Extracto
inhibidores de tirosina quinasa resistentes tales como erlotinib se utilizan comúnmente como un agente terapéutico contra el cáncer debido a su relativamente baja de efectos secundarios el perfil y, a veces, una mayor eficacia. Sin embargo, la resistencia a erlotinib (ER) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas está siendo reconocida como un problema importante. Por lo tanto, son necesarios para entender el mecanismo detrás de ER y en desarrollo regímenes eficaces. El papel de la autofagia en el cáncer ha sido motivo de controversia y sigue siendo poco clara. En este estudio, hemos examinado la eficacia de dosis bajas de combinación de erlotinib en cisplatino en células de adenocarcinoma de pulmón erlotinib resistentes (ERPC9) y el papel de la autofagia en ER. Se establecieron células a partir de células PC9 ERPC9 erlotinib sensibles. tratamientos adecuados se realizaron durante dos días y la supervivencia celular se cuantificó con un ensayo Alamar Blue. LC3II y proteínas reguladoras de la autofagia se midieron mediante transferencia Western. ARN de interferencia pequeño (siRNA) se utilizó para inhibir la traducción de la proteína de interés. En las células ERPC9, el tratamiento de combinación indujo la muerte celular sinérgica y una disminución significativa en la autofagia. Al inicio del estudio, las células tenían una ERPC9 LC3II significativamente mayores y menores niveles de p-mTOR en comparación con las células PC9. La adición de rapamicina aumento de la resistencia y las células sensibilizadas ERPC9 3-metiladenina, lo que indica la autofagia puede estar actuando como un mecanismo de protección. Un examen más detallado reveló que las células albergadas ERPC9 basales elevados niveles Atg3. La alta Atg3 basal era específico y bajó significativamente con el tratamiento de combinación. siRNA transfección de Atg3 dio lugar a la reversión de ER; 42,0% más células murieron en el tratamiento erlotinib-solo con transfección en comparación con células no transfectadas ERPC9. Nos revelan un nuevo papel para Atg3 en la promoción de ER como la inhibición de la traducción Atg3 fue capaz de dar lugar a la re-sensibilización de las células ERPC9 a erlotinib-tratamiento solo. Además, se demuestra que la combinación de erlotinib en cisplatino es un tratamiento eficaz contra el cáncer resistente a erlotinib por la orientación (abajo-regulación) Atg3 la autofagia y la inducción de muerte celular por apoptosis mediada
Visto:. Lee JG, Wu R (2012) Erlotinib combinación cisplatino y Atg3 mediada por la autofagia en Erlotinib resistente al cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (10): e48532. doi: 10.1371 /journal.pone.0048532
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Marzo, 2012; Aceptado: 27 de septiembre de 2012; Publicado: 31 Octubre, 2012
Copyright: © 2012 Lee, Wu. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Jasmine G . Lee fue financiado en parte por los Institutos nacionales de Salud (NIH) T32 HL07013. Este proyecto fue financiado en parte por subvenciones del NIH HL077902 y HL096373. Los autores informan de ningún conflicto de interés financiero en relación con el estudio, incluidos los materiales o métodos empleados o de los resultados especificados en este documento. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y tiene una de las tasas de supervivencia más bajas entre todos los cánceres, con un comunicado de cinco años de supervivencia del 13% [1]. El cáncer de pulmón se pueden clasificar a grandes rasgos en dos grupos principales con fines de pronóstico y tratamiento del cáncer: de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). De todos los cánceres de pulmón, el 85% son NSCLC [2] y se subdividen además en tres grupos en función de sus características histológicas: carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes y el adenocarcinoma [2] - [4]. CPNM tiende a ser menos sensible a la quimioterapia que SCLC, e incluso con la resección quirúrgica de tumores primarios etapa temprana, hasta el 50% de los pacientes muestran recurrencia de sus cánceres primarios [4], [5]. Debido a esto, se necesitan regímenes de quimioterapia eficaces y, a veces, la quimioterapia sistémica es la única opción para los tumores localmente avanzados y /o enfermedad metastásica.
agentes quimioterapéuticos basados en el platino como
Cis
-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatino) han sido tradicionalmente los principales agentes en el CPNM y se ha demostrado que mejora la supervivencia de los pacientes [6]. Sin embargo, el cisplatino lleva significativos efectos secundarios tóxicos, especialmente a dosis altas, tales como: náuseas, emesis, insuficiencia renal, ototoxicidad y neurotoxicidad debido a sus efectos citotóxicos no específicos en el cáncer y las células normales [7], [8].
