Extracto
Sensibilidad reducida de cáncer de próstata (PC) de las células a la radioterapia plantea un reto significativo en la clínica. La activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el tipo 1 similar a la insulina receptor de factor de crecimiento (IGF1R), y la interferencia entre estas dos vías de señalización han sido implicados en el desarrollo de la resistencia a la radiación en PC. Este estudio evaluó los efectos de la orientación tanto a los receptores en la regulación de la radio-sensibilidad de las células PC. Los inhibidores específicos de EGFR y IGF1R, Erlotinib y AG1024, así como siRNA dirigidos a EGFR y IGF1R, se utilizaron para las células PC de radio-sensibilización. Nuestros resultados muestran que la inhibición de co-ambos receptores significativamente humedecido crecimiento celular y daño en el DNA de reparación, y el aumento de la radio-sensibilidad en las células PC. Estos efectos se llevaron a cabo a través de la inhibición sinérgica de la reparación del ADN de recombinación homóloga dirigida (HRR), pero no a través de la inhibición de extremos no homólogos (NHEJ). Además, la capacidad HRR comprometida fue causada por la reducción de la fosforilación de sustrato receptor de insulina 1 (IRS1) y su posterior interacción con Rad51. El efecto sinérgico de los inhibidores de EGFR y IGF1R también se confirmó en el ensayo de xenoinjerto de ratón desnudo. Esta es la primera prueba el estudio co-inhibición del EGFR y IGF1R señalización en el contexto de la radio-sensibilidad en la PC y puede proporcionar un enfoque terapéutico prometedor adyuvante para mejorar el resultado de los pacientes al tratamiento con radiación PC
Cita.: Wang Y, Yuan JL, Zhang YT, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et al. (2013) La inhibición de los receptores EGFR y las células del cáncer de próstata IGF1R sensibilizado a la radiación por la supresión sinérgica de ADN recombinación homóloga reparación. PLoS ONE 8 (8): e68784. doi: 10.1371 /journal.pone.0068784
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: Diciembre 21, 2012; Aceptado: June 2, 2013; Publicado: 12 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30100185, Nº 81250036, Nº 30973000, Nº 30872583, Nº 81072116) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shaan'xi (2009JQ4003). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es la neoplasia maligna más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los pacientes de sexo masculino [1]. Durante la progresión del cáncer, el crecimiento inicial de las células PC es dependiente de andrógenos, y estas células sufren apoptosis en el agotamiento de andrógenos. Como consecuencia, la ablación androgénica se considera el tratamiento estándar para PC de más de 50 años [2]. Muchos pacientes finalmente desarrollan una enfermedad refractaria a las hormonas debido al crecimiento de células de cáncer refractario a los andrógenos, lo que lleva al fracaso de la terapia de ablación de andrógenos y deja a los pacientes con un menor número de opciones terapéuticas [3], [4]. La combinación de terapias locales definitivos, tales como prostatectomía radical junto con radioterapia adyuvante, se ha demostrado que mejora la supervivencia de pacientes de PC [5], [6]. Sin embargo, este tipo de tratamiento es desafiada por la aparición de resistencia en las células tumorales. Es, por lo tanto, de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para superar radioresistance y mejorar la radio-sensibilidad por la orientación mecanismos moleculares en células PC independientes de andrógenos.
factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) y el crecimiento similar a la insulina receptor del factor (IGF1R), dos más importantes receptores de tirosina quinasa, juegan un papel crítico en el desarrollo y progresión del cáncer a través de la regulación de la proliferación celular, la apoptosis, el crecimiento independiente de anclaje, la invasión, la angiogénesis, la inmunidad del cáncer y la resistencia a la quimio y /o radioterapia [7]. Estos dos receptores son frecuentemente sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos incluyendo PC [8], [9], [10], y por lo tanto podría ser utilizado como candidatos para la terapia del cáncer dirigida. De hecho, los inhibidores de EGFR y otro miembro de la familia EGFR Her2, incluyendo Erlotinib, Lapatinib, Cetuximab, y Gefitinib, son las opciones de mayor éxito en el tratamiento clínico actual de diferentes cánceres humanos, como se esperaba, sin embargo, el desarrollo de
de novo
resistencia se ha observado en la clínica después de su uso a largo plazo de estos medicamentos, lo que sugiere la existencia de mecanismos de derivación dentro de las células tumorales [11]. Estudios mecanicistas sobre los acontecimientos celulares y moleculares revelaron que extensa diafonía entre EGFR y la señalización IGF1R se produce en múltiples niveles, y que el bloqueo de la señalización de EGFR conduce a respuestas mejoradas al ligando IGF1R, IGF [12], [13]. Estos datos implican que la orientación ambos receptores al mismo tiempo podría proporcionar una mejor eficacia en el tratamiento del cáncer y superar la resistencia del tumor a un inhibidor individual, al tiempo que mejora la sensibilidad de los inhibidores individuales para la terapia del cáncer. Consistentemente, los estudios han demostrado que la doble orientación de ambos receptores bloquea la hiperfosforilación de reciprocidad, inhibe la proliferación e induce la apoptosis en varias células cancerosas, incluyendo PC y el cáncer colorrectal [14], [15].
En este estudio, se evaluado los efectos de la orientación tanto EGFR y la señalización de IGF1R en las respuestas de las células PC a irradiación?. Nuestros datos demuestran la potencia de la orientación de ambas vías en la modulación de los comportamientos de las células PC después de la radioterapia y revelaron los mecanismos subyacentes. Se trata de un estudio pionero que justifica aún más el uso combinatoria de inhibidores de EGFR y vías de IGF1R en el tratamiento de la PC.
Materiales y Métodos
cultura y el tratamiento
La célula las células PC independientes de andrógenos humanos DU145, PC3, ARCAP
e y ARCAP
M y línea celular de epitelio normal de la próstata humana PrEC fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). El R503 fue desde el Centro de Experimentación Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar. Las células se trataron con dimetil sulfóxido (DMSO, como el control de vehículo), 10 mM Erlotinib (inhbibitor EGFR, Eton Bioscience, San Diego, CA) y /o 10 mM AG1024 (inhibidor de IGF1R, Santa Cruz Biotecnología, Santa Cruz, CA) (grupos como experimentales) durante 1 h. Las células se irradiaron tal como se describe por Liu et al [16]. En algunos experimentos, las células también fueron transfectadas con el control de silenciamiento no siRNAs (NSC) (50 nM, Invitrogen, Shanghai, China) según el protocolo del fabricante.
Para establecer irradiación tolerantes sublíneas, células PC o IRS1 se irradiaron a 2 Gy por día, 5 días a la semana en un FCC-8000C
60 Co irradiador. Después de seis meses, se establecieron las sublíneas de DU145 que sobrevivieron a la irradiación ionizada y nombraron DU145-IIRR. Estas sublíneas se sometieron luego a tratamiento de drogas y otros experimentos.
ensayo clonogénico
La formación de colonias sinérgico tras el tratamiento combinado con inhibidores de EGFR y la irradiación y de IGF1 fue investigado por ensayos clonogénicos monocapa. Las células se privaron de suero durante la noche. Cinco mil células se sembraron en 10 cm de diámetro platos de cultivo de tejidos con medio de 10-mL. Las células fueron tratadas con AG1024 o Erlotinib durante 1 h y se irradiaron en dosis indicada después de que se habían adherido a los platos. La formación de colonias se determinó con tinción con violeta cristal mediante el uso de un contador de partículas Coulter en el día 10 después de la siembra de células. fracción superviviente se definió como la eficacia de clonación de las células tratadas dividido por el de las células de control. Los experimentos se repitieron tres veces.
La citometría de flujo ensayo
Para analizar la apoptosis celular, las células (1 × 10
4 /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de 24 h, las células se mueren de inanición de suero durante 24 h, y luego se trataron con AG1024 o Erlotinib para 1 h. Las células fueron irradiadas a la dosis de 2 Gy. A las 4 h después de la irradiación, las células se cosecharon por tripsinización, se fijaron en etanol al 70% a 4 ° C durante 2 h y se lavaron en 5 ml de PBS. Las células fueron teñidas con 1 ml de yoduro de propidio (PI) solución (0,2 mg de RNAsa A, 0,02 mg PI, y 1 ml de Triton X-100). El contenido de ADN en diferentes fases del ciclo celular se determinó por el flujo FACS citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA). Para detectar la tasa de apoptosis en las células tratadas, las células se tiñeron con anexina V y PI, y después se sometieron a citometría de flujo como se describe [16]. Las células de Anexina V-positivos y PI-negativas sometidos a principios de apoptosis se contaron como células apoptóticas. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.
