Extracto
Antecedentes y objetivos
Para identificar y validar biomarcadores de N-glucano en el cáncer gástrico (CG ) y para dilucidar su mecanismo molecular subyacente de la acción.
Métodos
En total, 347 personas, incluyendo pacientes con GC (cáncer gástrico) o gastritis atrófica y controles sanos, fueron divididos aleatoriamente en una grupo de entrenamiento (n = 287) y un grupo de validación retrospectiva (n = 60). Suero de perfiles de N-glicanos se logró con asistencia del secuenciador de ADN /fluoróforo asistida por electroforesis en hidratos de carbono (DSA-FACE). Dos modelos de diagnóstico se construyeron en base a los perfiles de N-glucano usando regresión paso a paso logística. El rendimiento diagnóstico de cada modelo se evaluó en retrospectiva, prospectivo (n = 60), y el seguimiento (n = 40) cohortes. Blot lectina se realizó para determinar núcleo-fucosilación total y la expresión de genes implicados en el núcleo fucosilación en GC se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa.
Resultados
Se identificaron al menos 9 estructuras de N-glucano (picos) y los niveles de residuos de fucosa de núcleo y fucosiltransferasa se redujeron significativamente en GC. Dos modelos de diagnóstico, designado GCglycoA y GCglycoB, se construyeron para diferenciar GC de control y gastritis atrófica. Las áreas bajo las curvas ROC (ROC) (AUC) tanto para GCglycoA y GCglycoB eran superiores a las de CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4. En comparación con CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, la sensibilidad de GCglycoA aumentó 29,66%, 37,28%, 56,78% y 61,86%, respectivamente, y la exactitud aumentó 10,62%, 16,82%, 25,67% y 28,76%, respectivamente . Para GCglycoB, la sensibilidad aumentó 27,97%, 35,59%, 55,09% y 60,17% y la precisión aumentó 21,26%, 24,64%, 31,40% y 34,30% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente. Después de la cirugía curativa, el núcleo fucosilado pico (pico 3) y el total del núcleo fucosilado N-glicanos (sumfuc) se invierte.
Conclusiones
Los resultados indicaron que los modelos de diagnóstico basados en N- marcadores de glicanos son alternativas valiosas y no invasivos para la identificación de GC. Llegamos a la conclusión de que la disminución de núcleo-fucosilación tanto en tejidos y suero de pacientes con cáncer gástrico puede ser consecuencia de la disminución de expresión de fucosiltransferasa
Visto:. Liu L, B Yan, Huang J, Q Gu, Wang L, Fang M, et al. (2013) La identificación y caracterización de biomarcadores-glucano-basados N Novel en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (10): e77821. doi: 10.1371 /journal.pone.0077821
Editor: Rakesh K. Srivastava, la universidad del centro médico de Kansas, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de mayo de 2013; Aceptado: 4 Septiembre 2013; Publicado: 17 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 81102693 y 81102565). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más frecuente y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer, con una incidencia de aproximadamente 930.000; anualmente, es responsable de más de 700.000 muertes en todo el mundo, y la tasa de supervivencia a cinco años es del 20-30% [1]. Para los pacientes con GC, la supervivencia es dictado por el estadio patológico de la enfermedad en el momento del diagnóstico. Desafortunadamente, los síntomas comunes de la GC no son específicos de la enfermedad, y GC etapa temprana no pueden causar síntomas perceptibles. A pesar del creciente conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la transformación maligna y metástasis, la tasa de supervivencia global de los pacientes con GC no ha mejorado significativamente. Varias moléculas se han recomendado como biomarcadores GC, incluyendo el antígeno carcinoembrionario (CEA) para la vigilancia postoperatoria, antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9), antígeno carbohidrato 125 (CA125) y antígeno carbohidrato 72-4 (CA72-4) [2- 6]. Sin embargo, ninguno de estos marcadores tumorales ha demostrado suficiente sensibilidad o especificidad para el diagnóstico de GC en una fase temprana. Alternativamente, gastroscopia aumenta la tasa de diagnósticos definitivos, pero el valor diagnóstico de la gastroscopia se ve limitada por los costos, riesgos y molestias. Por lo tanto, existe una necesidad urgente para el desarrollo de biomarcadores no invasivos que permiten la detección temprana de GC.