Más recientemente, hay un interés continuo en la investigación, desarrollo y producción de agentes contra el cáncer que se dirigen a las vías patológicas específicas, lo que permite a estos agentes tienen perfiles de menor toxicidad y menor riesgo de efectos secundarios. Uno de estos Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aprobó el agente utilizado en el adenocarcinoma de pulmón es erlotinib. Erlotinib es un inhibidor de tirosina quinasa (TKI) que inhibe el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) a través de la inhibición competitiva del sitio de unión a ATP en el dominio tirosina quinasa [9], y, posteriormente, la reducción de las vías de señalización corriente abajo de proliferación [10]. EGFR se expresa excesivamente en muchos tipos de cáncer, incluyendo 40 a 80% de NSCLC [11], [12]. Las mutaciones asociadas con EGFR, como mutaciones que conducen a la sobreexpresión de EGFR, se consideran mecanismo fundamental para la tumorigénesis como EGFR está involucrado en muchos procesos de crecimiento reguladoras incluyendo la proliferación, la apoptosis, la adhesión, invasión y migración [2], [10], [13 ]. Erlotinib ha demostrado ser un tratamiento eficaz para NSCLC mutaciones albergar EGFR [14]. Sin embargo, alrededor de 10 a 14 meses después de iniciar el tratamiento, algunos cánceres de pulmón desarrollan resistencia erlotinib (ER) que conduce hasta la recurrencia [15], [16]. Se han realizado pocos estudios sobre los mecanismos y rutas implicadas de la resistencia adquirida a los ITC, pero este tema sigue siendo controvertido y relativamente claro que justifica una aclaración adicional de los posibles mecanismos moleculares de la resistencia [17].
La autofagia ha sido clásicamente entiende que es un mecanismo para la homeostasis de la proteína celular y la degradación de los componentes celulares dañados y /o orgánulos [18], [19]. Su papel es fundamental ya que la autofagia alterada está vinculada con varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [19], [20]. La autofagia se ha descrito también para actuar como un "segundo" vía de la muerte celular programada (el otro es la apoptosis) y por el contrario un mecanismo de protección de la integridad celular [20], [21]. Sin embargo, su papel en el cáncer y el cáncer de la resistencia sigue siendo poco claro: hace acto autofagia como un mecanismo para promover la resistencia del cáncer o promover la muerte de las células del cáncer [22], [23]? Por lo tanto, la determinación y la comprensión del papel de la autofagia en ER es importante.
Con el fin de mejorar el tratamiento del NSCLC, es esencial para comprender el mecanismo molecular que subyace a ER y encontrar los regímenes que son eficaces en el tratamiento de cánceres resistentes a erlotinib . Por lo tanto, en este estudio, hemos examinado la eficacia de dosis bajas de tratamiento de combinación de erlotinib en cisplatino en erlotinib adenocarcinoma de pulmón resistentes y determinar el papel de la autofagia en ER. También hemos identificado una proteína reguladora clave en la vía de la autofagia que es capaz de modular ER.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
Una línea de células sensibles a erlotinib PC9 , un adenocarcinoma de pulmón humano con la sobreexpresión de EGFR, fue amablemente dotados del Dr. Halmos (Universidad de Columbia) [24]. Se mantuvo en medio RPMI 1640 que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS) con Antibiótico-antimicótico (Invitrogen, Carlsbad, CA). La línea celular ERPC9 se estableció mediante el cultivo de células PC9 en el 5% de FBS medio de cultivo que contiene erlotinib. Las células se mantuvieron inicialmente a una concentración de erlotinib de 33 nM (IC50) y la dosis se aumentó gradualmente durante un período de 12 semanas hasta que la concentración final de erlotinib fue de 10 mM. Entonces, mediante el uso de técnicas de clonación de una sola célula en la que se eligieron sólo las células que se dividen activamente (que indica la resistencia), se establecieron las células ERPC9. A continuación, las células se mantuvieron ERPC9 en 10% de SFB en medio RPMI 1640 que contiene la concentración de erlotinib establecido final de 10 mM.