La extracción de proteínas y Western Blot
Los diferentes grupos de células se lisaron con SDS al 1% de tampón de lisis (Beyotime Inc., Beijing, China). Para la extracción de proteína nuclear, las células se lavaron con tampón de lisis hipotónico (Teknova, Beijing, China), y en el dounced douncer celular (Wheaton Ltd, Millville, NJ). Los componentes nucleares se separaron a continuación a partir de extractos citosólicos por centrifugación, seguido de la lisis en tampón RIPA (Pierce Inc., Beijing, China).
Inmunoprecipitación y ensayo de Western-blot se realizaron como se describe por Liu et al [17 ]. Los siguientes anticuerpos fueron de Señalización Celular: anti-γH2AX, anti-IRS1, anti-fosfo IRS1 (pY612), anti-IGF1R, anti-fosfo IGF1R, anti-EGFR, EGFR anti-fosfo (Y1068), anti-β-tubulina , anti-ERK, anti-fosfo-ERK, anti-AKT, anti-fosfo AKT (S473), anti-DNA-PK, anti-Ku70, anti-Ku80, y anti-XRCC4. El anticuerpo anti-Lamin era de Abnova (Shanghai, China). El anticuerpo anti-HP-1α era de Millipore (Shanghai, China). β-tubulina, Lamin y HP-1α se utilizaron como controles de carga.
inmunofluorescencia
La formación de focos Rad51 γH2AX y se investigó de acuerdo con Barber et al [18]. Para la tinción de inmunofluorescencia para γH2AX y Rad51, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 1% durante 10 min a temperatura ambiente seguido por 70% de etanol durante 10 min a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS que contenía 0,1% de Triton durante 10 minutos, las células se permeabilizaron con 0,5% Triton en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Después de tres lavados en PBS, las células se bloquearon con albúmina de suero bovino 5% (BSA) en PBS durante 60 min. Entonces anti-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) o anti-Rad51 anticuerpo (investigación Oncogene, 1:300) se añadió en 5% de BSA en PBS y se incubaron con células a 4 ° C durante la noche con agitación suave. Después de cuatro lavados en PBS, las células se incubaron en la oscuridad con un anticuerpo secundario marcado con FITC en 5% de BSA a una dilución de 1:2000 para γH2AX y 1:200 para la detección de anti-Rad51 para 1 h a temperatura ambiente. Después de cuatro lavados más en PBS, los núcleos se tiñeron en la oscuridad con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg /ml, Invitrogen) en PBS durante 5 min, y los cubreobjetos se montaron con Fluoromount G ( Biotech sur., Birmingham, AL). Los portaobjetos se examinaron en un microscopio de fluorescencia Leica, con imágenes captadas por una cámara CCD e importados en el software de análisis de imagen avanzado SPOT (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). Para cada condición de tratamiento, las señales γH2AX o Rad51 se determinaron en al menos 50 células. Todas las observaciones fueron validados a partir de al menos tres experimentos independientes.
Los ensayos para la reparación del ADN HR-dirigida (HRR) y el de extremos no homólogos (NHEJ)
El cuantitativa
in vitro
recombinación homóloga (HR) de ensayo se realizó utilizando el sistema indicador recombinación PDR-GFP [19]. Brevemente, el plásmido PDR-GFP expresando GFP dos genes no funcionales se transfectó de forma estable en células DU145. Un segundo plásmido que codifica la enzima de restricción I Sce-I y tercera plásmido que expresa la proteína fluorescente roja (RFP) con una señal de localización mitocondrial para indicar la eficiencia de transfección se transfectaron transitoriamente en células DU145 que contienen el plásmido PDR-GFP. Cuando se expresa I-SCE, produjo ADN de doble filamento se rompe (DSBs) dentro del fragmento SceGFP y estimuló HRR para restaurar gen GFP intacta. la reparación del ADN por HRR se evaluó contando las células con tanto la señal GFP nuclear y la señal de RFP mitocondrial vs. todas las células transfectadas positivamente, es decir, la relación de células con dos señales rojas y verdes a aquellos con sólo señales rojas.