La evidencia creciente sugiere que la alteración de los glicanos N-ligados podría ser considerado como un potencial de biomarcadores para el diagnóstico del cáncer. Estudios previos observaron unos cambios significativos de glicano N-ligados en diferentes tipos de cáncer y líneas celulares de cáncer que incluye cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de hígado [7-11]. Un análisis adicional en GC también descubrió que el libre de tipo complejo de N-glucanos acumulan en las líneas celulares MKN7 y MKN45 [12]. Sin embargo, la fluctuación y variación de glicanos N-ligados en pacientes GC aún no se conocen.
En nuestros estudios anteriores utilizando electroforesis de ADN secuenciador asistida /fluoróforo asistida capilar (DSA-FACE), hemos demostrado que una ramificación α-1,3-fucosilados triantenario glicano y un glicano biantenarios fueron altamente específico y sensible candidatos biomarcadores HCC [13]. En el presente estudio, hemos utilizado DSA-FACE de manera retrospectiva suero perfil de N-glicanos en muestras de pacientes con GC o gastritis atrófica y de individuos sanos. Se caracterizaron los marcadores identificados GC de N-glucano con curvas características de funcionamiento (ROC) y validado los marcadores en cohortes prospectivas y de seguimiento. Nuestro objetivo fue identificar un biomarcador prometedor para la predicción y la detección de GC con una mejor especificidad y sensibilidad
Materiales y Métodos
1.1:. Cohorte retrospectivo
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de china de Recursos Humanos de la Segunda Universidad médica Militar. escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes y los controles sanos.
En total, 247 pacientes con GC (n = 138) o gastritis atrófica (n = 109) fueron reclutados entre 2010 y 2012. Los diagnósticos para todos los pacientes que participaron fueron confirmados histopatológicamente por 2 patólogos del hospital Changhai, Segunda Universidad médica Militar (Shanghai, china). En el grupo control, 128 voluntarios sanos por edad y sexo (sin enfermedad) se inscribieron durante el mismo período de tiempo. La edad media y la distribución por sexos fueron agrupados en los 3 grupos. Un resumen de los datos del paciente se proporciona en la Tabla 1. Los pacientes con cáncer gástrico que recibieron radioterapia preoperatoria, quimioterapia o quimiorradioterapia fueron excluidos del estudio.
Media ± SD o No. (%)
típico
control (n = 128)
gastritis atrófica (n = 109)
GC (n = 138) Edad
, y50.10 ± ± 5.9552.11 6.2951.01 ± 6.01Men75 (58.59) 60 ( 55.05) 70 (50.72) positivo para CEA 5 (3,91) 23 (21.10) 62 (44.93) CA19-9-positivo 11 (8,59) 20 (18.35) 53 (38.41) CA125-7 positiva (5,47) 10 (9,17) 28 (20.29) CA72-4-8 positivo (6,25) 12 (11.01) 22 (15.94) TNM stageI22 (15.94) II28 (20.29) III63 (45.65) IV25 (18.12) Tabla 1. Características del grupo de entrenamiento.
abreviaciones GC, carcinoma gástrico; SD, desviación estándar. Descargar CSV CSV
Un total de 60 pacientes (20 en cada grupo) fueron seleccionados al azar a partir de los 3 grupos descritos anteriormente para su comprobación a posteriori; el resto de pacientes (n = 315) fueron incluidos en el conjunto de entrenamiento para construir el modelo de diagnóstico. Durante los 2 años del estudio, 40 de los 138 pacientes con GC en el grupo de entrenamiento fueron controlados antes y después de la cirugía curativa, según la disponibilidad. El grupo de entrenamiento incluyó 118 pacientes con GC, 89 pacientes con gastritis atrófica, y 108 controles sanos.