* La viabilidad celular se cuantificó mediante ensayo Alamar Blue. El grupo de control actúa como el estándar para la viabilidad celular y la muerte celular. (A) En las células ERPC9, el tratamiento de combinación indujo significativamente más muerte celular de los tratamientos farmacológicos individuales (p & lt; 0,0001). Erlotinib-solo resultó en la supervivencia 96,6%, cisplatino 89,3%, y la combinación de 61,1%; este efecto fue sinérgica (CI de 0,12). (B) En las células parentales PC9, el tratamiento de combinación indujo significativamente más muerte celular que los tratamientos con fármacos individuales (p & lt; 0,0001) erlotinib solo resultado en el 79,6% de supervivencia, cisplatino 76,1%, y la combinación de 49,6%; este efecto fue sinérgica (CI de 0,45). (C) En las células NHBE, erlotinib solo, cisplatino solo, y la combinación de tratamiento demostró la muerte celular mínima o cambio en la viabilidad entre los cuatro grupos (p = 0,958) que indica una toxicidad mínima con el tratamiento combinado.
Normal tejidos epiteliales bronquiales humanas se obtuvieron de la Investigación de Enfermedades de intercambio Nacional (Philadelphia, PA) [25] - [27]. Los tejidos no se recogieron de pacientes con diagnóstico de enfermedades relacionadas con los pulmones. células epiteliales bronquiales proteasa disociadas se sembraron en cámaras Transwell (Corning; 24 mm) a 5 x 10
4 células /cm
2 en medio de crecimiento epitelial bronquial (Lonza). Después de 4-7 días en una condición de cultivo sumergido o cuando los cultivos alcanzaron la confluencia, las células se transfieren a una interfaz de aire-líquido (ALI) en condiciones de cultivo F12 de un jamón /DMEM (01:01) con la adición de los ocho factores siguientes: transferrina (5 mg /ml), insulina (4 mg /ml), toxina del cólera (20 ng /ml), factor de crecimiento epidérmico (10 ng /ml), dexametasona (0,1 M), extracto de hipotálamo bovino (15 mg /ml) , BSA (0,5 mg /ml), y todo-
ácido trans -retinoico
(30 nM), lo que facilitó la polarización y la diferenciación mucociliar. NHBE células fueron cultivadas durante 7 días después de la transferencia de ALI. Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO2.
* niveles (A) de la autofagia, se evaluaron por Western blot para LC3II y p62. (B) células ERPC9 tenían niveles significativamente más altos de LC3II que en las células PC9 (p = 0,030) y los niveles significativamente más bajos de p62 que en las células PC9 (p & lt; 0,0001); indicando los niveles de autofagia mayor base de referencia en células de la resistencia erlotinib. Concordantemente, puede verse que había niveles significativamente más bajos de LC3I en células ERPC9 comparación con las células PC9 (p = 0,008)
Drogas:. Los valores de IC50 y los grupos de tratamiento
cisplatino , rapamicina y 3-metiladenina (3-MA) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), y erlotinib se adquirió de Selleck Químicos (Huston, TX, EE.UU.). 3-MA se disolvió en agua y todos los otros fármacos se disolvieron en dimetil sulfóxido (DMSO) para formar concentraciones stock de cisplatino 10 mM, erlotinib 10 M, rapamicina 27,4 mM, y 3-MA 100 mM. 3-MA fue preparado fresco cada vez y otras drogas se mantuvo a -20 ° C y todos se diluyeron a la concentración apropiada antes de su uso. La duración del tratamiento para todos los experimentos consistió en dos días. Las células se sembraron en primer lugar y se cultivaron con 10% de SFB en medio RPMI 1640 durante 24 horas antes del inicio del tratamiento para permitir que las células se unan a la placa. El día siguiente, se reemplazó el medio con 0,1% de SFB en medio RPMI 1640 que contiene las concentraciones de fármaco apropiadas durante dos días. En la determinación de los valores de CI, placas de 96 pocillos se utilizaron y respuestas a las dosis se llevaron a cabo mediante el uso de células PC9 sensibles mediante el tratamiento de células en una gama de serie de concentraciones de fármaco para cada fármaco (erlotinib o cisplatino). grupos Oficiales de tratamiento consistió en un diseño experimental factorial 2 × 2 [28]: control (0,1% DMSO), erlotinib (10 nM), cisplatino (3 M), y la combinación de erlotinib y cisplatino (10 nM + 3 M). tratamientos oficiales de drogas se realizaron en placas de 6 pocillos. Ambas líneas celulares PC9 y ERPC9 se sometieron a tratamientos con fármacos. Los experimentos que requieren el uso de rapamicina y 3-MA realizó el mismo protocolo.
