Extracto
Antecedentes
La hipoxia en los cánceres de resultados en la regulación al alza de factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) y un microARN, hsa-miR-210 (miR-210), que es asociado con un mal pronóstico.
métodos y las conclusiones
En líneas celulares de cáncer y tumores humanos, se encontró que el miR-210 objetivos del hierro mitocondrial ISCU andamio de proteínas de azufre, necesarios para el montaje de hierro azufre agrupaciones, cofactores de enzimas clave implicados en el ciclo de Krebs, el transporte de electrones y metabolismo del hierro. regulación a la baja de ISCU era la principal causa de la inducción de especies reactivas del oxígeno (ROS) en la hipoxia. supresión ISCU reduce mitocondrial complejo 1 y la actividad de la actividad de la aconitasa, provocó un desplazamiento de la glucólisis en normoxia y la supervivencia celular mejorada. Los cánceres con baja ISCU tenían un peor pronóstico.
Conclusiones
La inducción de estas importantes características de cáncer muestran que un solo microARN, miR-210, media un nuevo mecanismo de adaptación a la hipoxia, mediante la regulación de la función mitocondrial a través del metabolismo hierro-azufre grupo y la generación de radicales libres
Visto:. Favaro e, Ramachandran A, R McCormick, Gee H, C Blancher, Crosby M, et al. (2010) microARN-210 Regula mitocondrial radical libre respuesta a la hipoxia y el ciclo de Krebs en las células cancerosas por la orientación del hierro ISCU grupo de proteínas de azufre. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10.1371 /journal.pone.0010345
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago (UIC), Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2009; Aceptado: March 29, 2010; Publicado: 26 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Favaro et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Investigación del Cáncer Reino Unido y Amigos de Kennington Fondo de Investigación del cáncer (EF, ALH, JL), el Wellcome Trust (CB1, CC, IR), el Real Colegio de Cirujanos & amp; Fundación Británica de Urología (CB2, RMCC), Unión Europea, ACGT (FB), Rodas Beca (HG), Nuffield de Medicina Fellowship (AR), FIRC Beca (EF). Con el apoyo de los bancos biológicos INDH Centro de Investigación Biomédica de Oxford; Fundación Elsa Pardee (MI), la Sociedad Americana del Cáncer (MC, MI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la hipoxia es una diferencia fisiológica importante entre tumores y tejido normal, generadas principalmente por el crecimiento del tumor con un suministro inadecuado de sangre y el consumo de oxígeno por las células tumorales [revisado en [1]]. La hipoxia induce una respuesta transcripcional compleja principalmente a través de la inducción de factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α), que afectan a muchos procesos biológicos tales como la vía glucolítica, la angiogénesis, la regulación del pH, la invasión y la inmortalización [2].
un paradigma emergente en hipoxia es que las mitocondrias producen especies reactivas de oxígeno, mediada por el transporte de electrones continua en la hipoxia [3]. Esta vía de radicales libres contribuye a la regulación positiva de HIF [4] y el crecimiento mejorado in vivo [5], sin embargo, también puede ser tóxico. Una variedad de rutas inducidas por HIF ya han sido reportados para proteger de este último efecto, por ejemplo la inducción de la piruvato deshidrogenasa quinasa inhibe el complejo enzimático de la piruvato deshidrogenasa y el bloqueo de la conversión de piruvato a acetil coenzima A, la primera etapa en el ciclo de Krebs [6] y mejora la producción de lactato [7]. Mitofagia puede ser inducida por la proteína del dominio BH3 BNIP3, [8], y subunidades de la citocromo c oxidasa pueden cambiar a otros más eficientes [9].
