Extracto
La relación entre los peroxisomas γ proliferador activado del receptor (
PPARg
) expresión y los cambios epigenéticos que ocurren en la patogénesis del cáncer colorrectal es en gran parte desconocida. Hemos investigado si
PPARg
se regula epigenética en el cáncer colorrectal progresión (CRC).
PPARg
expresión se evaluó en los tejidos de CRC y vinculado mucosa normal por Western Blot e inmunohistoquímica y en relación con los parámetros y la supervivencia clinicopatológicas de los pacientes.
PPARg
metilación del promotor se analizó mediante la metilación específica de PCR y secuenciación de bisulfito.
PPARg
expresión y promotor de la metilación se examinaron de manera similar también en líneas celulares derivadas de CRC. inmunoprecipitación de la cromatina en condiciones basales y después del tratamiento epigenética se realizó junto con experimentos golpeando hacia abajo de factores reguladores putativos. La expresión génica se monitorizó mediante inmunotransferencia y ensayos funcionales de la proliferación celular y la invasividad. La metilación de una región específica del promotor está fuertemente correlacionada con
PPARg
falta de expresión en el 30% de los CCR primario y con un mal pronóstico de los pacientes. Sorprendentemente, el mismo patrón de metilación se encuentra en
PPARg
-negativos líneas celulares de CRC. tratamiento epigenética con 5'-aza-2 'desoxicitidina puede revertir esta condición y, en combinación con tricostatina A, dramáticamente re-activa la transcripción de genes y la actividad del receptor. silenciamiento transcripcional se debe a la contratación de MeCP2, HDAC1 y EZH2 que imparten firmas cromatina represivas que determinan un mayor potencial de proliferación celular e invasivo, características que experimentalmente se puede revertir. Nuestros resultados proporcionan una visión mecanicista novela en el silenciamiento epigenético de
Hoteles en PPARg CRC que puede ser relevante como marcador pronóstico de la progresión tumoral
Visto:. Pancione M, L Sabatino, Fucci A, Carafa V, Nebbioso A, Forte N, et al. (2010) El silenciamiento de la epigenética activado por proliferadores de peroxisomas receptor γ es un biomarcador para la progresión del cáncer colorrectal y pacientes Resultado adverso ". PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10.1371 /journal.pone.0014229
Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 10 de julio de 2010; Aceptado: 9 de noviembre de 2010; Publicado: Diciembre 3, 2010
Derechos de Autor © 2010 Pancione et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado por becas de AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) de VC y L. A .; proyecto de la UE a Los Ángeles Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs) son dependientes de ligando factores de transcripción que pertenecen a la superfamilia de receptores hormonales nucleares [1]. Tres isoformas de PPAR diferentes, α, β y γ se han aislado hasta el momento, cada uno con un patrón distinto de expresión tisular y la capacidad de interactuar con diversas clases de compuestos. Específicamente, la isoforma PPAR está implicada en una amplia gama de procesos fisiológicos [2]: integra el control de la energía, los lípidos y la homeostasis de la glucosa y juega un papel fundamental en la adipogénesis, la respuesta inflamatoria y la diferenciación de muchas células epiteliales [3]. Consistentemente, las variaciones en
PPARG
de expresión de genes o mutaciones se han asociado con la tumorigénesis [4] - [6]. Sin embargo, resultados contradictorios se han reportado hasta el momento, planteando la cuestión de si PPAR facilita o suprime la tumorigénesis [7], [8]. Recientemente, hemos demostrado que los cánceres colorrectales esporádicos (CRC) que presentan están asociados significativamente con un peor pronóstico de los pacientes redujo los niveles de expresión de PPAR; en el mismo tipo de tumores,
PPARG
ha demostrado ser un factor pronóstico independiente [9], [10], lo que sugiere la posibilidad de apuntar a este gen con fármacos en aplicaciones clínicas [10]. Los mecanismos moleculares que subyacen a
PPARg
regulación de la expresión en la progresión del CRC son todavía desconocidas [9].