Los datos clínicos para todos los participantes y de laboratorio se obtuvieron de los registros médicos clínicos, informes de patología, y entrevistas personales. Los datos recogidos incluyen el sexo, la edad y características de cáncer gástrico (tales como la localización del tumor, el grado histológico, la profundidad de invasión y metástasis en los ganglios linfáticos). Se obtuvieron muestras de suero antes de resecciones quirúrgicas; estas muestras se recogieron a partir de sangre entera usando un protocolo estándar, se centrifugaron a 10.000 xg durante 20 minutos, y se almacenaron a -80 ° C. progresión de la enfermedad en los pacientes con cáncer gástrico se clasificó de acuerdo a la séptima edición de The American Joint Committee [14]: 20 pacientes (16.95%) tenían enfermedad en estadio I, 25 (21,17%) había enfermedad en estadio II, 54 (45,76%) en estadio III de la enfermedad, y 19 (16,10%) tenían enfermedad en estadio IV
1.2:. cohortes prospectivo
Para evaluar el valor predictivo de los modelos establecidos en el estudio retrospectivo se ha descrito anteriormente, de forma prospectiva la descripción de un cohorte adicional (n = 60) de los pacientes con GC (n = 20) o gastritis atrófica (n = 20) y de individuos sanos (n = 20) a partir de mayo 2012 a noviembre 2012 en el mismo hospital. Los procedimientos y estrategias fueron los mismos que los descritos anteriormente
1.3:. Muestras de tejidos
muestras de tejido se obtuvieron a partir de 20 de los 138 pacientes de GC; 2 rebanadas, un tumor y una muestra de tejido adyacente, se tomaron. Las muestras de tejido (aproximadamente 1 cm
3) se congelaron inmediatamente a -80 ° C y se sometieron a revertir la reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa (RT-PCR) y transferencia de lectina. Todos los tejidos se utilizan de acuerdo con el Reglamento de la Junta de Revisión Institucional de la Segunda Universidad Médica Militar
1.4:. Detección de rutina de los marcadores tumorales
ensayos de rutina de marcadores tumorales se realizaron utilizando métodos y reactivos estándar . los niveles de CEA y CA19-9 se determinaron en un Abbott I2000, y los niveles de CA72-4 y CA125 se midieron usando un Roche Cobas E601. Los niveles de corte recomendados por el fabricante para CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4 fueron 5.0 mg /L, 39 U /L, 40 U /ml y 9,8 U /ml, respectivamente. Los ensayos se realizaron en el Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Changhai, la Segunda Universidad Médica Militar, Shanghai
1.5:. Perfiles de proteínas de suero de N-glicanos
se realizaron
El análisis de sueros de proteína de N-glucano como se describe anteriormente [13]. Brevemente, los N-glicanos en 2 l de suero fueron liberados de las proteínas con péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) (New England Biolabs, Boston, MA) marcado con ácido 8-aminonaphtalene-1,3,6-trisulfónico (Invitrogen, Carlsbad, CA). El ácido siálico se eliminó utilizando
ureafaciens Arthrobacter
sialidasa (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), y las muestras procesadas se analizaron utilizando la tecnología DSA-cara en un ABI3130 analizador genético basado en la electroforesis capilar (Applied Biosystems, Foster City , CA). Las 9 picos más altos que se detectaron en todas las muestras (que representan & gt; 90% de los del suero total de N-glicanos) se analizaron usando GeneMapper (Applied Biosystems). Cada estructura de N-glicanos se describe numéricamente por la normalización de su altura a la suma de las alturas de todos los picos, y analiza estos datos utilizando el software estadístico (SPSS Inc., Chicago, IL) SPSS 18.0.
1.6 : la extracción de proteínas de tejidos y la lectina secante
Los tejidos se homogeneizaron usando un mortero y mano de mortero y se resuspendieron en tampón de lisis que contiene un cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Meylan, Francia). La fracción no lisadas se eliminaron por centrifugación (dos veces a 12000xg durante 10 minutos a 4 ° C). La concentración de proteína soluble se determinó usando el ensayo BioRad (BioRad, Marnes-la-Coquette, Francia), y las muestras se almacenaron a -80 ° C.
En total, 25 g de proteína de suero o 50 g de proteína extraído de tejido congelado se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10%. Los geles se tiñeron con CBB G250, o las proteínas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Whatman /Schleicher & amp; Schuell, Versailles, Francia) para detectar las proteínas del núcleo fucosilado. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C con 5% de albúmina de suero bovino en solución salina tamponada con Tris (TBS: NaCl 140 mM y Tris-HCl 10 mM) y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 5 mg /ml de lente biotinilado culinaris aglutinina a (LCA) (vector Laboratories, Burlingame, CA) en TBS que contiene 0,05% de Tween-20 (TBST). Después de 4 lavados de 10 minutos cada uno con TBST, las membranas se incubaron con IRDye 800CW estreptavidina (1: 10.000; LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó 4 veces con TBST, y desarrollado utilizando el Odyssey Sistema de imágenes por infrarrojos (LI-COR Biosciences). albúmina purificada (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó como control negativo para el blot lectina
1.7:. extracción de ARN total a partir de tejido y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN se extrajo a partir de tejidos congelados utilizando un kit Qiagen RNeasy mini de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania). La pureza y la concentración del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). El ADNc se sintetizó a partir de 2 g de ARN total usando un reactivo de transcripción inversa (Toyobo, Osaka, Japón). Los cebadores fueron diseñados utilizando Primer Express (Applied Biosystems), y las secuencias se presentan en la Tabla 2.