Recientemente microARN (MIR), que son pequeñas ($ ~ $ 22 nt) ARN que regulan la expresión de genes post-transcripcional por bloquear la traducción de ARNm diana o acelerando su degradación [10], no codificante [11], se han notificado a ser inducidos por la hipoxia. Sin embargo, pocos de sus objetivos o mecanismos de acción son conocidos [revisado en [12]]. Nosotros y otros [13] han demostrado miR-210 se induce con firmeza por la hipoxia en muchas líneas celulares, a través de HIF1α [14]. Se analizaron recientemente su expresión en una serie de 216 pacientes con cáncer de mama y mostró la expresión de miR-210 se correlacionó con muchos objetivos HIF1α a nivel de ARNm (medido por un MetaGene hipoxia) y está fuertemente asociada a la mala supervivencia del paciente. Derivadas únicamente de algoritmos basados en la secuencia, algunos de los objetivos previamente validados de miR-210 incluyen Efrina A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], y la SM [19]. Se combinaron los algoritmos disponibles públicamente, con nuestros genes de la matriz de datos, para predecir los posibles objetivos de miR de importancia en las células cancerosas. Se encontró que el homólogo mitocondrial clúster hierro azufre ISCU fue la más alta prevista del blanco de miR-210. Recientemente, ISCU ha sido identificado como un objetivo de miR-210 también en las células endoteliales pulmonares normales [20], donde contribuye al efecto Pasteur y controla el nivel de la producción de ROS en la hipoxia, lo que sugiere su potencial papel de adaptación a la hipoxia en el contexto de endotelio pulmonar.
hierro azufre agrupaciones [Fe-S] están presentes en los sitios activos de muchas enzimas y proteínas, crítico para su actividad y capaz de conferir regulación por el estado redox [21]. Estas agrupaciones se ensamblan en la mitocondria [22] por una serie compleja de chaperones y enzimas incluyendo ISCU, a continuación, exportados al citoplasma, donde se ensamblan en la proteína correspondiente [23]. Entre las proteínas de racimo Fe-S implicados varios que comprender componentes clave de los complejos I, II y III en la mitocondria, y los componentes del ciclo de Krebs como succinato deshidrogenasa y aconitasa. La forma citoplásmica de este último regula el metabolismo del hierro a través de su función como un regulador de la traducción-IRP1 [24].
En este informe se muestran los principales efectos biológicos de miR-210 de orientación ISCU, todos los cuales son propensos a contribuir a fenotipos importante en el cáncer. Mediante la regulación negativa ISCU, miR-210 disminuye la actividad de la enzima ciclo de Krebs y la función mitocondrial, proporciona un mecanismo importante para el aumento de la generación de radicales libres en la hipoxia, aumenta la supervivencia celular en condiciones de hipoxia, induce un cambio a la glucólisis en normoxia e hipoxia (Warburg y Pasteur efectos) y la regulación positiva de la absorción de hierro necesaria para el crecimiento celular. Es importante destacar que el análisis de más de 900 pacientes con diferentes tipos de tumores mostró que la supresión de ISCU está fuertemente correlacionado con un peor pronóstico. Por tanto, este estudio revela una nueva vía activada en tumores hipóxicos, mediadas por el miR-210 que afectan a la actividad enzimática mitocondrial y la generación de radicales libres y pone de relieve la importancia del metabolismo mitocondrial en biología hipoxia [3].
Resultados
Selección de ISCU como un objetivo potencial
Se comparó el miR-210 expresión en nuestra serie publicada de cáncer de mama [14] con nuestra MetaGene hipoxia de los ARNm agrupadas [25] y la evaluación combinada con algoritmos de predicción de destino mostraron ISCU fue la más alta prevista del blanco, y tres conocidos genes diana también se sientan en posiciones de alto rango-fueron seleccionados por este método (Apoyo material y Métodos S1, S1 cuadro justificante).
miR-210 y ARNm ISCU someten a regulación recíproca
de acuerdo con las publicaciones anteriores [13], [14], el miR-210 fue inducida con fuerza en MCF7 y HCT116 por la hipoxia (1% o 0,1% de oxígeno) a las 24 y 48 horas, con una inducción máxima observada a 48 horas en 0,1% de oxígeno (Figura 1A y Apoyo a la Figura S1 a). ISCU ARNm se cuantifica por RT-PCR se correlaciona inversamente con el miR-210 y disminuyó significativamente mayor cuando las células fueron expuestas a hipoxia más severa durante períodos más largos (Figura 1B y el apoyo a la Figura S1B). Al igual que en la regulación de miR-210 en condiciones de hipoxia, la supresión ISCU en el nivel de transcripción dependía de HIF1α y no HIF2α (Imágenes de apoyo y S1C S1D). Por otra parte, también se encontró que el fenómeno de la regulación recíproca de miR-210 y ISCU por la hipoxia en muchas otras líneas celulares (Apoyo a las figuras S1E y S1F).
