Extracto
El trasplante de hígado para el carcinoma hepatocelular (CHC) resultados en una condición específica en la que la respuesta inmune está dirigida potencialmente contra ambos antígenos alogénicos y cáncer. Hemos investigado el nivel de inmunidad contra el cáncer durante la respuesta inmune alogénica. Dark Agouti-a-Lewis y trasplantes hepáticos Lewis-a-Lewis de rata se llevaron a cabo y la inmunidad de los receptores de anti-cáncer se analizó en el momento de la activación aloinmune. La aparición de rechazo en los receptores alogénicos fue confirmado por una supervivencia más corta (
p
& lt; 0,01), el aumento de las pruebas de función hepática (
p
& lt; 0,01), la presencia de signos de rechazo en la histología, y un donante específico
ex vivo
reacción mixta de linfocitos. En el momento de la activación aloinmune, las células mononucleares de sangre del grupo alogénico demostró una mayor citotoxicidad contra el cáncer (
p Hotel & lt; 0,005), que estaba relacionado con un aumento natural killer (NK) la frecuencia de células (
p
& lt; 0,05) y un nivel de activación de monocitos /macrófagos superior (
p
& lt; 0,01). Del mismo modo, la citotoxicidad de las células NK hígado anti-cáncer (
p
& lt; 0,005), y los niveles de activación de hígado de monocitos /macrófagos (
p
& lt; 0,01) fueron también aumentó. La citotoxicidad aloinmune asociado estaba mediada a través del receptor NKG2D, cuya expresión se aumentó en el injerto rechazado (
p
& lt; 0,05) y en las células NK y monocitos /macrófagos. ligandos de NKG2D se expresaron en células de HCC rata, y su inhibición impidieron la citotoxicidad aloinmune asociada. Aunque la espera de
in vivo
validación, citotoxicidad aloinmune asociado después de un trasplante de hígado de rata parece estar relacionado con el aumento de frecuencias y niveles de activación de las células NK y monocitos /macrófagos, y es al menos en parte, mediada a través de la NKG2D receptor de
Visto:. Lacotte S, G Oldani, hendiduras F, Orci LA, Rubbia-Brandt L, Morel P, et al. (2014) aloinmune activación promueve la Lucha contra el Cáncer de citotoxicidad después del trasplante de hígado de rata. PLoS ONE 9 (3): e91515. doi: 10.1371 /journal.pone.0091515
Editor: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recibido: 6 de diciembre de 2013; Aceptado: 11 Febrero 2014; Publicado: 20 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Lacotte et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (PP00P3_139021), la Fundación Artères, la Astellas European Foundation, y la Fundación Boninchi, la Elsie y Carlos de Reuter, y el Marie-France y la Fundación Francisco Minkoff. Cristiano Toso fue apoyado por una Cátedra de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (PP00P3_139021). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el trasplante hepático es el tratamiento más eficaz para los pacientes con principios no resecable carcinoma hepatocelular (HCC) [1], [2]. Sin embargo, el 15% de los receptores de la experiencia post-trasplante de recurrencia HCC, lo que conduce rápidamente a la muerte en casi todos los pacientes [3]. Se han propuesto diversas estrategias para disminuir este riesgo, incluyendo una mejora de los criterios de selección del trasplante, la focalización de los que circulan células de HCC, el uso de fármacos contra el cáncer adyuvantes y una inmunidad contra el cáncer promovido [4].
Trasplante para HCC es una condición única, con la activación inmune dirigida contra ambos antígenos del donante y el cáncer alogénicos. Esta doble activación rara vez ha sido explorado. Una activación aloinmune sólo puede ser dirigida contra antígenos alogénicos específicos o estar vinculado a una activación más amplio también la promoción de una respuesta inmune contra el cáncer no específica. Esta última hipótesis se ha sugerido por una serie de estudios que muestran un mayor riesgo de recurrencia posterior al trasplante en pacientes con HCC más profunda inhibición inmune; por ejemplo, después de que el uso de anticuerpos anti-linfocitos o en caso de una sobreexposición a inhibidores de la calcineurina [5] - [8]. Además, una disminución de expresión de un ligando NKG2D en los tumores de HCC, relaciones de sangre bajo de neutrófilos de los linfocitos y los recuentos de los macrófagos asociados al tumor también se han asociado con la recurrencia del CHC [9] - [12].