génica
Cebador (5'-3 '): perfil del cebador inverso (5'-3')
Fut85'CCTGGCGTTGGATTATGCTCA 3'5'CCCTGATCAATAGGGCCTTCT 3'GDP-Tr5'CTGCCTCAAGTACGTCGGTG 3'5'CCGATGATGATACCGCAGGTG 3'GAPDH5'ATGGGGAAGGTGAAGGTCG 3'5'GGGGTCATTGATGGCAACAATA 3'Table 2. polimerasa de cebadores reacción en cadena de secuencias de pares de
Abreviaturas:. Un , adenosina; C, citidina; G, guanosina; T, timidina; Fut8, fucosiltransferasa; PIB-Tr, guanosina transportador difosfato-fucosa CSV Descargar CSV
Los ADNc fueron amplificados en un 7300 máquina de PCR de Applied Biosystems en tiempo real en un volumen de reacción total de 20 l que contenía 10 l de 2X mezcla rápida SYBR Green Master (Applied Biosystems, incluye ADN Fast-Start Taq tampón de reacción de la polimerasa), la mezcla de desoxinucleótido trifosfato (incluyendo trifosfato de desoxiuridina, tinte SYBR Green I, y MgCl2), y 2 l de los cebadores para cada gen (a una concentración final de 0,5 μΜ cada uno) . Cada reacción se realizó por triplicado. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron las siguientes: desnaturalización a 95 ° C durante 5 minutos seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 59 ° C o 55 ° C durante 15 segundos, y 72 ° C durante 45 segundos
.
la expresión relativa de α-1,6-fucosiltransferasa (Fut8) y difosfato de guanosina (GDP) transportador -fucose (PIB-fuc-Tr) en cada muestra se normalizó a la expresión del gen GAPDH limpieza restando el umbral ciclo (Ct) de GAPDH de la de Fut8 o GDP-Tr (Ct). La diferencia de plegado se calculó restando el Ct de la muestra de prueba de la de la muestra de control para obtener el ΔΔCt y, posteriormente, el 2 ^ -ΔΔCt. Los valores de ciclo umbral más allá de 40 ciclos se consideraron por debajo del nivel detectable. Se obtuvieron curvas de fundir para cada reacción de garantizar que un solo producto se amplificó
1.8:. El análisis estadístico
Todas las variables cuantitativas se expresan como la media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. Las variables cuantitativas se compararon mediante la prueba t de Student, análisis de varianza, o pruebas no paramétricas. los coeficientes de correlación de Pearson y las probabilidades asociadas (P) se utilizaron para evaluar las correlaciones entre los parámetros; los coeficientes de correlación de Spearman se calcularon para las variables categóricas ordinales. Se identificaron biomarcadores novedosos glicanos y caracterizado basan en un análisis de regresión logística paso a paso. El rendimiento diagnóstico de biomarcadores individuales y de los modelos de diagnóstico se evaluó mediante análisis de la curva ROC. La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN), y la precisión se calcularon utilizando los valores óptimos de corte seleccionados de las curvas ROC. Todos los valores de p comunicados son de 2 colas, y los valores & lt; P 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 18.0 para Windows (SPSS Inc.)
Resultados
. 2.1: Diferentes perfiles de N-glicanos en pacientes con GC o gastritis atrófica y en controles sanos
Utilizando la tecnología DSA-FACE, se examinaron los perfiles de N-glicanos en pacientes con GC (n = 118) o gastritis atrófica (n = 89) y en individuos sanos (n = 108). Se cuantificaron y compararon estadísticamente los picos en los 3 grupos. Al menos 9 estructuras de N-glucano (picos) se identificaron en todas las muestras (Figura 1).
Al menos 9 picos pueden ser identificados. Los picos 1, 2, 5 y 9 aumento (flechas rojas), y los picos 3, 6 y 7 se redujeron (flechas verdes) en el carcinoma gástrico en comparación con los controles normales. Las estructuras de los picos de N-glicano se muestran debajo del gráfico. Los círculos abiertos indican b ligada galactosa; los triángulos, a /b-1,3 /6-fucosa ligados; y los círculos sólidos, una manosa /b-linked.