* Los niveles de autofagia se midieron a través de Western blot para LC3II. (A & amp; C) En células ERPC9, hubo una disminución significativa en LC3II con el tratamiento de combinación en comparación con otros grupos (p = 0,011). La disminución de la LC3II fue sinérgica con el tratamiento de combinación, lo que refleja la misma tendencia sinérgico para la muerte celular. (B) No hubo diferencias significativas en los niveles LC3II en las células NHBE (p = 0,958). (D) Se ha observado significativamente mayor LC3II (verde) de fluorescencia en células ERPC9 comparar a las células PC9 (p & lt; 0,0001). En las células ERPC9 que se sometieron a tratamiento de combinación, una disminución significativa en la fluorescencia verde fue visto en comparación con todos los otros grupos (p & lt; 0,0001). Verde = LC3 y azul = DAPI.
Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se cuantificó usando el ensayo Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Tras la finalización del tratamiento con fármaco, el medio original se reemplazó con medio que contiene 10% de colorante azul Alamar y se incubó durante 1 h en un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO2. La viabilidad celular y la muerte se midieron a 530 nm de longitud de onda de excitación y 590 nm de emisión usando Packard fluorocount. La relación de la viabilidad celular se calculó con la ecuación como sigue:. (Absorbancia del grupo de tratamiento) /(absorbancia del grupo de control) x 100
* La rapamicina y 3-MA se utilizaron para evaluar el papel de autofagia y su asociación con la resistencia a erlotinib. grupos apropiados se trataron con (A) 10 nM de rapamicina o (B) 5 mM de 3-MA con el tratamiento de combinación de drogas. En las células ERPC9, la supervivencia celular aumentó 16,5% cuando la rapamicina fue añadido al tratamiento de combinación (p = 0,004). En comparación con 3-MA tratada ERPC9 células, hubo una disminución de 10,5% en la supervivencia celular en el grupo de tratamiento de combinación y 9,1% de disminución en 3-MA con el tratamiento de combinación (p = 0,032 y p = 0,037, respectivamente). (C) Cuando 3-MA se añadió a erlotinib-sola (p & lt; 0,0001) y cisplatino solo (p & lt; 0,0001) de tratamiento había un 39,2% y 31,0% mayor muerte celular, respectivamente, en comparación con el tratamiento con un solo tratamiento fármaco solo .
Western blot
Las células se lisaron en tampón RIPA enfriado con hielo (Millipore, Billerica, MA) que contiene una combinación de un inhibidor de la proteasa y cócteles inhibidor de la fosfatasa (Sigma-Aldrich) . proteínas lisaron se centrifugaron durante 10 min a 14.000 rpm a 4 ° C, y los sobrenadantes se cuantificaron para el contenido de proteína utilizando Bio-Rad DC Kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA) y un espectrofotómetro medido a 650 nM. Las proteínas se separaron a continuación por un gel 4~20% de gradiente de SDS /PAGE (Thermo Fisher Scientific, Newington, NH) y se transfirieron a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon con 5% de leche no grasa en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,05% de Tween 20 (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT), y posteriormente se sondaron con anti-p62 (1:1000, Millipore) , -LC3, -Beclin 1, P-Akt, -Akt, p-mTOR, -mTOR, -Atg3, -Atg7, -Atg5-12 compleja (1:1000, la señalización celular, Boston, MA), un-escindió y la caspasa 3 -cleaved, PARP escindida y no--cleaved (1:500, señalización celular), en la leche no grasa al 2,5% en TBST durante la noche a 4 ° C. A continuación, las membranas se lavaron 30 minutos (x3) con TBST y se sondearon con anticuerpo de rábano picante conjugada con peroxidasa secundario (1:2000, la señalización celular) en la leche no grasa 2,5% en TBST durante 1 hora a RT. Con el fin de determinar la igualdad de carga y estandarizar la cantidad de proteína cargada, blots fueron despojados y re-borrados con el ratón monoclonal anti-β-actina (Sigma-Aldrich) y la relación de la intensidad de la banda (tamaño × densidad) de interés con se tomaron su β-actina asociado. Las bandas fueron imágenes utilizando software de Fuji 4000 oa través de la película.