Cada vez es más claro que, además de las alteraciones genéticas, las modificaciones epigenéticas contribuyen a la tumorigénesis [11] . La regulación epigenética implica modificaciones heredables que no cambian las secuencias de ADN, pero proporcionan capas "extra" de control para regular la organización de la cromatina y la expresión de genes [12]. metilación aberrante del ADN en secuencias ricas en CpG, también conocido como "islas CpG", ubicadas en las regiones promotoras de aproximadamente la mitad de los genes conocidos, conduce al silenciamiento epigenético de la expresión de genes [11], [12]. En CRC, extensa metilación del ADN se ha detectado en varios loci, específicamente en las regiones promotoras de genes supresores de tumores (TSG), una característica de un subgrupo de tumores que presentan el llamado "CpG fenotipo isla methylator" (CIMP) [13] . Otros eventos epigenéticos, tales como modificaciones de las histonas represivas, cooperan para establecer el silenciamiento de genes estable. A "código de histonas" se ha sugerido proporcionar una firma en residuos de aminoácidos específicos que se correlaciona con la expresión de gen activo o reprimido [11], [12]. El vínculo entre la metilación del ADN y modificaciones de las histonas parece estar mediada por las proteínas de unión a ADN CpG metilo, un miembro de las cuales MeCP2 juega un papel importante para establecer esta interacción [14]. regiones metiladas de ADN, generalmente enriquecidos en histonas modificadas, generan una cromatina más apretada en el que el acceso de factores de transcripción específicos a sus sitios de unión análoga se deteriora en gran medida [12]. Cómo metilación del ADN y el patrón de modificaciones de las histonas en las regiones promotoras de los genes específicos están asociados con la iniciación y progresión del cáncer, en particular, en el CCR esporádico, aún no se ha dilucidado [15]. En este informe, analizamos uno a cien y cincuenta y dos CRC primaria y emparejado mucosa normal con el fin de correlacionar
PPARg
variaciones de expresión mediada por eventos epigenéticos con la progresión del tumor y la supervivencia de los pacientes. Hemos ampliado el análisis de líneas celulares derivadas de CRC como un sistema para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a
PPARg
silenciamiento debido a las variaciones epigenéticas.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Fatebenefratelli en Benevento. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis.
Las muestras tumorales
Ciento cincuenta y dos pacientes diagnosticados primaria CCR esporádico y tratados quirúrgicamente en el Departamento de Cirugía, Fatebenefratelli hospital, Benevento, Italia, entre 1999-2004, fueron investigados en este estudio. Cincuenta y dos casos abarcan tanto las muestras de líquido de nitrógeno se congelaron, obtenidas inmediatamente después de la resección quirúrgica, y los bloques de parafina. Cada muestra se corresponde con la mucosa aparentemente normal adyacente (a 20 cm de distancia de la masa tumoral) eliminado durante la misma cirugía. Ninguno de los pacientes tenía un historial familiar de la disfunción intestinal o CRC, había recibido quimioterapia o radiación antes de la resección, ni había tomado drogas no esteroides anti-inflamatorios sobre una base regular. tratamientos postoperatorios convencionales fueron proporcionados a todos los pacientes, dependiendo de la severidad de la enfermedad. Las características clínico-patológicas de los pacientes investigados son reportados (Tabla 1). El seguimiento estaba disponible para todos los pacientes, con una duración media postoperatoria de 59,5 ± 26,5 meses. Longitud total de la supervivencia se calculó a partir de la primera cirugía. Los pacientes fueron seguidos prospectivamente hasta su muerte o su examen médico más reciente.