Idealmente, el alogénico inmunidad debe ser prevenida y la inmunidad contra el cáncer promovido. Una mejor comprensión de la diafonía entre los dos es por lo tanto deseable, con el fin de definir mejor los mediadores y los mecanismos implicados en cada tipo de inmunidad. En última instancia, estos datos servirán para definir la combinación inmunosupresión ideal después de un trasplante de hígado por hepatocarcinoma.
El presente estudio evalúa el nivel de citotoxicidad contra el cáncer en el hígado, el bazo y la sangre después del trasplante alogénico de hígado de rata. Se define el papel de los tipos específicos de células inmunes, incluyendo células asesinas naturales (NK) y monocitos /macrófagos, y la acción de los principales receptores de células NK.
Material y Métodos
Animales, el trasplante de hígado y la Declaración de Ética
Los experimentos se realizaron en ratas Dark Agouti (DA) con un peso de 200-250 g (7 a 8 semanas de edad, Janvier) Lewis y masculinos. Se sometieron a trasplante hepático ortotópico de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente [13]. DA-a-Lewis trasplantes alogénicos (modelo) fueron considerados como el grupo de estudio, y los trasplantes de Lewis-a-Lewis se utilizaron como controles singénicos (seis animales en cada grupo para la evaluación de supervivencia). Todos los animales fueron atendidos de acuerdo a las directrices internacionales sobre el Cuidado de Animales, y la aprobación ética se obtuvo del comité de ética de la Universidad de Ginebra y de las autoridades veterinarias de Ginebra (N ° 1052/3653/3).
rata líneas celulares de HCC
células JM-1 fueron amablemente proporcionados por George Michalopoulos (Universidad de Pittsburg) [14]. células MCA-RH7777 se adquirieron de ATCC (Molsheim, Francia). Ambas líneas celulares se cultivaron en medio DMEM a nivel de la glucosa alta (Gibco).
Evaluación de pruebas de función hepática, la histología hepática y Immunolabelling
Para detectar signos de rechazo del hígado, las pruebas de función hepática en suero, incluyendo aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y bilirrubina se evaluaron en un día, tres y diez después del trasplante. Los niveles en suero se midieron en colaboración con el laboratorio del hospital clínico central (Synchron LX20). Se analizaron muestras de nueve animales en cada grupo.
La presencia de rechazo también se evaluó la histología después de teñir hematoxin /eosina de muestras de hígado recuperada en el día diez después del trasplante. El nivel de rechazo se clasifica a ciegas por un patólogo experto en el hígado, según la clasificación de Banff [15]. Las células NK se marcaron en criosecciones con anti-NKRP1 (CD161, 10/78, Biolegend) seguido de Alexa Fluor®555 burro anti-IgG de ratón (Invitrogen). Los macrófagos se marcaron en las secciones incluidas en parafina con conejo policlonal anti-Iba1 (Wako), seguido de IgG Alexa Fluor®555 burro anti-conejo (Invitrogen).
sangre periférica, bazo e hígado aislamiento de células mononucleares
se recogieron
muestras de sangre de la vena de la cola (500 l) en 150 ml de dextrosa citrato ácido. Hígado y el bazo fueron recuperados a través de una incisión abdominal en la línea media después de la inyección de heparina 10 U IV. El hígado se perfundió con HBSS que contiene 0,5 mg /ml de colagenasa D (Sigma). Fue cortado en trozos pequeños, se resuspendieron en solución /colagenasa HBSS, se digirió a 37 ° C durante 20 min. La suspensión celular se lavó y se filtró a través de una malla de nylon. El bazo se cortó en piezas, se tritura y se filtra a través de una malla de nylon. células de sangre periférica, hígado y bazo se purificaron en un gradiente de densidad de Ficoll Paque (GE Healthcare). Las células mononucleares aisladas se lavaron y se contaron.