Callewaert et al y Liu et al publicaron previamente un análisis estructural de estos N-glicanos [15,16]. La abundancia relativa media de estas estructuras de N-glucano se presenta en la Tabla 3. La abundancia de las estructuras en los picos 1, 2, 3, 5, 6, 7, y 9 fue significativamente diferente en el GC, gastritis atrófica, y el control sano grupos, lo que indica la existencia de diferentes patrones de N-glicanos en diversas condiciones fisiopatológicas. En comparación con el grupo de control sano, los picos 1, 2, 5 y 9 se aumentaron (P & lt; 0,05) y los picos 3, 6, y 7 se redujeron en el grupo GC (P & lt; 0,001). La abundancia de las estructuras en los picos 3, 5, 6, 7, y 9 fue significativamente diferente en el grupo GC en comparación con el grupo de gastritis atrófica (Figura 2).
Medios ± SD
variable
de control (n = 128)
gastritis atrófica (n = 108)
GC (n = 138)
F
P
Edad, años
a50.10 ± ± 5.9552.11 6.2951.01 ± 6.010.270.766Peak 1
a6.96 ± ± 1.677.64 2.028.20 ± 2.7510.09 & lt; 0.001Peak 2
a1.09 ± 0.341.20 0.381.31 ± ± 0.493.120.045Peak 3
a6.28 ± ± 1.636.47 1.385.76 ± 1.2810.48 & lt; 0.001Peak 4
a5.76 ± 0.935.61 0.815.75 ± ± 0.821.120.327Peak 5
a40.02 ± ± 3.7539.60 3.7642.16 ± 4.3314.94 & lt; 0.001Peak 6
a21.40 ± ± 2.6120.51 2.8516.99 ± 2.9888.36 & lt; 0.001Peak 7
a5.87 ± 1.416.02 1.715.21 ± ± 1.2111.15 & lt; 0.001Peak 8
a7.94 ± 1.587.59 2.247.46 ± ± 1.822.240.108Peak 9
a2.33±0.922.59±1.554.00±1.7748.12<0.001sumfuc
ab47.37±4.4047.47±5.3043.21±5.9427.01<0.001Table 3. perfilado N-glicanos mediante electroforesis capilar secuenciador de ADN asistida /fluoróforo asistida
Abreviaturas:. GC, carcinoma gástrico; SD, desviación estándar.
a análisis de varianza
b Sumfuc representa la abundancia total de estructuras fucosiladas-α-1,6 (la suma de los picos 1, 2, 3, 4, 6, y 7). Descargar CSV CSV
En el grupo de cáncer gástrico (CG), los niveles (representados como los intervalos de confianza del 95% [IC]) de agalacto, núcleo-α-1,6-glucano fucosilada biantenario (NGA2F, pico 1), sin núcleo α-1,6-fucosilado bisectriz glicanos biantenarios (NGA2FB, peak2) y la ramificación alfa-1,3-fucosilados triantennaries (NA3FB, 9 pico) fueron elevados modestamente (P & lt; 0,05) y los de bigalacto núcleo-α-1,6 glicanos biantenarios -fucosylated (NA2F, pico 6) se redujeron
. 2.2: Construcción y evaluación de un modelo de diagnóstico basado en marcadores de N-glicanos para diferenciar pacientes con cáncer gástrico de los controles sanos
Se evaluaron las alteraciones N-glicanos relacionados GC-basados en un análisis de regresión logística. Coeficientes de regresión logística se utilizaron para estimar los odds ratios para cada una de las variables independientes. La fórmula matemática GCglycoA se construyó para diferenciar los pacientes con cáncer gástrico de los controles sanos (GCglycoA = -1,072 + 0,957 * * peak4-0.331 peak6 + 0,646 * peak9). Para evaluar la capacidad de GCglycoA, CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4 para discriminar pacientes con cáncer gástrico, que caracteriza el área bajo la curva ROC (AUC). En comparación con el CEA (AUC = 0,74), CA 19-9 (AUC = 0,76), CA125 (AUC = 0,72) y CA72-4 (AUC = 0,67), GCglycoA más eficazmente a los pacientes GC distinguidos de los controles normales (AUC = 0,88) en el grupo de entrenamiento (Figura 3A). La Tabla 4 enumera la sensibilidad, especificidad, VPP, VPN, y la precisión de la predicción de GC por el CEA, CA19-9, CA125, CA72-4 y GCglycoA. CEA en el valor recomendado de 5,0 ng /ml tuvo una sensibilidad del 45,76%, 37 U /ml CA19-9 tuvo una sensibilidad del 38,14%, 40 U /ml CA125 tuvo una sensibilidad del 18,64%, y 9,8 U /ml CA72- 4 tenían una sensibilidad del 13,56%. Se ha seleccionado un valor de corte óptimo de -0,772 para GCglycoA basado en el análisis de la curva ROC. En este valor de corte, GCglycoA tuvo una sensibilidad del 75,42%, que es un aumento de la sensibilidad de 29,66%, 37,28%, 56,78% y 61,86% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente. La precisión diagnóstica de GCglycoA en la diferenciación de pacientes con cáncer gástrico de los controles sanos aumentó en un 10,62%, 16,82%, 25,67% y 28,76% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente. Cuando el modelo se aplicó al grupo de validación retrospectiva, la sensibilidad aumentó 45,00%, 45,00%, 55,00% y 55,00% y la precisión aumentó 15,00%, 17,50%, 20,00% y 20,00% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente (Tabla 5).