Líneas celulares y 5'-aza-2'- desoxicitidina y tricostatina Un tratamiento
líneas celulares derivadas
Doce eran CRC utilizado en este estudio y se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron como se sugiere. Para la desmetilación del ADN, las células se trataron con 1 o 5 M 5'-aza-2 'desoxicitidina (AZA) durante 72 hs o 300 nM tricostatina A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) durante 24 hs, solos o en combinación. Después de los tratamientos, las células se recogieron para el ADN, el ARN o la extracción de proteínas.
extracción de ADN, el tratamiento de bisulfito, análisis de metilación y secuenciación
ADN genómico se aisló a partir de tejidos congelados o a partir de muestras incluidas en parafina utilizando un procedimiento estándar [6], o el kit de FFPE de tejido (56404, Qiagen, Hilden, Alemania), respectivamente. Una g de cada muestra de ADN se modificó bisulfito de acuerdo con el protocolo del fabricante (59104, Qiagen, Hilden, Alemania). Tanto universalmente no metilado (59665) y CpGenome ADN metilado universalmente (59655, Qiagen, Hilden, Alemania) se utilizaron en cada reacción como control no metilado o metilado, respectivamente. La búsqueda de contenido de CpG en el
PPARg
promotor se realizó utilizando el software Methprimer según la definición CpG isla. cebadores de PCR para PCR específica de metilación (MS-PCR) fueron diseñados utilizando Primer Express de metilo v1 software. Ambos no metilado (U) y metilado (M) conjuntos específicos de cebadores fueron diseñados sobre la base de la cadena positiva del ADN con bisulfito convertido cubriendo las islas CpG en el
PPARg
región promotora. reacciones MS-PCR se realizaron usando el kit de MS-PCR (59305, Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se cargaron en no desnaturalización 3% geles de agarosa, teñido con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo un transiluminador de UV. Primer secuencias se enumeran (Tabla S1). la secuenciación de bisulfito (BS) se llevó a cabo de forma automática en el producto de amplificación de PCR obtenido mediante el uso de un conjunto de cebadores que no contengan los sitios CpG dentro de sus secuencias y diseñado en modificado bisulfito de ADN (Applied Biosystems, Applera, Foster City, EE.UU.).
chip y ensayo de MeDIP
ensayos de chip y la amplificación q-PCR (BioRad, Hercules, EE.UU.) se realizaron como se describe [16]. Los cebadores utilizados se describen (Tabla S1). MeDIP ensayo se llevó a cabo según lo recomendado por el proveedor (Diagenode, Liège, Bélgica). Los anticuerpos generados contra: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 y MeCP2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), H3K27me3, (Millipore, Billerica, EE.UU.), ARN pol II y P-RNA pol II (Covance, Dallas, EE.UU.), ZAC e IgG purificada (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) se utilizaron en los ensayos de chip.
Western blot y análisis inmunohistoquímico
Western blot se realizó en extractos de proteínas de los tejidos tumorales y la mucosa normal adyacente tomadas durante cirugía y celulares CRC líneas, como se informó anteriormente [6], [9]. Se realizó un análisis inmunohistoquímico en tumores y mucosa no neoplásica distante como se describe [9]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-PPAR? (E-8), anti-ZAC (H-253), anti-ERK media (MK1) y anti-p-ERK (E-4) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.); anti-E-cadherina (610.405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, EE.UU.); anti-MeCP2 (ab55538), anti-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, Reino Unido); anti-EZH2 (4905) (Cell Signaling, Boston, EE.UU.); anti-β-actina (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.).
MTT y ensayos de apoptosis
Las células se sembraron por triplicado en 24 o placas de 96 pocillos y la MTT ensayo (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante a los 0, 24, 48, 72 y 96 hs después de alcanzar la confluencia, como se indica. Las curvas de crecimiento se establecieron teniendo en cuenta los resultados medios obtenidos a partir de tres experimentos independientes. Para analizar la quimio-sensibilidad a las células agonistas PPAR fueron tratados con 5 M troglitazona (TZD). ensayo de apoptosis se realizó por análisis de citometría de flujo (FCA) utilizando yoduro de propidio tinción (PI). En pocas palabras, después de la incubación con TZD, se recogieron las células y se fijaron en etanol al 70% enfriado en hielo /PBS y se almacenaron a 4 ° C durante la noche. Después, las células suspendidas se lavaron con PBS, se incubaron en una solución de PI para 15 min. a 37 ° C e inmediatamente se analizaron con un citómetro de flujo de exploración FAC (Becton Dichinson, San José, EE.UU.).