* (A) Western blot de p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin-1, Atg5-12, ATG7, y se muestran Atg3 . (B) Hubo significativamente más altos niveles en células Atg3 ERPC9 comparan con células PC9 (p = 0,018) y (C) Nivel de p-mTOR significativamente menor (p = 0,021) que valida aún más que los niveles de autofagia son más altos en las células ERPC9.
Knock Down de Atg3 de siRNA transfección
pequeños ARN de interferencia (siRNA) dirigido específicamente a Atg3 humana se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). células ERPC9 y PC9 se sembraron en placas de 12 pocillos (6 × 10
4 células por pocillo) y se transfectaron con ARNsi Atg3 durante 24 horas en medio de crecimiento libre de antibiótico; usando siRNA Lipofectamine RNAiMAX y medio de suero reducido OPTI-I-MEM (Invitrogen). Los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante.
* (A) p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, Atg5-12, ATG7, y Atg3 se midieron a través de Western blot. (B) Con el tratamiento de combinación de erlotinib en cisplatino, hubo un cambio significativo sólo en Atg3; Atg3 nivel se redujo significativamente en comparación con todos los otros grupos (p = 0,028). Esto sugiere que el tratamiento de combinación se pueden orientar a la sobreexpresión de línea de base de Atg3 en células ERPC9.
inmunocitoquímica
Las células se lavaron con PBS dos veces, y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a TA. Las células fueron entonces vuelven a lavar con PBS dos veces, se incubaron en PBS que contenía 0,2% Trinol X durante 5 minutos a TA, y se bloquearon con tampón de bloqueo (PBS con 3% de BSA) durante 5 minutos a TA. Las células se incubaron con el anticuerpo primario, anti-LC3 (1:200, la señalización celular) durante la noche en un 4 ° C habitación oscura, se lavó 3 veces al día siguiente, y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Alexa Flour 488 anticuerpo (1:1000 , Invitrogen) durante 1 hora a RT en una habitación oscura. Las células fueron lavadas con PBS y 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Vector Laboratories, Burlingame, CA) se añadió para teñir los núcleos. Zeiss LSM700 confocal (Carl Zeiss, Alemania) se utilizó para capturar imágenes, y se tomaron todas las imágenes con el mismo ajuste para permitir la coherencia. Análisis de imágenes se realiza de una manera ciega.
* (A) El bloqueo de traducción Atg3 y la autofagia con Atg3 siRNA transfección en células ERPC9 fue confirmada por Western blot. (B) Después de ERPC9 células fueron transfectadas con siRNA Atg3, las células se convirtió en significativamente más sensibles a erlotinib (p = 0,043) y la combinación (p = 0,002) en comparación con los tratamientos con fármacos ERPC9 células con transfección siRNA no específica. No hubo diferencia significativa en las muestras tratadas con cisplatino, sin embargo, (p = 0,924). (C) Atg3 siRNA transfección fue capaz de producir un aumento significativo en la sensibilidad hacia los tratamientos individuales de drogas en el PC9 línea celular parental, así.
farmacológica y análisis estadístico
Análisis estadístico y determinación de diferencias significativas entre los grupos se realizaron mediante el empleo de la prueba t de Student de dos colas y el análisis de la varianza (ANOVA) cuando sea apropiado. Todos los análisis estadístico se realizó mediante el uso de software prisma (La Jolla, CA). Un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo en este estudio. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces de forma independiente.