(a) El análisis ROC para distinguir entre GC y el control de los sujetos utilizando un GC marcador a base de modelo de diagnóstico de N-glicanos (GCglycoA), CEA, CA 19-9, CA125 o CA72-4. Las áreas bajo la curva ROC (AUC) indican el poder de diagnóstico: CEA (0,74), CA 19-9 (0,76), CA125 (0,72), CA72-4 (0,67) y GCglycoA (0,88). El modelo de diagnóstico se construyó utilizando adelante análisis de regresión logística:
GCglycoA = -1,072 + + 0.957peak4-0.331peak6 0.646peak9. (B) El análisis ROC para distinguir entre GC y gastritis atrófica mediante el modelo de diagnóstico GCglycoB, CEA, CA19-9, CA125 o CA72-4. Las AUC indican el poder de diagnóstico: GCglycoB (0,82), CEA (0,65), CA 19-9 (0.63), CA125 (0,69) y CA72-4 (0,64). El modelo de diagnóstico se construyó mediante el uso de análisis de regresión logística por pasos hacia adelante:. GCglycoB = 5.273-1.371peak2 + + 0.781peak4-0.453peak6 0.221peak9
valor de corte
Estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
Sensibilidad, especificidad
%,%
PPV, NPV
%,%
Precisión,%
CEA (5 ng /ml) GC + 54545.7695.3791.5361.6869.47GC-64103CA19-9 (37 U /ml) GC + 451038.1490.7481.8257.3163.27GC-7398CA125 (40 U /ml) GC + 22718.6493.5275.8651.2754.42GC-96101CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 16813.5692.5966.6749.5151.33GC-102100GCglycoA (-0.77) GC + 891675.4285.1984.7676.0380.09GC-2992Table 4. El poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de los controles en el Grupo de Formación
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoA, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo A; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV valor de corte
Estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
sensibilidad,%
La especificidad,
% PPV, NPV%
,
% Precisión,%
CEA (/ml a 5 ng) GC + 8040.00100.00100.0062.5070.00GC-1220CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8140.0095.0088.8961.2967.50GC-1219CA125 (40 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420GCglycoA (-0.77) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 5. el poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de los controles en el Grupo de Verificación retrospectivo
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoA, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo A; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV
La evaluación prospectiva indica que la sensibilidad mejoró 65.00%, 65.00%, 85.00% y 80.00% y la precisión mejorada 30,00%, 27,50%, 37,50% y 37,50% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente (Tabla 6).