ensayos de migración y la invasión
Para el ensayo de cicatrización de heridas, las células se sembraron en placas y se cultivaron hasta confluencia 60-mm. Después de un 6 hs larga privación de suero, una herida se hizo mediante el uso de una punta de micropipeta para raspar las células. motilidad celular se estudió después de 24 y 48 hs, a raíz de las células de diferentes campos microscópicos. Por último, el área de la herida correspondiente a cada tiempo fue digitalizado y cuantificado usando un software Metamorph Imaging System versión 6.0 para Microsoft Windows. Un porcentaje promedio de cierre de la herida se calculó a partir de tres experimentos independientes. Para determinar la invasividad un ensayo transwell se llevó a cabo usando un inserto de cultivo celular de 24 pocillos, de poro 8 micras (3097, Falcon-Becton Dickinson, EE.UU.). Después de la hidratación de la matrigel en el compartimiento superior, se sembraron las células y se incubaron. Veinticuatro y cuarenta y ocho hs más tarde las células de la superficie superior del filtro se retiraron con un hisopo de algodón; los debajo se fijaron con paraformaldehído al 4%, se tiñeron con 0,2% de cristal violeta y se cuentan. La cuantificación se obtiene contando al menos 10 campos de potencia más bajos a partir de tres experimentos independientes.
extracción de RNA y semi-cuantitativa con transcripción inversa-PCR
ARN total fue aislado de las líneas celulares y tejidos con Trizol con modificaciones menores (Invitrogen Carlsbad, EE.UU.). PCR con transcripción inversa (RT-PCR) se realizó mediante la escritura de Super-II (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) y la amplificación por PCR usando cebadores específicos para
PPARg
. han sido previamente informado de las condiciones de RT-PCR y los cebadores utilizados [5]. En todas las reacciones de PCR,
GAPDH
sirvió como control interno para la normalización. Los productos amplificados se corrieron en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio.
Los plásmidos y transfecciones
El PPRE-TK reportero de luciferasa dirigido plásmido, el pcDNA3 que lleva el tipo salvaje
PPARG
cDNA y las condiciones de transfección ya se han descrito [6]. Para los ensayos de re-activación de genes, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos, se trató con AZA y TSA solo o en combinación y transfectadas transitoriamente con el plásmido reportero. Después de 12 hs, 1 TZD M o el vehículo solo se añadieron al medio. Cuando se indica, GW9662, un antagonista selectivo de PPAR, se utilizó.
siRNA
Un vector retroviral PSM2C (clon Identificación VH2-203345) que lleva un ADN corto horquilla (shRNA, número de catálogo RHS1764- 9494331) se utilizó para la orientación PPAR mRNA. células HT29 fueron transfectadas de forma estable con el vector de shRNA-PPAR? y los clones positivos seleccionados usando 1 M puromicina. Un vector que lleva shRNAs no específicas o un vector vacío se utilizaron como controles. El siRNA diseñado para la orientación humana MeCP2 ARNm (código: HS-MECP2-7HP SI02664893, Qiagen, Hilden, Alemania) fue proporcionado amablemente por el Prof. Chiariotti. células HCT116 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron de forma transitoria con el siRNA MeCP2 o oligos no específicos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). Para silenciar EZH2, un PSM2C vector retroviral que lleva un EZH2-shRNA (código: RHS1764-9100483, CN: V2HS-63033) codificado se utilizaron shRNAs o un vector vacío, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). En ambos casos, las células se recogieron para el análisis de transferencia de Western 56 hs después.
La pérdida de heterocigosidad,
BRAF
y
KRAS
mutaciones e inestabilidad de microsatélites análisis
Pérdida de heterocigosidad (LOH) se evaluó como se describió anteriormente, utilizando el D31259 marcadores de microsatélites y D3S3701, que flanquean
PPARG
[6]. Inestabilidad de microsatélites (MSI) se realizó según lo informado [17].
MLH1
promotor de la metilación también se evaluó en algunas muestras representativas del tumor [18].