Mezcla de reacción de linfocitos y ELISA
activaciones inmunes alogénicas periféricos y el bazo se ensayaron usando reacciones de linfocitos mixtos. las incubaciones de células se realizaron en placas de 96 pocillos en 200 l de RPMI 1640 (Gibco), 10% de FCS (Invitrogen), 1 M HEPES (Invitrogen) y 1 U /ml /1 g /ml de penicilina-estreptomicina y 0,29 mg /ml L -glutamine (Gibco). células de Lewis Responder (2,5 × 10
5) a partir de cuatro alogénico y cuatro receptores singénicos se incubaron con 2,5 × 10
5 estimulador irradiado DA (o tercera parte) esplenocitos (5.000 rad) a 37 ° C /5% de CO
2 durante 24 horas.
El nivel de interferón gamma (IFN) se cuantificó por ELISA. placas de poliestireno (Costar) se revistieron durante la noche a 4 ° C con anti-rata purificada γIFN (1:500, clon DB-1, Biolegend) en tampón carbonato. Las placas se lavaron y se saturaron durante 30 minutos con medio RPMI suplementado 1640. Se añadieron los sobrenadantes de cultivo de células durante dos horas, seguido por IFN anti-rata biotina (1:1000, Poly5109, Biolegend), estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:1000, Biolegend) y la solución de sustrato (reactivo TMB, R & amp; Dsystem). Se obtuvo el nivel de IFN de acuerdo con una curva de dilución.
Citometría de Flujo Los anticuerpos y Ensayo de citotoxicidad
El fenotipo de las células inmunes de la sangre, el hígado y el bazo mononucleares se evaluó por citometría de flujo. Etiquetado se realizó utilizando anticuerpos contra CD3 (1F4) (BD Pharmingen), CD4 (W3 /25) (Biolegend), CD8 (OX-8), CD172a (OX-41) para monocitos /macrófagos y NKRP1 (CD161, 10/78 ) para las células NK. El fenotipo de las células se evaluó en nueve animales por grupo
.
receptores de las células NK se evaluó a través de anti-NKG2D (11D5F4) (eBiosciences) y anti-NKp30 (Santacruz) anticuerpos (SC-33647). La presencia de NKG2D ligandos fue probado en líneas de células JM-1 y MCA-RH7777 después de la incubación con el ratón recombinante NKG2D-Fc quimera (139-NK-050, R & amp; D Systems) (5 mg /pocillo) y IgG anti-humana Fc (HP6017, Biolegend).
el nivel de citotoxicidad de células anti-cáncer se evaluó con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células NK de hígado (seis animales por grupo), el bazo y la sangre ( siete animales por grupo). Ellos se incubaron con células de cáncer de Yac-1 diana marcadas con CFSE (0,5 M, Invitrogen) en la disminución de las proporciones efector /diana que van desde 40/1 a 4/1 durante cuatro horas a 37 ° C. Es de destacar que las células Yac-1 carecen de complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y se utilizan comúnmente para los ensayos citotóxicos. Tras el marcaje con AlexaFluor®647-AnnexinV (1,5 l, Biolegend) y 7-AAD (1/1000, Invitrogen) en tampón de unión de anexina, se evaluaron las células muertas mediante FACS Calibur (BD).
En experimentos seleccionados , la inhibición de la citotoxicidad se ensayó después de la incubación con anticuerpos anti-NKp30 anti-NKG2D y (1 mg /pocillo).
células NK magnética Ordenando
con el fin de analizar específicamente las células NK, un tratamiento de selección negativa se realizó a partir de PBMC y esplenocitos. Después de la incubación con el ratón anti-CD172a (OX-41, GeneTex), anti-CD45RA (OX-33, Biolegend) y anti-TCR anticuerpos (R73, Biolegend), las células se lavaron con un tampón (PBS 2% de BSA EDTA 2 mM ), y de cabra Dynabeads® revestidos se añadió anti-IgG de ratón (Invitrogen). Después de lavar, la suspensión celular se aplicó en un imán con el fin de eliminar las células no NK. La pureza de las células NK se evaluó por citometría de flujo (85% en el bazo y 90% en la sangre).
células del hígado NK se obtuvieron por una selección de dos etapas negativo /positivo. células mononucleares del hígado se incubaron con biotinilado anti-CD172a y los anticuerpos anti-biotina acoplados a microperlas (MiltenyiBiotec). Después de la eliminación de las células CD172a + a través de una columna, el flujo a través se incubó con anti-CD161 FITC y microperlas anti-FITC que permiten la selección positiva de las células NK. La pureza de las células NK se evaluó por citometría de flujo (80% en el hígado). Las células clasificadas se utilizaron inmediatamente para el ensayo de fenotipificación o citotóxico.