valor de corte
Estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
sensibilidad,%
La especificidad,
% PPV, NPV%
,
% Precisión,%
CEA (/ml a 5 ng) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.50GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6030.00100.00100.0058.8265.00GC-1420CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoA -0.77GC + 19295,0090 .0090.4894.7492.50GC-118Table 6. el poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de los controles en el Grupo de Verificación prospectivo
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoA, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo A; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV
2.3: Construcción y evaluación de un modelo de diagnóstico para diferenciar el cáncer gástrico de la gastritis atrófica
El uso de un modelo de regresión logística, se creó otro modelo de diagnóstico (GCglycoB) para diferenciar entre GC y gastritis atrófica: GCglycoB = 5,273-1,371 * peak2 + 0,781 * * peak4-0.453 peak6 + 0,221 * peak9. Se seleccionó el valor de corte óptimo para GCglycoB (0.594) basado en el análisis de la curva ROC. En el grupo de entrenamiento, el AUC para GCglycoB fue de 0,82, mientras que las AUC para CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4 fueron 0,65, 0,63, 0,69 y 0,64, respectivamente (Figura 3B). La precisión diagnóstica de GCglycoB en la diferenciación de GC de gastritis atrófica aumentó 21,26%, 24,64%, 31,40% y 34,30%, y la sensibilidad aumentó 27,97%, 35,59%, 55,09% y 60,17% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72- 4, respectivamente (Tabla 7). En el grupo de validación, la exactitud 85.00% de GCglycoB representó un incremento de 40.00%, 45.00%, 65.00% y 55.00% y la sensibilidad 85.00% indicaba un aumento del 22,50%, 22,50%, 30,00% y 30,00% en comparación con el CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente (Tabla 8). valor de corte
estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
Sensibilidad, especificidad
%,%
PPV, NPV%
,
% Precisión,%
CEA (/ml a 5 ng) GC + 541945.7678.6573.9752.2459.90GC-6470CA19-9 (37 U /ml) GC + 451738.1480.9072.5849.6656.52GC-7372CA125 (40 U /ml) GC + 22818.6491.0173.3345.7649.76GC-9681CA72-4 (9,8 U /mL ) GC + 16813.5691.0166.6744.2646.86GC-10281GCglycoB (0.594) GC + 88873.7391.0191.5872.3281.16GC-3081Table 7. el poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de la gastritis atrófica en el Grupo de Formación
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoB, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo B; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV valor de corte
Estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
sensibilidad,%
La especificidad,
% PPV, NPV%
,
% Precisión,%
CEA (/ml a 5 ng) GC + 9445.0080.0069.2359.2662.50GC-1116CA19-9 (37 U /ml ) GC + 8340.0085.0072.7358.6262.50GC-1217CA125 (40 U /ml) GC + 4220.0090.0066.6752.9455.00GC-1618CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 6430.0080.0060.0053.3355.00GC-1416GCglycoB (0.594) GC + 17385.0085.0085.0085.0085.00GC-317Table 8. el poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de la gastritis atrófica en el Grupo de Verificación retrospectivo
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoB, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo B; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV
En el grupo prospectivo, GCglycoB fue más preciso (85,00% frente a 30,00%, 30,00%, 10,00% y 15,00%) y sensible (90,00% frente a 62,50%, 62,50%, 55,00% y 55,00% ) de CEA, CA19-9, CA125 y CA72-4, respectivamente (Tabla 9).
valor de corte
Estado actual, Nº de sujetos
prueba
GC +
GC-
sensibilidad,%
La especificidad,
% PPV, NPV%
,
% Precisión,%
CEA (/ml a 5 ng) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA19-9 (37 U /ml ) GC + 6130.0095.0085.7157.5862.5GC-1419CA125 (40 U /ml) GC + 2010.00100.00100.0052.6355.00GC-1820CA72-4 (9,8 U /ml) GC + 3115.0095.0075.0052.7855.00GC-1719GCglycoB (0.594) GC + 17185.0095.0094.4486.3690.00GC-319Table 9. el poder de diagnóstico para la diferenciación de carcinoma gástrico de la gastritis atrófica en el Grupo de Verificación prospectivo
Abreviaturas:. + positivo; - Negativo; GC, carcinoma gástrico; GCglycoB, N-glicanos en base a marcadores de diagnóstico de cáncer gástrico modelo B; VAN, valor predictivo negativo; Canales de pago, valor predictivo positivo. Descargar CSV CSV
2.4: Disminución de los niveles de proteínas totales del núcleo fucosilado en el cáncer gástrico
El nivel total de centrales α-1,6-fucosa residuos (la suma de los picos 1, 2, 3, 4 , 6, y 7) fue significativamente inferior (P & lt; 0,001; Tabla 2) en pacientes GC que en los pacientes gastritis atrófica y los controles normales. Para confirmar este hallazgo, se evaluó la concentración de proteínas del núcleo fucosilado en el suero y en el tejido de los pacientes con GC usando LCA porque reconoce específicamente glicoproteínas con α-1,6-N-acetil-D-glucosamina-asparagina fucosilado (GlcNAc- Asp) en el núcleo trimanosilo. En el suero, hubo un menor número de residuos de fucosa de núcleo de unión de LCA-en el grupo GC que en la gastritis atrófica y grupos normales (Figura 4A). La abundancia total del núcleo fucosa fue menor en los tumores de GC que en el tejido adyacente emparejado (Figura 4B). Para determinar si el cambio en fucosilación total del núcleo en los tumores de GC estaba relacionado con la biosíntesis de la glicosilación alterada, se analizó la abundancia de mamíferos α-1,6-fucosiltransferasa (Fut8) y guanosina transportador difosfato (GDP-Tr) en los tumores de GC y los tejidos adyacentes por RT-PCR. Los resultados revelaron que la expresión de mRNA Fut8 fue menor en los tumores que en el tejido adyacente (Figura 4C). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en el difosfato de guanosina (GDP) transportador -fucose (PIB-fuc-Tr) la expresión génica entre los tumores y el tejido adyacente (Figura 4D).