BRAF
y
KRAS
mutaciones en el codón 600 en el exón 15 y los codones de 12/13 en el exón 2, respectivamente, fueron evaluados por PCR /secuenciación y Real-Time PCR utilizando cebadores descritos anteriormente [18 ].
el análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (versión 15.0) para Windows (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.). Asociación entre
PPARg
la metilación del promotor, otros marcadores y los parámetros clínico-patológicos se evaluó mediante la χ
2 test o la prueba de rangos de Spearman, tal como se indica. El método de Kaplan-Meier se utilizó para estimar la supervivencia; Se analizaron las diferencias en la supervivencia con la prueba de log-rank. Los datos se presentan como media ± desviación estándar y los valores medios se compararon mediante la prueba t de Student o la prueba de Mann-Whitney. Los resultados se consideraron estadísticamente significativas cuando un
P
se obtuvo ≤0.05.
Resultados
PPARg
promotor de la metilación en los CRC se correlaciona con la expresión de genes y se asocia con el resultado
de los pacientes a evaluar el papel que
PPARg
juega en la tumorigénesis colorrectal
in vivo
, se analizaron 152 CRC esporádicos primaria y la mucosa emparejado no neoplásico adyacente para
PPARg
expresión (Figura 1, panel A). Alrededor del 60% de los tumores mostró
PPARg
sobre-expresión y el 5% de los casos no mostró diferencias significativas entre los tejidos tumorales y la mucosa normal correspondiente. En contraste, el 35% de los tumores mostraron menores niveles de PPAR que la mucosa normal y una asociación significativa con metástasis a distancia y una menor supervivencia de los pacientes, de acuerdo con nuestros datos anteriores (Figura 1, paneles B y C) [9]. Ya hemos informado de que la reducción de
PPARg
expresión en esporádicos CRC no es asociada con LOH [6]. Por lo tanto, para determinar si
PPARG
reduce la expresión se correlaciona con la metilación del ADN, se examinó toda la región promotora. La inspección de la humana
PPARG
promotor mostró que la región del núcleo, -474 a 600 con respecto al sitio de inicio de la transcripción, se enriquece en particular en "islas CpG" que puede ser objetivo de la metilación del ADN (Figura 1 , el panel D). A rico en CpG tracto ADN más corto situado aguas arriba (-793 a -580) se ha encontrado de forma estable metilado en un estudio que evalúa el factor epigenético riesgo asociado con la aparición temprana de síndrome metabólico adulto (Figura 1, panel D) [19]. Para investigar si estas dos regiones están metiladas diferencialmente en CRCs primarios y mucosa normal emparejada, se realizó MS-PCR en cuatro segmentos del promotor (M1 a M4 a partir de la más aguas abajo) (Figura 1, panel D). Segmentos M4 (de -616-746 a la) y M1 (de -123 a la +49) siempre fueron metilado o no metilado en muestras normales y tumorales y no se correlacionaron con
PPARg
niveles de expresión (Figura 1, panel de E ). M2 (-235 a -151) fue variable metilado y, por último, M3 (-359 a -260) fue metilado en aproximadamente 30% de los tumores en comparación con el 8% de mucosas normales apareadas (n = 80) y se correlacionó con reducción /pérdida de
PPARg
expresión (Figura 1, panel e y Tabla 1). Una inspección más cercana del segmento M3 identificó 9 sitios CpG, el estado de metilación de las cuales se analizó por secuenciación de bisulfito (Figura 1, panel F). El nivel de islas CpG metilación fue significativamente mayor en
PPARg
-negativo de
PPARg
-positivas tumores y las mucosas normales emparejados (Figura 1, panel G). En consonancia, la metilación región M3 correlacionada con la edad del paciente, la invasión profunda, etapas C y D de Duke, mientras que ninguna asociación se detectó con la localización del tumor (proximal o distal del colon) y el género (Figura 1, panel H y Tabla 1).