el ensayo NHEJ libre de células se realizó como se describió anteriormente [20] con extractos nucleares de 1 × 10
7 DU145 células.
En vivo
radioterapia de tumores
los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité étnica de la Cuarta Universidad médica Militar (Xi'an, china). 5 × 10
6 DU145 células fueron pre-mezclados con Matrigel (BD Biosciences) para la inyección subcutánea en el flanco de 10 semanas de edad, los ratones hembra desnudos. Veintidós días después (día 0), los ratones se dividieron al azar en 5 grupos, 5 ratones por grupo, con base en los tratamientos que recibirían: es decir, grupo de control recibió ningún tratamiento; grupo IR recibido γ-irradiación de diferentes dosis en los días 3, 6, 8, y 10, respectivamente; grupo IR + Erlotinib recibido γ-irradiación como el grupo de la irradiación, además de 100 mg /kg /d de Erlotinib vía oral durante 10 días; grupo IR + AG1024 recibido γ-irradiación, plus100 mg /kg /d de AG1024 por vía oral durante 10 días; IR + AG1024 y Erlotinib recibieron γ-irradiación, además de 100 mg /kg /d ambos fármacos durante 10 días. El volumen tumoral (V) se controló cada tres días durante siete semanas mediante la medición de la longitud (L) y la anchura (W), y se calcula como V = 0,5 × L × W
2. El resultado se expresó como índice de proliferación (PI, PI = tratamiento de control V /V).
El análisis estadístico
El efecto de Erlotinib y AG1024 sobre la inhibición de la proliferación celular, el crecimiento de xenoinjertos, la supervivencia clonogénico y la activación de la caspasa fue analizada estadísticamente utilizando
t
prueba de un no apareado de Student de dos colas. Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes para
in vitro
experimentos o de todos los animales en el grupo de
in vivo
experimentos. valor de p de ≤0.05 fue considerado estadísticamente significativo. * Y ** se marcó para P & lt; 0,05 y P & lt;. 0,01, respectivamente, en comparación con las células de control en todas las figuras
Resultados
reducción de la viabilidad de las células tumorales y la inducción de apoptosis por la orientación de EGFR y /o IGF1 R antes del tratamiento de irradiación
en este estudio, se evaluó por primera vez la sensibilidad inducida de las diferentes células cancerosas a la radiación
in vitro
. Hemos crecido y trataron diferentes líneas celulares de cáncer con Erlotinib (10 M) y /o AG1024 (10 M) durante 1 h y luego se irradia con 2 Gy. Nuestros datos muestran que la viabilidad de las células tumorales se redujo significativamente y la apoptosis de las células tumorales mejorada por irradiación después de la inhibición tanto de EGFR y IGF1R, en comparación con el tratamiento de irradiación solo o irradiación más de bloqueo de cualquiera de receptor (Figura 1A, B). Específicamente, cuando se compara con las células de control tratadas con vehículo, ya sea AG1024 o Erlotinib redujeron significativamente la viabilidad tumoral celular en las líneas celulares PC epiteliales (P & lt; 0,05), sin embargo, el más robusto efecto inhibidor del crecimiento por irradiación se logró con la aplicación simultánea de ambos inhibidores (P & lt; 0,05, en comparación con AG1024 o Erlotinib tratamiento en DU145, PC3 y ARCAP
células e) (Figura 1A). Por el contrario, AG1024 y /o erlotinib podrían no de radio-sensibilizar normal de línea celular de epitelio de próstata PrEC (Figura 1A). Nuestros datos también mostraron que tanto en las células DU145 y PC3, AG1024 redujo significativamente la fosforilación de IGF1R, mientras que Erlotinib inhibe dramáticamente la fosforilación de EGFR, y ni que muestra cruzada la actividad en el otro receptor, que indica que ambos inhibidores de la función de forma potente y específica (Figura S1).