* La apoptosis se midió a través de Western blot para la caspasa 3 escindida y la PARP escindida. (A & amp; D) en las células tratadas con ERPC9 combinación erlotinib en cisplatino, un aumento significativo de la caspasa 3 escindida y la PARP escindida se observaron en comparación con células no tratadas (p = 0,045 y p = 0,007, respectivamente). Además, hubo aumento significativo de la caspasa 3 escindida y la PARP escindida en comparación con todos los otros grupos (p = 0,030 y p = 0,003, respectivamente). (B & amp; C) Al inicio del estudio, había niveles más bajos significativas tanto en caspasa escindido 3 y escindidos PARP en ERPC9 comparación con las células PC9 (P & lt; 0,0001 y p = 0,0004, respectivamente)
Además. , se utilizó el método de Chou-Talalay [29] para obtener el índice de combinación (IC) para evaluar la presencia de sinergismo, efectos aditivos o antagonismo de tratamiento de combinación de erlotinib y cisplatino (muy fuerte sinergismo, fuerte sinergia, sinergia moderada, ligera sinergismo, aditivos, y el antagonismo se define como CI & lt; 0,3, 0,3 & lt; CI & lt; 0,7, 0,7 & lt; CI & lt; 0,85, 0,85 & lt; CI & lt; 1, CI = 1, y CI & gt;. 1, respectivamente)
resultados
los valores de IC50 en PC9 y ERPC9 células
La concentración inhibitoria (IC) 50 valores de erlotinib y cisplatino se establecieron por primera vez en las células PC9 antes de examinar los efectos de la combinación de los dos agentes como un tratamiento de combinación en las células PC9 resistente erlotinib (ERPC9). El determinado IC50 para erlotinib era 33 nM en células PC9 y 878 nM en células ERPC9 (alrededor de 26 veces mayor que en las células PC9) (datos no mostrados); esto confirma que se establecieron ERPC9 células de una manera que le permitió convertirse en resistentes y, posiblemente, imitan lo que se ve clínicamente. El IC50 de cisplatino fue de 18 micras de células PC9 y 40 micras de células ERPC9 (datos no mostrados). Dado el cisplatino IC 50 no aumentó significativamente, esto también apoya que las células ERPC9 demostraron resistencia específica al erlotinib.
Combinación Erlotinib en cisplatino en el tratamiento ERPC9, PC9, y bronquiales células epiteliales normales Humanos
Figura 1A y la Figura 1B muestran el porcentaje de ERPC9 y la supervivencia celular PC9 después de someterse a tratamientos con fármacos de dos días. Cuando las células se trataron con erlotinib en cisplatino combinación, 61,1% de las células sobrevivió ERPC9; este fue significativamente menor en comparación con las células tratadas con erlotinib-solo (96,6%) y cisplatino solo (89,3%). En otras palabras, el tratamiento de combinación mató a un número significativamente mayor de células (38,9%) en comparación con erlotinib-solo (0,4%, p = 0,001), cisplatino solo (10,7%, p = 0,0002) y el control de células no tratadas (0,0 %, p & lt; 0,0001). Además, el tratamiento de combinación indujo la muerte celular sinérgica fuerte pese a la resistencia de las células a ERPC9 erlotinib (IC = 0.12, calculado a través del método de Chou-Talalay [29]). Una tendencia similar de muerte celular sinérgica se observó en las células PC9 parentales con erlotinib en cisplatino combinación; la supervivencia celular después del tratamiento erlotinib-sola fue 79,6%, cisplatino fue de 76,1%, y la combinación fue 49,6% (p & lt; 0,0001) (CI = 0,45). Estos hallazgos sugieren que la combinación de cisplatino y erlotinib puede ser un régimen eficaz para matar las células de cáncer de pulmón de erlotinib resistente incluso a dosis bajas cuando se utilizan en combinación.
Se utilizaron células normales del epitelio bronquial humano (NHBE) para evaluar la toxicidad del tratamiento de combinación de erlotinib en cisplatino. tratamiento de dos días con erlotinib-solo, cisplatino solo, y la combinación de erlotinib en cisplatino demostraron la muerte celular mínima y no hay diferencias significativas en la muerte celular y la viabilidad entre los cuatro grupos (p = 0,958), lo que indica un índice terapéutico de seguridad en la dosificación actual para las células no cancerosas (Figura 1C).
niveles de referencia autofagia en las células ERPC9
El papel de la autofagia en el cáncer ha sido motivo de controversia y no se ha estudiado con gran detalle [30]. Para examinar el papel de la autofagia en ER, una comparación de los niveles de referencia de la autofagia entre ERPC9 y PC9 células se midieron a través de Western blot para LC3II [31] y p62. Como se muestra en la Figura 2, los niveles de LC3II fueron significativamente mayores en las células ERPC9 comparación con las células PC9 (p = 0,030). Además, los niveles de p62 fueron significativamente más bajos en las células ERPC9 que las células PC9 (p & lt; 0,0001). Ambos resultados sugieren que las células ERPC9 albergan los niveles más altos de autofagia de referencia que erlotinib células PC9 sensibles.