PPARg
metilación se observó con mayor frecuencia en un subgrupo de los microsatélites de alta (MSI-H) que en los tumores de microsatélites estables (MSS). Por otra parte, estos casos no estaban relacionados con el
KRAS
o
BRAF
mutaciones (Figura S1). En conjunto estos resultados indican que
PPARg
la metilación del promotor, concretamente en la región M3, se correlaciona significativamente con la progresión tumoral y un peor pronóstico de los pacientes (Figura 1, panel I).
(A) Cincuenta mg de extractos de proteínas totales de los tejidos tumorales (T) y emparejado mucosa no neoplásica (N) se analizaron por Western blot. En el panel sólo se muestran algunas muestras representativas (1-8). El histograma informa la cuantificación de ß-actina, usado como control interno. (B) Correlación de
PPARg
niveles de expresión en la ausencia o presencia M0 = = M1 de metástasis a distancia. análisis de supervivencia (C) de Kaplan Meier relacionado con
PPARg
niveles de expresión. El
P
valor se informa en cada gráfica. (D) Estructura esquemática de la
PPARg
promotor y la identificación de las regiones enriquecidas con CpG que abarcan el sitio de inicio de la transcripción del gen humano. Las regiones MS-PCR analizados (M1-M4) y las posiciones de los cebadores utilizados se representan como rectángulos. (E) Representante MS-PCR muestran una correlación entre la metilación de la región M3 y reducido
PPARG
expresión en tejidos tumorales frente a mucosa normal correspondiente, C + indica controles metilados (M) y no metilados (U). Se ha informado (F) La secuencia de nucleótidos M3; las islas CpG están resaltados. Los cromatogramas muestran la cual dinucleótido CpG es metilado en algunas muestras representativas después de BS. círculos blancos o negros indican las citosinas metiladas o no metilados, respectivamente. niveles (G) de metilación detectadas por BS en el tumor y las muestras de mucosa normal. La región de metilación M3 está relacionada con la "etapa (Duque de la A a la D) (H) y los pacientes de tumor de supervivencia (I). El
valor de p
se informa en cada gráfica.
PPARg
silenciamiento en líneas celulares de CRC se correlaciona con la metilación del promotor
Para investigar los mecanismos moleculares mecanismo (s) subyacente a esta relación, hemos tratado de utilizar un
in vitro
sistema de cultivo celular in. Hemos examinado una serie de líneas celulares de CRC humanos (Tabla S2) de
PPARg
niveles de expresión y correlacionado con estos posibles eventos de silenciamiento. expresión de PPAR se investigó a nivel de mRNA y de proteínas por RT-PCR y análisis de western blot, respectivamente (Figura 2, panel A). PPAR mRNA refleja los niveles de proteína con una amplia gama de variaciones de las más altas de HT29 a las más bajas de células HCT116. Las diferencias detectadas fueron atribuidas a las variaciones de transcripción; una expresión de la proteína reducida no relacionada con los niveles de mRNA se observó sólo en células Caco-2, probablemente debido al mecanismo (s) después de la traducción. Entre estas líneas celulares, se seleccionaron HT29 y HCT116 para investigaciones posteriores. No se detectó la pérdida de heterozigosidad en el
PPARg
locus en ambas líneas celulares. Del mismo modo, no se correlacionaron los diferentes
PPARg
niveles observados en las células HCT116 y HT29 con modificaciones posteriores a la traducción causadas por una proteína quinasa activada por mitógenos activa (/ERK MAPK) (Figura S2) [6], [20]. Para investigar si
PPARg
expresión se correlaciona con la metilación del promotor en las líneas celulares de CRC, se realizó MS-PCR (Figura 2, panel B). Los segmentos M4 y M1 fueron establemente metilado o no metilado en todas las líneas celulares, independientemente de la expresión de PPAR. El segmento M2 fue metilado en 5 de 8 líneas celulares, incluyendo HCT116. Curiosamente, el segmento M3 fue metilado sólo en HCT116 de las ocho líneas celulares de CRC analizados (Figura 2, panel B). Mediante el examen de cuatro líneas adicionales de células CRC, se encontró que también las células RKO fueron negativos para
PPARg
expresión, por región aberrantemente metilados M3 (Tabla S2 y los datos no presentados). MeDIP ensayos confirmaron estos resultados: el
PPARg
ADN promotor (-368 a -166) fue tres veces más metilado en HCT116 que en las células HT29, lo que indica una estructura de la cromatina más apretada (Figura S2). 90% de los sitios CpG contenidos en el segmento M3 se metilado en HCT116, mientras que sólo pocos o ninguno se metilado en otras líneas celulares como se evaluó mediante secuenciación de bisulfito (Figura 2, panel C). Estos hallazgos sugieren que la metilación del promotor podría desempeñar un papel en silenciar
PPARg
expresión en las líneas celulares analizadas CRC.