Real-Time Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR cuantitativa)
El ARN total (células o biopsias hepáticas) se preparó y se purificó utilizando el RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. Una g de cDNA se sintetizó mediante la extensión de una mezcla de cebadores aleatorios con la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit en presencia de RNasa inhibidor (Applied Biosystems). La cantidad relativa de cada transcripción se normalizó de acuerdo con la expresión de RPLP1 (proteína ribosomal grande P1). primer secuencias de
RPLP1
,
NKG2D
,
rrlt
,
rae1l
y
irp94
fueron diseñados con AmplifX y softwares y Primers3 están disponibles bajo petición. Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen total de 20 l usando un detector de secuencia termociclador (BioRad CFX96) con el kit básico para qPCR SYBR Green I (Eurogentec).
El análisis estadístico
Los resultados se representan como media +/- RIC. Los resultados se compararon estadísticamente mediante la prueba de Mann-Whitney. Supervivencias se representaron en las curvas de Kaplan-Meier y se compararon con la prueba de log-rank. La significación estadística se estableció en p. & lt; 0,05
Resultados
Evaluación de alloimmunity y el rechazo
La presencia de un alorreactividad se observaron específicamente debido a que algunos de rata de ratas a alogénico modelos de trasplante de hígado inducen niveles solamente bajos de alloimmunity sin rechazo celular agudo [16]. Como se describe en la literatura, los trasplantes de hígado de rata ortotópico DA-a-Lewis estudiados estaban vinculados a supervivencias más cortas en comparación con los trasplantes singénicos (supervivencia media: 13 vs. & gt; 60 días, p = 0,0037, datos no mostrados). pruebas de función hepática en suero (AST y ALT) se incrementaron después de día tres en los receptores alogénicos (todos p & lt; 0,01 frente a los controles singénicos, la Fig. 1A). El nivel de bilirrubina se incrementó después de 10 días en los receptores alogénicos (p = 0,026 vs controles singénicos, Fig. 1B).
(A) en suero de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) después alogénico oscuras agouti-a-Lewis (negro) y los trasplantes de hígado de rata Lewis singénicas-a-Lewis (blanco). niveles (B) después de bilirubine alogénico (negro) y singénico (blanco) del trasplante. (C) Representante hematoxilina-eosina manchadas biopsias en el día 10 después de alogénico (derecha) y singénico (izquierda) el trasplante de hígado de rata. (D) CD4 en la sangre después del trasplante /CD8 ratios en día 7 (D7) y 11 (D11). la secreción (E) IFN después de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) reacción mixta de linfocitos en el día diez después del trasplante con donante (DA) y la tercera parte estimulación. * P & lt; 0,05, **. & Lt; 0,01
La presencia de rechazo celular se confirmó el día 10 la histología y se calificó Banff 8 en todos los receptores alogénicos estudiados. destinatarios de control singénicos se calificaron Banff 0 (Fig. 1C). Además, la relación CD4 /CD8 periférica en el día 11 fue significativamente menor en los receptores alogénicos comparación con los receptores singénicos (2,9
VS
. 3,6, p = 0,0051, Fig. 1D). Por último, el alloimmunity fue dirigida específicamente a los antígenos del donante como lo demuestra el día 10 reacciones de linfocitos mixtos contra esplenocitos DA (concentración de IFN sobrenadante: 410 pg /ml
vs
indetectable.), Y la ausencia de respuesta frente a terceros antígenos de ratas Fisher (Fig. 1E).
alloimmunity asociada periférica citotoxicidad
con el fin de evaluar el impacto del rechazo en la inmunidad contra el cáncer, la actividad citotóxica de las células inmunes periféricas se puso a prueba
ex vivo
contra las células cancerosas Yac-1. En el momento de la activación aloinmune (día 10), el nivel de citotoxicidad periférica se incrementó en los receptores alogénicos en comparación con los controles singénicos y ratas ingenuas (efector /diana 40/1: 25,2%
vs
14,7%. y 9,4%, respectivamente, p = 0,0025, Fig. 2A). Este patrón se observó en todas las diluciones ensayadas (4/1, 10/1, 40/1).