A, ensayo de radio-sensibilidad de las células tratadas con inhibidores de EGFR y IGF1R. Las células de cáncer de diferentes grupos fueron tratados sin (control) o con AG1024 (10 mM), Erlotinib (10 mM) o ambos durante 1 h y después se sometieron a la radio-sensibilidad del ensayo clonogénico. Después de 10 días, los clones fueron fijadas y teñidas. fracción de supervivencia se calculó según los recuentos de colonias y planchas de eficiencia. B, ensayo de Radio-sensibilidad de las células tratadas con EGFR y IGF1R siRNAs. Las células de los diferentes grupos fueron transfectadas con la silenciación de control no siRNA (NSC-siRNA), EGFR y /o siRNA IGF1R y, a continuación, sometidos a la radio-sensibilidad del ensayo clonogénico como se describe en el panel A. C, la apoptosis de las células tratadas con EGFR y IGF1R inhibidores. líneas celulares de cáncer de próstata fueron pre-tratados con AG1024 o Erlotinib a las concentraciones indicadas durante 1 h, y luego se irradiaron durante 2 Gy. Después de 4 horas, se tiñeron con anexina V y yoduro de propidio para citometría de flujo para determinar el porcentaje de células apoptóticas. D, la apoptosis de líneas celulares de cáncer de próstata transfectadas con EGFR y /o IGF1R siRNA. Las células de los diferentes grupos fueron transfectadas transitoriamente con NSC siRNA, IGF1R siRNA o EGFR siRNA durante 24 h, y luego se irradiaron durante 2 Gy. La apoptosis se analizó como en el panel C. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, en comparación con las células de control
Además de las células PC epiteliales, también se evaluó los efectos de la orientación tanto EGFR y IGF1R señalización en la respuesta de la radio-sensibilización. de las células mesenquimales de PC-similares. Para este fin, hemos utilizado ARCAP
M, la contraparte mesenquimales de ARCAP
E desarrollado por Graham et al [21]. Ambas líneas de células presentan mínima expresión de receptor de andrógenos [22]. De acuerdo con resultados previos de Buck et al [14], el tratamiento combinado con inhibidores de EGFR y IGF1R no podrían inhibir el crecimiento de células mesenquimales sinérgicamente en respuesta a la irradiación, como lo hizo para el crecimiento epitelial (Figura 1A).
Para evitar los efectos no específicos asociados con los inhibidores moleculares pequeños, también repitieron el experimento en la Figura 1A usando siRNA específico para EGFR y IGF1R (Figura 1B). Como se muestra en la Figura S2, tanto siRNA trabajó de manera eficiente en derribando IGF1R y EGFR, respectivamente. Con la precipitación de una o dos de EGFR y /o IGF1R por siRNA, obtuvimos resultados similares como en la Figura 1A (Figura 1B).
A continuación, se caracterizaron los potenciales efectos apoptóticos de estos dos inhibidores de la citometría de flujo ensayo. Como se muestra en la Figura 1C, DU145, PC3 y ARCAP
células E mostraron una mayor sensibilidad de radio-siguiente dosis crecientes de AG1024 y /o erlotinib, mientras ARCAP
M fue sólo sensible a AG1024, pero no a Erlotinib. El tratamiento combinado con erlotinib y AG1024 sinérgica de radio-sensibilizar DU145, PC3 y ARCAP
células E, pero no
células ARCAP M. Al comparar las células DU145 a las células PC3, se encontró que los primeros son más sensibles a erlotinib que el segundo, dado que 10 M Erlotinib indujo una respuesta apoptótica robusta más de 1 M Erlotinib en las células DU145, mientras que se observó no mucho aumento de la apoptosis en PC3 las células de las mismas dosis de erlotinib. Resultados similares se obtuvieron con siRNA dirigidos EGFR y /o IGF1 R (Figura 1D).
