan un ejemplo adicional de un factor extracelular, que modula la señalización de Wnt.