(A)
Ex vivo
PBMC citotoxicidad contra el cáncer en el día diez después alogénico y trasplantes singénicos y en las ratas de control no tratados previamente en varios proporción efector /diana (e /T). (B) Frecuencia de NKRP1
células de alta (células NK) entre PBMCs en día 7 (D7) y 10 (D10) después del trasplante. La citometría de flujo punto de parcelas evalúa la estrategia compuerta. (C) La citometría de flujo punto de parcelas y el histograma para evaluar la estrategia de compuerta de monocitos /macrófagos (CD172 +) y el nivel de expresión en las células NKRP1 CD172 +. (D) La frecuencia de los monocitos /macrófagos (células CD172 +) entre PBMCs. (E) Nivel de activación de monocitos /macrófagos (nivel de expresión NKRP1 (intensidad de fluorescencia (IMF)) entre CD172a + células refiero). * P & lt; 0,05, ** & lt;. 0.01
Con el fin de evaluar si la citotoxicidad alterada estaba relacionada con una variación en los subconjuntos de células, citometría de flujo análisis se realizaron en PBMCs. NKRP1 (CD161), una de tipo C glicoproteína de membrana lectina, es altamente expresado en las células NK y se utilizó como un marcador para células NK de rata [17]. En el día siete, la frecuencia de las células NK. (CD3
- NKRP1
alto) se redujo significativamente en los receptores alogénicos en comparación con los controles singénicos (2,1%
vs
3,4%, p = 0,028, la Fig. 2B). Esta disminución de la frecuencia de las células NK periféricas está en línea con la migración observada previamente de las células NK en el hígado después del trasplante alogénico temprano [18]. El día 10, el aumento de la citotoxicidad observada periférica se relacionó con un aumento de la frecuencia de las células NK en sangre (10,79% en alogénico
vs
. 4,9% en singénico, p = 0,048).
monocitos /macrófagos también pueden participar en los eventos citotóxicos contra las células cancerosas. La población de monocitos día 10 (CD172a
+) se incrementó en tanto alogénico y los receptores singénicos en comparación con los controles no trasplantados tratados previamente, probablemente refleja un cierto grado de activación inmunitaria no específica perioperatoria (16,6%
vs
10,7%
vs
5,58%, respectivamente; p = 0,1 para alogénico
vs
ingenuo;.. p = 0,023 para singénico
vs
ingenuo, Fig. 2D). Dicho esto, la frecuencia más alta se observó en los receptores alogénicos (aún no alcanza significación estadística, p = 0,455 para alogénico
vs
. Singénico). Además, la frecuencia de monocitos activados expresan NKRP1 (CD161) fue mayor en los receptores alogénicos en comparación con los controles singénicos y los animales no trasplantados tratados previamente (media de intensidad de fluorescencia 1282
vs
. 568
vs
. 438, p = 0,0004, Fig. 2E) [19].
Ausencia de alloimmunity asociada Bazo citotoxicidad
con el fin de caracterizar mejor la citotoxicidad observada periférica, se evaluó la alogénico y anti-cáncer eventos inmunes en el bazo. Los día 10 esplenocitos de ratas alogénicas estimulados con células del donante (DA) secretan IFN más que los esplenocitos de ratas singénicas, lo que confirma la presencia de una respuesta específica del donante alogénico en el bazo (684
vs
. 99 pg /ml, p = 0,028, Fig. 3A). Por el contrario, las células NK de bazo ordenados demostraron que no había diferencia de citotoxicidad entre alogénico y los receptores singénicos (relación de efector /diana 10/1: 42,2 vs. 48,3%, p = 0,30, Fig 3B.). Del mismo modo, ninguna alteración en el número y el fenotipo de las células del bazo se pudieron detectar (datos no mostrados).
(A) IFN secreción después de esplenocitos reacción mixta de linfocitos en el día diez después del trasplante con donante y tercera estimulación parte . (B)
Ex vivo citotoxicidad
bazo células NK contra el cáncer en el día diez después del trasplante alogénico y singénico.
alloimmunity asociada hígado activación de las células mononucleares
La respuesta inmune de células mononucleares hepáticas fue probado en día 10 después del trasplante. Después del aislamiento, se aumentó el número de células mononucleares del hígado en las ratas alogénicas en comparación con sus homólogos singénicos (16 × 10
6
vs
. 5,35 × 10
6 células /hígado, p = 0,004 ).