Mejora de la radio-sensibilidad por los inhibidores de EGFR y IGF1R por deterioro del ADN reparación de DSB
Para comprender los mecanismos moleculares mecanismos subyacentes mejorada de radio-sensibilidad de las células cancerosas en respuesta a AG1024 y /o tratamiento con erlotinib, se determinó la capacidad del ADN de doble filamento romper (OSD) en las células DU145 y PC3, ya que DSB ejerce el efecto más letal en las células inducida por γ -irradiación. Al monitorear el nivel de la histona fosforilación H2AX proteína en el residuo C-terminal de la serina 139, también conocido como γH2AX, un conocido y sensible marcador de OSD, se demostró que había una fosforilación rápida y robusta de H2AX en 1 h después de la irradiación en ambos DU145 de control tratados con vehículo y células PC3 (Figura 2A), que disminuyeron rápidamente a las 4 h, y devueltos al nivel basal a las 24 h, lo que implica la realización de la reparación de DSB. En contraste, las células tumorales pre-tratados con AG1024, Erlotinib, o ambos mostraron un pico de fosforilación H2AX retrasado en 4 horas, y la fosforilación de H2AX continua hasta 24 h después de la irradiación, lo que sugiere deterioro de la reparación de DSB después AG1024 y el tratamiento Erlotinib (Figura 2A, B ). Además, había una diferencia significativa entre el grupo AG1024 + Erlotinib y AG1024 o Erlotinib grupo (5 y 10 Gy, P & lt; 0,01), lo que indica un efecto aditivo de co-inhibtion en el proceso de la reparación de DSB (Figura 2B)
A, OSD marcador γH2AX curso temporal de expresión después de la irradiación: Las células fueron suero de hambre durante la noche, luego se trató con 10 mM AG1024 y /o erlotinib 10 mM. Western-blot de células irradiadas a la dosis de 2 Gy, y se cosecha en los puntos de tiempo indicados. proteína HP-1α se utilizó como control de carga. Los datos fueron cuantificados por el software Image J y se expresaron como porcentaje del control. B, la detección de inmunofluorescencia de los focos que γH2AX la formación después de la irradiación. Las células se trataron con o sin AG1024 y /o erlotinib durante 1 h, y se irradiaron a diferentes dosis. Las células se fijaron después de 24 h. Los recuadros muestran imágenes representativas con señal γH2AX verde y azul DAPI nuclear. C, ensayo de reparación de DSB de HRR. células DU145 privadas de suero en ausencia o presencia de AG1024 (10 M) o Erlotinib (10 mM) se transfectaron transitoriamente con dos vectores, uno que expresa I-SceI ADNc, para generar DSBs de GFP cDNA, y otra proteína fluorescente de color rojo que expresa con un mitocondrial señal de localización para indicar la eficiencia de transfección. la reparación del ADN por HRR se evaluó mediante la proporción de células con las dos señales rojas y verdes a aquellos con sólo señales rojas. Los recuadros muestran imágenes representativas de células positivas y negativas para HRR. Los datos se presentan como media ± SD del porcentaje de células positivas para la reparación del ADN por HRR de tres experimentos independientes. D, ensayo de reparación de DSB de NHEJ. células DU145 pre-tratados con o sin AG1024 (10 mM), Erlotinib (10 mM) o ambos. Los correspondientes extractos nucleares se incubaron con el plásmido linealizado pBluscript KS (+) en un sistema libre de células para medir la NHEJ. El ADN plásmido linealizado sin tratamiento con los extractos nucleares (ADN solamente) y el extracto nuclear de las células de control sin el plásmido (extracto nuclear sólo) se utilizaron el control negativo. extracto nuclear a partir de fibroblastos R503 se utilizó como control positivo. Las flechas indican las posiciones de plásmido linealizado y dímeros. E, ensayo de Western-blot para detectar la proteína relacionada con NHEJ. células DU145 pre-tratados con o sin AG1024 (10 mM), Erlotinib (10 mM) o ambos, y luego irradiados para la proteína nuclear relacionadas con el NHEJ (DNAPK, K70 /80, la XRCC4). Lamin se utilizó como control de carga. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, en comparación con las células de control
Efectos de EGFR y IGF1R inhibidores sobre el deterioro de la reparación de DSB a través de la inhibición de la HRR, pero no de NHEJ
.