(A) transferencias de lectina de las proteínas del suero sondaron con la lente culinaris aglutinina A (ACV). El eje horizontal representa los grupos experimentales: control (n = 20), gastritis atrófica (n = 20), y carcinoma gástrico (GC) (n = 20); cada grupo consta de 3 muestras homogéneas. El eje vertical indica la relación de la proteína fucosilado a la proteína total. La diferencia entre los grupos fue estadísticamente significativa (P & lt; 0,001). (B) lectina secante de las proteínas del tejido sondeadas con LCA. El eje horizontal representa los grupos experimentales: tejido tumoral (n = 20) y el tejido adyacente (n = 20). El eje vertical indica la relación de la proteína fucosilado a la proteína total. La diferencia entre los grupos no fue estadísticamente significativa (P & gt; 0,05). La expresión relativa del ARN mensajero (ARNm) de Fut8 en el tejido tal como se mide por RT-PCR (C). El eje horizontal representa los grupos experimentales: tejido tumoral (n = 20) y el tejido adyacente (n = 20). 9
b4.11±1.853.29±1.692.0470.047sumfuc
c43.88±7.7744.16±6.10-0.2170.830GCglycoA
d1.07 1
r
0.210
a0.127
a0.006
a-0.023
a0.088
a0.250
b0.055
b
P
0.0160.1480.9440.7930.3160.0040.532Peak 2
r
0.009
a0.038
a0.011
a-0.067
a0.010
a0.224
b-0.099
b
P
0.9170.6670.9040.4450.9060.0100.258Peak 3
r
0.083
a0.094
a0.066
a0.039
a-0.115
a-0.216
b-0.346
b
P
0.3480.2860.4550.6540.1930.013<0.001Peak 4
r
-0.045
a0.160
a0.047
a-0.006
a-0.091
a0.122
b0.074
b
P
0.6130.0680.5940.9430.3010.1670.403Peak 5
r
-0.029
a-0.156
a-0.020
a0.097
a0.108
a0.299
b0.478
b
P
0.7430.0760.8160.2700.2180.001<0.001Peak 6
r
0.009
a0.020
a0.044
a-0.114
a-0.348
a-0.757
b-0.787
b
P
0.9210.8170.6180.197<0.001<0.001<0.001Peak 7
r
-0.039
a0.089
a-0.075
a-0.161
a-0.245
a-0.368
b-0.517
b
P
0.6580.3110.3940.0660.005<0.001<0.001Peak 8
r
-0.135
a-0.058
a0.002
a-0.087
a-0.035
a-0.215
b0.011
b
P
0.1240.5130.9840.3210.6920.0140.897Peak 9
r
0.028
a-0.072
a-0.034
a0.095
a0.315
a0.794
b0.591
b
P
0.7510.4130.7030.280<0.001<0.001<0.001GCglycoA
r
-0.033
b-0.042
b-0.012
b0.046
b0.355
b10.869
b
P
0.7100.6370.8960.605<0.001<0.001GCglycoB
r
-0.052
b-0.045
b0.027
b0.105
b0.345
b0.869
b1
P
0.5580.6110.7600.232<0.001<0.001Sumfuc
c
r
0.061
a0.151
a0.040
a-0.108
a-0.170
a-0.353
b-0.580
b
P
0.4860.0850.6510.2210.052<0.001<0.001Table 9
a2.67±1.583.97±1.804.17±1.334.84±2.276.834<0.001Sumfuc
b46.43±4.7743.21±5.5542.14±6.9442.91±6.942.9440.036Table