Este aumento del número de células mononucleares se relacionó con un aumento del número de células NK en el injerto alogénico (19.5
vs
. 3 en el injerto singénico, p = 0,006, Fig. 4A) y a un aumento del número de macrófagos (131
vs
. 34.5 en el injerto singénico, p = 0,0034, Fig. 4B). Estas dos células subconjuntos se encuentran tanto en el parénquima hepático y en infiltrados de células del injerto alogénico. La alteración del número de células observado se asoció a un aumento de la activación. células NK hígado Ordenado demostraron un aumento de la citotoxicidad anti-cáncer en los receptores alogénicos (relación /target efector 10/1:.. 58,8%
vs
32%, p = 0,030, Fig 4C). Es de destacar que los receptores de trasplantes alogénicos de hígado de rata mostraron una tendencia hacia una citotoxicidad mayor en el hígado ordenados NK en comparación con las células NK de bazo-ordenados (relación /target efector 10/1: 58,8% frente a 42,2%, p = 0,101). Esta actividad de las células NK hígado superior está probablemente relacionado con el rechazo alogénico se encuentra principalmente en el injerto hepático [20].
(A) Imágenes representativas de secciones de alogénico (izquierda) y singénico (derecha) del injerto hepático etiquetado con anticuerpos anti-NKRP1 (rojo). Los núcleos se tiñeron con Hoechst (azul). Número de células NK-etiquetados por imagen contaba con múltiples secciones de hígado. (B) Imágenes representativas de secciones de alogénico (izquierda) y singénico (derecha) del injerto hepático marcadas con anticuerpos anti-Iba1 (rojo). Número de macrófagos marcados por imagen contaba con múltiples secciones de hígado. (C)
Ex vivo
hígado citotoxicidad de las células NK contra el cáncer en el día diez después del trasplante alogénico y singénico. relación /target Dos efector (E /T) se pusieron a prueba. (D) el nivel de activación de monocitos hígado /macrófagos (nivel de expresión NKRP1 (MFI) entre CD172a + células). * P & lt; 0,05, ** & lt; 0,01
El nivel de activación de los monocitos hígado se incrementó en los receptores alogénicos (IMF:.. 1232
vs
590, p = 0,005, Fig. 4D).
alloimmunity asociada a la citotoxicidad a través del receptor NKG2D
a fin de definir el potencial del receptor /ligando implicadas en las vías de la citotoxicidad detectada, qPCR se realizó en el día nueve biopsias de hígado. Al igual que en un informe anterior, la expresión de
NKG2D
, uno de los mejores receptores NK relacionada con el tumor caracterizado, fue 6,9 veces mayor en los injertos de hígado alogénicas en comparación con los controles singénicos (p = 0,028, Fig. 5A ) [21]. Como receptor NKG2D se expresa constitutivamente en las células NK, este resultado podría haber sido relacionado con el mayor número de células NK en el hígado alogénico. Sin embargo, los niveles de expresión de NKG2D en las células NK de sangre (mediana IFM:. 7694 vs. 4636, figura 5B, izquierda) y monocitos (mediana MFI:. 1180 vs. 666, figura 4B, derecha) también fueron más altos en alogénico destinatarios.
expresión (a) de hígado de
NKG2D
en el día diez después del trasplante hepático. (B) representativos niveles de expresión de NKG2D en las células NK en sangre (izquierda) y monocitos (derecha) de alogénico (negro) y los receptores singénicos (gris). Isotipo se utilizó como control (líneas de trazos). inhibición (C) ordenados sangre NK citotoxicidad de las células con anticuerpo anti-NKG2D o con el anticuerpo anti-NKp30. (D) Los niveles de ligando NKG2D (
rae1l, rrlt
y
irp94
) expresión en el hígado en el día diez después del trasplante. (E) Los niveles de ligando NKG2D (
rae1l
,
rrlt
y
irp94
) expresión en líneas celulares de HCC rata. (F) Nivel Representante de NKG2D recombinante-Fc de unión a la rata HCC líneas celulares. * P & lt; 0,05, ** & lt;. 0.01
La implicación del receptor NKG2D en la citotoxicidad fue probado con el uso de anticuerpo anti-NKG2D. Las células NK de sangre según demostraron niveles citotóxicos más altos en los animales alogénicos, y este efecto fue impedida por la adición de anticuerpo anti-NKG2D (30.1
vs
. 10.1, Fig. 5C). Esta inhibición era específico del receptor como ninguna disminución se pudo observar con el uso de anticuerpo anti-NKp30.