(A)
PPARg
niveles de mRNA y proteína detectada por RT Western blot ad-PCR en un panel de ocho líneas celulares de CRC.
GAPDH Opiniones y β-actina se utilizaron como controles, respectivamente. (B) los resultados de MS-PCR obtenidos en las regiones promotoras M1-M4 analizados; M, metilada; U, no metilada; C + indica controles metilados y no metilados. El estado de metilación de todas las líneas celulares de CRC analizados se resume, con las células HCT116 y HT29 representadas en gris. (C) CpG dinucleótidos metilación fue evaluada por BS. Se presentan los resultados de algunas líneas celulares representativas. dinucleótidos CpG metilados o no metilados se representan como círculos negros o blancos, respectivamente. (D) desmetilación farmacológica inducida
PPARg
expresión en HCT116 mientras que no se encontraron diferencias significativas en las células HT29 utilizados como control. Las células fueron expuestas a 1 y 5 micras AZA durante 72 hs, MS-PCR se llevó a cabo en las regiones M2 y M3, antes y después del tratamiento, **
P
. & Lt; 0,01
PPARg
expresión se reactiva por desmetilación farmacológico
Para verificar si
PPARg
expresión se puede volver a activarse por desmetilación farmacológico, se trataron las células HCT116 con AZA , un inhibidor bien conocido de la metilación del ADN. análisis RT-PCR a partir de HCT116 expuesto a 1 y 5 mM AZA mostró un aumento dependiente de la dosis del ARNm de PPAR mientras que no mostró variaciones significativas en las células HT29, como se esperaba (Figura 2, panel D). MS-PCR a cabo en la región M3, que se metila sólo en las células HCT116, mostró pérdida de metilación después del tratamiento; la región M2, que en condiciones basales está metilado en ambas líneas celulares, consiguió desmetilado después del tratamiento (Figura 2, panel D). Todos juntos estos datos demuestran que la metilación del promotor extensa se asocia con una reducción
PPARg
expresión en líneas celulares de CRC.
efecto Cooperativa de AZA y la TSA en
PPARg
re- la activación
eso regiones específicas del
PPARg
promotor son diferencialmente metiladas puntos fuera de ese mecanismo (s) epigenéticos están implicados en su expresión desregulada en las células de CRC. Para verificar esta hipótesis, se trataron HCT116 con AZA, solo o en combinación con TSA, un conocido inhibidor de la histona desacetilasa (HDACi). Se utilizaron células HT29 como control.
PPARG
expresión se indujo sinérgicamente por el tratamiento combinado con AZA y TSA en las células HCT116 mientras que no se vio afectada en las células HT29, cuando se utilizaron los fármacos ya sea solo o en combinación (Figura S3). Estos datos indican que las enzimas histonas asociadas a la cromatina pueden contribuir al silenciamiento de genes. Para determinar si el re-activado PPAR se comporta como un
bona fide
factor de transcripción funcional, se trataron las células HCT116 con AZA o TSA solo o en combinación y, posteriormente transfectadas con un gen indicador de luciferasa PPRE-conducido. La actividad de luciferasa se determina en extractos de células aumentó en AZA y /o tratamiento TSA y, sorprendentemente, aún más después de la adición de troglitazona, un ligando PPAR específica (Figura S3). Para demostrar que el aumento de la actividad de la luciferasa fue realmente depende del receptor re-activado, se expusieron las células transfectadas con el antagonista de PPAR, GW9662. Se observó una reducción significativa de la actividad del gen indicador debido a la capacidad GW9662 para interferir de forma irreversible con la capacidad de transactivación de la proteína madura (Figura S3). En conjunto, estos datos muestran que el promotor de metilación del ADN y las histonas modificaciones probable que cooperan para regular a la baja
PPARg
expresión, lo que sugiere que los tratamientos epigenéticos re-establecer la transcripción y la actividad de los genes.