Combinación Erlotinib en cisplatino tratamiento y LC3II
Un examen más detallado del tratamiento de combinación en las células ERPC9 revelaron niveles significativamente más bajos de LC3II en comparación con todos los otros grupos de tratamiento como se ve en la Figura 3A y 3C (p = 0,011). La disminución en los niveles LC3II en análisis de transferencia Western fue sinérgica, lo que refleja la misma tendencia sinérgico visto en la muerte celular con el tratamiento de combinación. Esto sugiere que la autofagia puede ser un mecanismo asociado de ER, y el tratamiento de combinación de erlotinib en cisplatino puede trabajar por la orientación de la autofagia. Curiosamente, sin embargo, no hubo cambios significativos en LC3II en las células NHBE (Figura 3B).
Los mismos cambios en LC3II también se visualizaron mediante inmunofluorescencia (Figura 3D). Hubo una disminución significativa en la fluorescencia en las células tratadas LC3II combinación de erlotinib en cisplatino en comparación con los otros grupos de tratamiento (p & lt; 0,0001).
modulación de la autofagia Altera sensibilidad al tratamiento
Con el fin de determinar si la autofagia es un mecanismo esencial de supervivencia ER subyacente, agente autofagia inducir, rapamicina, y agente inhibidor, 3-MA, se utilizaron. Si el papel de la autofagia es promover la resistencia y la supervivencia contra el trato, se espera que habrá un aumento en la supervivencia celular con la inducción de la autofagia y una disminución en la supervivencia celular inversa cuando se inhibe la autofagia después de someterse a un tratamiento combinado. Como hipótesis, como se muestra en la Figura 4A, la rapamicina con el tratamiento de combinación erlotinib en cisplatino mostraron significativamente mayor supervivencia de las células y la viabilidad (16,5%) en comparación con las células que recibieron la combinación de cisplatino erlotinib sin rapamicina (p = 0,0004). Por el contrario, cuando se añadió 3-MA con la combinación de erlotinib en el cisplatino, la supervivencia celular fue significativamente menor (9,1%) en comparación con las células tratadas solamente con el tratamiento erlotinib en cisplatino combinación solo (p = 0,037) (Figura 4B). Además, la combinación de 3-MA, erlotinib y cisplatino fue capaz de matar significativamente más células de las 3-MA sola (44,6% y 34,1% de muerte celular, respectivamente) (p = 0,032). Como muestra la Figura 4B se ha demostrado que la inhibición de la autofagia con 3-MA fue capaz de sensibilizar las células a tratamiento de combinación, la Figura 4C muestra los resultados de 3-MA tratados ERPC9 células con erlotinib-solo y cisplatino solo. Cuando se añadió 3-MA a erlotinib-sola (p & lt; 0,0001) y cisplatino solo (p & lt; 0,0001) de tratamiento hubo una muerte mayor de células 39,2% y 31,0%, respectivamente, comparado con el tratamiento con el tratamiento solo fármaco sin 3-MA . Estos hallazgos asociados apoyan aún más que la autofagia puede ser un mecanismo de protección que permite una mayor supervivencia en las células ERPC9.
Atg3 y p-mTOR en células ERPC9
La figura 5 muestra los resultados del análisis de transferencia Western de clave proteínas reguladoras en la vía de la autofagia: p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, beclin-1, complejos Atg5-12, ATG7 y Atg3. No hubo diferencias significativas en p-Akt, Akt, mTOR, Beclin-1, complejo Atg5-12, y ATG7 entre ERPC9 y células PC9 (Figura 5A). Sin embargo, al inicio del estudio, p-mTOR fue significativamente menor en las células ERPC9 comparación con las células PC9 (p = 0,021) (Figura 5C). Además, hubo un nivel de línea de base significativamente mayor de Atg3 en células ERPC9 comparación con las células PC9 (p = 0,018) (Figura 5B). Una de las principales funciones de Atg3 es convertir LC3I a LC3II promover la autofagia [32] y por lo tanto no había un nivel significativamente menor de LC3I en las células ERPC9 que las células PC9 (más LC3I fue convertido) (p = 0,008) (Figura 2A) . El nivel más bajo en p-mTOR apoya el hallazgo de niveles basales más altos de la autofagia en las células ERPC9. Mientras, los altos niveles extraordinarios de Atg3 puede representar un componente crítico para conferir y contribuir a los niveles basales más altos de la autofagia y la promoción de ER.