para diferenciar si el deterioro de la reparación de DSB se debió a un defecto en la HRR o NHEJ, las dos vías principales para la reparación de DSB, que cuantitativamente evaluados HRR utilizando el sistema indicador de recombinación PDR-GFP y se examinaron NHEJ utilizando un
in vitro ensayo libre de células
[20]. Como se muestra en la Figura 2C, para las células DU145, el tratamiento con AG1024 y Erlotinib potentemente nivel reducido HRR combinado en comparación con el control del vehículo o de cada agente solo (P & lt; 0,05). Por el contrario, el extracto nuclear tratado con inhibidor individual o de ambos eran incapaces de alterar la
in vitro
ligadura de pBluescript KS (+), en comparación con el extracto nuclear de células de control de vehículo (Figura 2D). Para este análisis, el extracto nuclear de células R503 se utilizó como control positivo, como se demuestra por Yang et al [23]. Además, la expresión de las proteínas de reparación del ADN relacionadas con el NHEJ, incluyendo el ADN-PK, Ku70, Ku80 y XRCC4, no fueron afectados por AG1024, Erlotinib o ambos en células DU145 (Figura 2E), lo que sugiere que la inhibición de estas dos vías de señalización no lo hizo deteriorar iniciado por NHEJ de reparación de DSB de ADN, una de las formas más comunes de la reparación de DSB en células de mamífero.
Supresión de diafonía de la señal en múltiples niveles mediante la inhibición de los receptores EGFR y IGF1R
estudios previos revelaron extensa diafonía entre EGFR y la vía de señalización de IGF1R en múltiples niveles [14]. Nuestros datos anteriores han demostrado que la co-inhibición de EGFR y IGF1R podría aditiva de radio-sensibilizar a las células PC a través de la alteración de la reparación de DSB HRR. Para investigar más a fondo cómo la interacción entre los dos receptores afecta a la reparación de DSB, se realizó la inmunoprecipitación-Western-blot para examinar la interacción física entre EGFR y IGF1R en DU145 y PC3 células siguiente γ-irradiación. Nuestros datos muestran que sin irradiación, estos dos receptores interactuaron uno con el otro en ambas líneas celulares tumorales y que esta asociación no se alteró significativamente a las 24 h después de la irradiación (Figura 3A). Por otra parte, se determinó la transducción de la señal aguas abajo de un receptor en respuesta al ligando de la otra receptor. Como se muestra en la Figura 3B, para las células DU145 y PC3, la fosforilación de EGFR se aumentó de una manera dependiente de la dosis para el tratamiento con IGF-I en las células pero se redujo significativamente en co-tratamiento con el inhibidor de EGFR, erlotinib. Del mismo modo, la fosforilación de IRS1, la molécula de señalización importante IGF1R, se mejoró tras el tratamiento con concentraciones crecientes de EGF, pero se inhibió después de la adición de AG1024 (Figura 3C). Además, se encontró que el ligando para cada receptor, es decir, IGF-I y EGF, era suficiente para activar estos genes diana en DU145 y células PC3. Sin embargo, la activación más robusta se logró con co-tratamiento con ambos, el IGF-I y EGF, mientras que el bloqueo de estos receptores de señalización, ya sea con AG1024 o Erlotinib fue capaz de reducir la activación de estos genes diana, pero se observó el más potente reducción de DU145 y células PC3 tratadas previamente con los dos inhibidores (Figura 3D). Estos datos sugieren que la co-tratamiento con inhibidores de EGFR y IGF1R fue capaz de suprimir su diafonía ya su vez bloquean su señalización aguas abajo, incluyendo la vía PI3K /AKT y MAPK.
A, inmunoprecipitación detectar la interacción /IGF1R EGFR. células DU145 y PC3 se irradiaron a la dosis de 2 Gy. A continuación, se extrajeron las proteínas celulares, y se sometieron a ensayo de inmunoprecipitación detección de EGFR y la interacción IGF1R. B, IGF-I activa EGFR en DU145 y células PC3. Las células se privaron de suero-durante la noche, y después se sometieron a la estimulación de IGF-I durante 30 min. fosforilación de EGFR se detectó por Western blot. C, EGF activa IRS1, el factor clave de la vía de señalización de IGF1R en DU145 y PC3 células. Las células se privaron de suero durante la noche, y después se sometieron a la estimulación de EGF durante 30 min. fosforilación IRS1 se detectó por Western blot. D, MAPK o AKT activación de EGFR y después de IGF1R simulación de inhibición. células DU145 y PC3 se trataron con o sin AG1024 (10 mM), Erlotinib (10 mM), AG1024 más erlotinib; IGF (50 ng /ml), EGF (50 ng /ml), o EGF más IGF para 30 min. A continuación, ERK1 /2 y la expresión phosphrylation, la expresión de AKT y phosphrylation, la expresión IRS1 y phosphrylation se determinó mediante Western Blot. β-tubulina se utilizó como control de carga.