cromatina represora específica marcas y la metilación del ADN están asociados con
PPARg
transcripción
Para ayudar a comprender el mecanismo (s) por el cual la metilación del ADN y las histonas modificaciones afectan a
PPARg
de expresión, ensayos de chip cuantitativos se llevaron a cabo la investigación de la segmento del promotor que se extiende desde -368 hasta -166 en células HCT116. En consonancia con los datos MeDIP, HDAC1 fue fuertemente unido a
PPARG
promotor, mientras RNA-polimerasa II (RNAPol-II) y su forma fosforilada (P-RNAPol-II) eran apenas presente en las células HCT116 no tratados (Figura 3, panel A). Tras la exposición a AZA y TSA en combinación, HDAC1 se agota notablemente junto con una reducción de la metilación del ADN (Figura S2), mientras que RNAPol-II y P-RNAPol-II se han mejorado en gran medida, lo que indica la recuperación de la transcripción (Figura 3, panel A). En consecuencia, trimetilada H3K4 y H3K9 acetilado, que son modificaciones de las histonas que normalmente se asocian con la actividad transcripcional, fueron casi reducida en las células HCT116 tratadas y no aumentó significativamente con TSA, AZA o su combinación (Figura 3, panel B). Es de destacar que H3K9 trimethylated, un marcador de la cromatina silenciada, se enriqueció en el
PPARg
promotor y progresivamente agotado después de los tratamientos epigenéticos, mientras trimetilada H3K27 se redujo significativamente sólo por el tratamiento combinado AZA /TSA (Figura 3, panel DO). Este análisis sugiere que la metilación del ADN está estrechamente relacionada con las marcas de la cromatina represivas en el
PPARg
promotor para afectar la expresión génica en células de CRC.
(A) Se realizó un análisis cuantitativo de chip en las células HCT116 antes y después del tratamiento con AZA y TSA solo o en combinación. nativo de cromatina se incubó con anticuerpos dirigidos contra las proteínas indicadas. Se utilizó el ADN inmunoprecipitado como molde en reacciones de qPCR utilizando cebadores específicos para el
PPARg
región promotora *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01. (B) los ensayos de chip se llevaron a cabo como se describe anteriormente en contra acetilado H3K9 y H3K4 trimethylated *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 o (C) trimethylated H3K9 y H3K27 *
P Hotel & lt; 0,05. Los puntos de tiempo para los compañeros de tratamientos fueron 72 hs para 5 M AZA y 24 hs de 300 nM TSA, solo o en combinación; CC indica células control sin tratar. Los resultados son los valores medios ± desviación estándar de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado.
mediada por siRNA knock-down de MeCP2 y EZH2 rescates
PPARg
expresión en células de cáncer de colon HCT116
El vínculo entre la metilación del ADN y modificaciones de las histonas parece estar mediada por un grupo de proteínas con actividad de unión a ADN de metilo que incluya proteínas metil CpG de unión 2 (MeCP2) [14]. Estas proteínas se localizan en regiones promotoras metilados y reclutan complejos de proteínas que contienen HDACs, especialmente HDAC1, y methyltransferases histonas (HMTs). Potenciador de zeste 2 (EZH2) es un miembro del represor polycomb complejo 2 (PRC2) con actividad de metil transferasa de histonas en sitios H3K27 específicos [21]. Tanto MeCP2 y EZH2 han informado a participar en
PPARg
represión en las células estrelladas de ratones sometidos a la fibrogénesis hepática [22].