Objetivos de tratamiento de combinación Atg3
Con el fin de evaluar más a fondo cómo el tratamiento de combinación regula a la baja la autofagia específicamente en las células ERPC9, se realizó un análisis de transferencia de Western de los cambios en las proteínas reguladoras autofagia. Como se muestra en la Figura 6A, no hubo cambios significativos en p-Akt, Akt, mTOR, p-mTOR, Beclin-1, complejo Atg5-12, y ATG7 entre los grupos de tratamiento. Hubo, sin embargo, un nivel significativamente más bajo de Atg3 cuando son tratados con la combinación de erlotinib en cisplatino en comparación con el nivel de referencia de control (p = 0,005) (Figura 6B). Este hallazgo puede sugerir que el tratamiento de combinación de erlotinib en cisplatino puede orientar de alguna manera la sobre-expresión o la traducción de Atg3 observada en las células ERPC9. Además, estos resultados apoyan que Atg3 es un componente crítico de conferir ER y la supervivencia.
La inhibición de siRNA Atg3 Invierte Resistencia Erlotinib
Para investigar más a fondo el papel de los niveles basales elevados de Atg3 visto ERPC9 en las células, las células fueron transfectadas con ERPC9 Atg3 siRNA y tratados adecuadamente. siRNA transfección tuvo éxito en el bloqueo de la actividad de la traducción y la autofagia Atg3 (representado por una baja LC3II y los altos niveles p62 en las células sin relativas Atg3 siRNA) como se ve en la figura 7A. No hubo diferencia significativa en la supervivencia celular en el grupo de control de las células transfectadas con siRNA ERPC9 no específica (NS siRNA) en comparación con las células ERPC9 sin transfección (p = 0,445). Sin embargo, con Atg3 siRNA transfección, las células se volvieron a ERPC9 sensibilizado al tratamiento con erlotinib-solo y no tenía un aumento significativo en la muerte celular asociada del 32,0% en comparación con los tratados con erlotinib solo ERPC9 células con siRNA transfección NS (p = 0,043). células ERPC9 también se convirtió en significativamente más sensibles al tratamiento de combinación después de Atg3 siRNA transfección en comparación con las células transfectadas NS siRNA; se observó 10,3% más de la muerte celular (p = 0,002) (Figura 7B). Sin embargo, este fenómeno no se observó en las células tratadas con cisplatino ERPC9 transfectadas con siRNA Atg3; no hubo diferencia significativa entre tratada cisplatino Atg3 siRNA y NS siRNA (70,2% vs. 70,8%, respectivamente) (p = 0,924). Estos datos sugieren que soporta y la línea de base sobre regulación de Atg3 está íntimamente involucrado en la sala de emergencia y supervivencia de las células y el bloqueo de la traducción de Atg3 en las células ERPC9 es capaz de revertir la sala de emergencia y re-confieren sensibilidad a erlotinib tratamientos. Además, el bloqueo de Atg3 no confirió aumento sensible al tratamiento con medicamentos cisplatino, lo que sugiere que la inhibición de Atg3 es específico para ER.
Atg3 siRNA transfección fue capaz de producir un aumento significativo en la sensibilidad hacia los tratamientos individuales en el parental PC9 línea celular. Erlotinib con Atg3 siRNA fue capaz de inducir 11,5% más de la muerte celular en comparación con NS tratamiento siRNA erlotinib (p & lt; 0,0001) y cisplatino con Atg3 siRNA fue capaz de inducir 9,7% más de la muerte celular en comparación con NS siRNA tratamiento con cisplatino (p & lt; 0,0001). La diferencia en la muerte celular entre las células tratadas combinación con Atg3 siRNA en comparación con el tratamiento de combinación con NS siRNA fue pequeño (4,5%); aunque esta diferencia fue significativa (p = 0,002).
La apoptosis
La apoptosis se midió a través de Western blot de la caspasa 3 escindida y PARP escindida. Hubo niveles significativamente más bajos de PARP escindido (p = 0,004) y se escindió de la caspasa 3 (p & lt; 0,0001) en células ERPC9 comparación con las células PC9 (Figura 8B y 8C, respectivamente).