Efectos de los inhibidores de EGFR y IGF1R en la supresión de la IRS1 /recombinación homóloga mediada por Rad51
Nuestros datos actuales sobre AG1024 y Erlotinib IRS1 regulación fosforilación /activación implicado la posible participación de IRS1 /HRR mediada por Rad51 en respuesta a la irradiación gamma en células PC, como estudio previo indicó también [24]. De hecho, nuestros datos muestran que la fosforilación de IRS1 fue inducida por γ-irradiación con activación pico conseguido a 4 h después de γ-irradiación en las células DU145 y PC3, mientras que el pico de la fosforilación de IRS1 se retrasó a 8 h después de γ-irradiación después del tratamiento con AG1024 o erlotinib solo. Por el contrario, co-tratamiento con tanto AG1024 y Erlotinib significativamente reducida activación IRS1 no sólo en el nivel basal (0 h después de la irradiación), pero también en todos los puntos de tiempo de hasta 24 h después de la irradiación (Figura 4A).
a, Western blot que muestra el nivel de p-IRS1 en diferentes puntos temporales después de 2 Gy γ-irradiación de DU145 y células PC3 pre-tratados con o sin AG1024 (10 mM), Erlotinib (10 mM), o ambos para 24 h. β-tubulina se utilizó como control de carga. La imagen de gel representativo se muestra en la parte superior y cuantificación p -IRS1 /relación de β-tubulina de tres experimentos independientes se muestran en la parte inferior. B, inmunoprecipitación que muestra la interacción entre IRS1 y Rad51 en el extracto nuclear de DU145 y PC3 células. C, la formación de focos Rad51 nuclear como se analizó por tinción de inmunofluorescencia. células DU145 y PC3 se mantuvieron con o sin AG1024 (10 mM), erlotinib (10 mM) o ambos (de izquierda cuatro barras), transfectadas de manera simulada (pseudotreated), o transfectadas con el control no siRNA (NSC siRNA) o con IRS1 siRNA (derecha tres bares). Los recuadros muestran imágenes representativas con señal de Rad51 verde y azul DAPI nuclear. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt;, en comparación con AG1024 /Erlotinib- células tratadas o pseudotreated 0,05; ** P & lt; 0,01, en comparación con AG1024- o células tratadas con Erlotinib. D, Rad51 inmunofluorescencia tinción de DU145 y PC3 células tratadas con LY292004, PD98059, o erlotinib seguidas de γ-irradiación. La formación de focos Rad51 nuclear se determinó en los mismos que en C. El recuadro muestra imágenes representativas con señal de Rad51 verde y azul DAPI nuclear. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt;. 0,05, en comparación con los de sólo irradiados células
A continuación, se determinó la interacción física entre IRS1 y Rad51 en la fracción nuclear de células seguido γ-irradiación utilizando inmunoprecipitación. Como se muestra en la Figura 4B, el tratamiento con vehículo, AG1024, Erlotinib o AG1024 más erlotinib no cambió significativamente los niveles de proteína IRS1 o Rad51, mientras que los niveles de IRS1 asociada con Rad51 se redujo dramáticamente en las células tratadas con AG1024 más erlotinib, que es coherente con el reducido significativamente el nivel de fosfo-IRS1 en estas células. Estos datos demostraron que el AG1024 más erlotinib tratamiento suprime la interacción con IRS1 Rad51, lo que indica EGFR y co-IGF1R podría inhibir la inhibición de ADN de doble capítulo romper la reparación por la inhibición de la HRR.
Además, también se determinó la localización subcelular de Rad51 que forma focos nucleares en los sitios de las lesiones del ADN. Nuestros datos muestran que aproximadamente el 15% de las células de control tratadas con vehículo fueron positivos para Rad51 focos nuclear después de la exposición a irradiación?.