La expresión de ligandos de NKG2D se evaluó adicionalmente por qPCR en día nueve biopsias de hígado. En ratas, se describieron tres ligandos de NKG2D: Rae1l, Rrlt (ácido retinoico familia transcripción temprana) y Irp94 (isquemia sensible 94 kDa proteína, la proteína de choque térmico de la familia) [21], [22]. El
rrlt
la expresión de genes, fue significativamente superior en los injertos alogénicos de hígado en comparación con los injertos de hígado singénicos (2,93 veces mayor, p = 0,028, Fig. 5D).
En un esfuerzo por determinar cómo el aumento de la citotoxicidad mediada por NKG2D contribuyó al aclaramiento de células HCC, la expresión de ligandos de NKG2D también se evaluó en dos líneas celulares de HCC rata, JM-1 y MCA.
Rrlt
se expresó en la línea celular JM-1 (21.4 veces mayor en comparación con esplenocitos primarios), pero no en las células MCA.
Rae1l
no se expresa en células de HCC y
irp94
se expresó en diferentes niveles en las dos líneas celulares (JM-1: 2.63, MCA:. 3,68 veces mayor, figura 5E). Por último, la presencia de ligandos de NKG2D en la superficie de las líneas celulares de HCC se confirmó con el uso de un anticuerpo quimérico recombinante NKG2D-Fc. Tanto JM-1 y MCA expresan altos niveles de ligandos de NKG2D conocidos y potencialmente aún desconocidas (IMF, JM1:. 3.53.10
4
vs
1.02.10
4, MCA: 9.4.10
4
vs
1.83.10
4, Fig. 5F).
en general, NKG2D-ligandos se expresan en todas las líneas celulares de HCC que apoyan la idea de que activa NKG2D que expresan las células NK y los monocitos contribuyen a la remoción de células HCC.
Discusión
Este estudio proporciona nuevos conocimientos a la cuestión de la activación inmune equilibrada después del trasplante hepático alogénico en presencia de HCC, demostrando la presencia de una actividad citotóxica contra el cáncer aloinmune dependiente después de un trasplante de hígado de rata. Esta citotoxicidad está vinculada a un aumento de las frecuencias y los niveles de activación de las células NK y monocitos /macrófagos, y es al menos en parte, mediada a través del receptor NKG2D
.
El hígado de rata modelo de trasplante Dark Agouti-a-Lewis estudiado inducida una fuerte activación aloinmune dirigido específicamente contra antígenos del donante [23]. Este perfil inmunológico se asoció con un aumento del fenotipo y el nivel de activación de las células NK y los monocitos /macrófagos. Esto está de acuerdo con estudios previos que demuestran los efectos nocivos de los macrófagos durante un rechazo de aloinjertos de riñón de rata y el efecto protector de la depleción de las células NK tras el trasplante alogénico de hígado de rata [18], [24].
La diafonía entre las inmunidades alogénicas y anti-cáncer ha sido poco estudiada hasta ahora, y los datos actuales mostrar un hígado mejorada y periférico (pero no bazo) citotoxicidad contra el cáncer en el momento del rechazo del injerto hepático. En el trasplante de órganos humanos, las células NK estaban presentes en infiltrados de células endomiocárdica, pero estas células D, pero o no aparecen como actores principales en el rechazo del injerto hepático [25], [26]. De hecho, un aumento de la alorreactividad de las células NK tras el trasplante de hígado se ha informado y esta actividad no se correlacionó con los episodios de rechazo [26]. Sin embargo, el hígado humano y células NK de tejido linfoide secundario han mostrado fuertes niveles de citotoxicidad después de la estimulación por IL-2 o en la presencia de APC activadas [27], [28].
A la espera de
In vivo
y /o los datos clínicos, la presente observación apoya el uso de niveles más leves de la inmunosupresión en pacientes trasplantados por HCC, a fin de preservar la citotoxicidad anti-cáncer. Es de destacar que muchos modelos de trasplante alogénico de hígado de rata-rata-a inducen ningún rechazo celular agudo, y el modelo perfecto con células de tipo HCC -recipient singénicos y alogénicos inmunidad aguda actualmente no se encuentra (sin línea celular HCC Lewis está disponible), evitando así la
in vivo
la validación de los datos presentados. Además, se observó que la actividad anti-cáncer se describe después de los eventos de rechazo avanzadas, que rara vez se ven clínicamente. Sin embargo, la hipótesis de que los niveles más leves de rechazo también promueven aclaramiento de células de cáncer.
En lugar de la disminución de la inmunosupresión en su conjunto, una selección de drogas cuidado también se puede intentar de sobra las células NK y monocitos /macrófagos en vista de una mejor aclaramiento celular HCC. El uso de ozono de anticuerpos anti-linfocitos se ha asociado con un mayor riesgo de post-trasplante HCC recurrencia [8]. De no-agotamiento anticuerpos anti-IL2-R también puede tener un efecto, ya que alteran el fenotipo y la función de las células NK recién producidos [29] - [31]. Sirolimus y micofenolato mofetil se han demostrado para alterar el fenotipo de las células NK y la función
in vitro
, mientras que la ciclosporina no parecen tener un efecto [32].
In vivo
, todos los medicamentos de mantenimiento que queda por definir en el contexto de un trasplante de hígado por hepatocarcinoma un impacto en varios subconjuntos de células inmunes y la combinación ideal inmunosupresión [33], [34].
el /vía del receptor NKG2D ligandos de NKG2D apareció como un actor clave en la citotoxicidad aloinmune asociada. Ya se ha publicado que el nivel de expresión de NKG2D se eleva en el hígado de injerto alogénico [21]. Aquí, hemos demostrado que la expresión de NKG2D se aumenta específicamente en las células y macrófagos periféricos NK en el momento del rechazo, y el
ex vivo
citotoxicidad de las células NK de hígado es impedido por el bloqueo del receptor NKG2D (no pero el receptor NKp30). Además, los ligandos de NKG2D se podían encontrar en células de HCC rata, confirmando datos humanos con la expresión de la proteína UL16 de unión (ULBP) 1, un ligando NKG2D humano, en los tumores de HCC [10]. Esta vía ha sido explorado previamente en otros entornos oncológicas, como el carcinoma colorrectal, y el nivel de expresión del ligando NKG2D tumor se ha asociado a la respuesta de HCC y supervivencia de los pacientes [10], [35]. expresión de NKG2D en las células NK de sangre se incrementa después de la ablación por radiofrecuencia HCC, y está relacionado con mayores tasas de supervivencia libre de enfermedad [36]. Este aumento en la expresión de NKG2D también se observa después de la quimioembolización transarterial y se correlaciona con una disminución de NKG2D-ligando vertimiento (MICA soluble) [37]. expresión de NKG2D después del trasplante hepático podría ayudar en el CHC aclaramiento células. Finalmente, NKG2D ha sido recientemente implicada en la célula de macrófagos-NK diafonía que conduce a mayores niveles de activación de las células NK y células citotoxicidad anti-tumor [38]. El aumento de la expresión observada de NKG2D en los macrófagos en el momento del rechazo del injerto alogénico de hígado puede contribuir indirectamente a la citotoxicidad mediante la promoción de la activación de células NK y la citotoxicidad.
Más allá de NKG2D, un amplio panel de la activación de receptores inhibidores y se expresa en NK células, que el patrón de expresión pueden modular el nivel de activación de las células NK [39]. Para ilustrar, receptores inhibidores pueden reconocer complejo principal de histocompatibilidad de clase I, e inhibir la citotoxicidad de células NK [40]. El perfil del receptor difiere entre las células NK de órganos específicos, al igual que su función [41], y los cambios en el equilibrio entre la activación de los receptores inhibitorios y podría explicar al menos algunas de las características fenotípicas se describe en este documento y las diferencias de células funcionales NK entre los sitios en singénico y alogénico destinatarios. La exploración adicional se merecía.
Los datos actuales demuestran que la aparición de un rechazo de aloinjertos de hígado de rata promueve la citotoxicidad contra el cáncer a través del receptor NKG2D.