Un
, miR-210 aumenta bajo hipoxia, con el más robusto de inducción visto a las 48 horas con 0,1% de oxígeno.
B
, en las mismas condiciones, la regulación a la baja más fuerte de ISCU mRNA se observa a las 48 horas con 0,1% de oxígeno. Los niveles de expresión de miR-210 y mRNA ISCU en condiciones de hipoxia son en relación con sus niveles de expresión de normoxia a las 24 horas (n). Media ± s.e.m. de tres experimentos independientes se muestra (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
C
, la transfección de anti-210 rescata parcialmente la supresión de hipóxico ISCU ARNm y mímica-210 disminuye la sobreexpresión de ARNm ISCU en normoxia a las 48 hrs. La expresión de mRNA ISCU es relativa a la anti-ctrl en normoxia (N). Media ± s.e.m. de tres experimentos independientes se muestra (** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
D
, (
panel superior
) ISCU proteína es downregulated en lisados de MCF7 en el 0,1% de oxígeno en comparación con lisados de normoxia (N) cuando el anti-ctrl se transfectaron durante 48 horas. Esta disminución en el nivel de proteínas en condiciones de hipoxia es rescatado parcialmente cuando se transfecta el anti-210. En condiciones de normoxia, mímica-210 suprime los niveles de proteína ISCU comparación con las células transfectadas imitador-ctrl.
D
, (
panel inferior
), la cuantificación del rescate del nivel de proteína ISCU tras la transfección de anti-210. La transfección de anti-210 rescata los niveles de proteína en ISCU MCF7 en aproximadamente un 40%. se muestra Media ± E.E.M de dos experimentos independientes. (* P & lt; 0,05).
Mimic-210 suprime ISCU en normoxia y anti-210 invierte la supresión de la hipoxia
recapitulado la inducción hipóxica observado de miR-210 mediante la transfección MCF7 y HCT116 con imitador-210 en normoxia. Mimic-210 suprime los niveles de mRNA ISCU en aproximadamente un 60% (Figura 1C y Apoyo a la Figura S2A). A continuación, antagoniza el miR-210 en condiciones de hipoxia inducida con anticuerpos anti-210. La inhibición de la endógeno miR-210 rescatado significativamente la supresión de ISCU mRNA, aunque esto no fue completa (Figura 1C y soporte de la Figura S2A).
ISCU tiene dos principales isoformas empalmados alternativamente. ISCU1 tiene una secuencia N-terminal alternativo y se localiza en el citosol, mientras que ISCU2 se asocia con las mitocondrias. Para confirmar la especificidad del anticuerpo utilizado en estos estudios, las células MCF7 se trataron con siRNAs contra ISCU. La banda detectada en las células de control fue totalmente suprimida tras la transfección con siISCU1 y siISCU3 (Apoyo a la Figura S2 B). Las dos isoformas de ISCU no podían distinguirse por transferencia Western de lisados de células enteras, debido a la pequeña diferencia en el peso molecular. Sin embargo, se detectó la banda inmunorreactiva tanto en el citosol y las fracciones mitocondriales (apoyando la Figura S2C). Esta banda se denomina como proteína ISCU y su peso molecular es compatible con los resultados de Tong et. Alabama. [23].
En la hipoxia, las células MCF7 y HCT116 mostraron una reducción de la proteína ISCU, y esto se replicó con mímica-210 en normoxia (Figura 1D y soporte de la Figura S2D). Por otra parte, anti-210 revirtió parcialmente la supresión de la proteína hipóxico ISCU (Figura 1D y soporte de la Figura S2D). La hipoxia fuertemente reprimidas un indicador de luciferasa que contiene el 3'UTR de ISCU que incluía el miR-210 sitio diana putativo y esta supresión podría ser parcialmente rescatado por transfección transitoria de anticuerpos anti-210 (Apoyo a la figura S2E). Además, imitador-210 suprime sustancialmente la actividad de la luciferasa en comparación con el control en las células MCF7 de normoxia (apoyando la Figura S2E). Finalmente, si bien siRNA contra ISCU llevó a una regulación a la baja de ambos ISCU endógeno y exógeno un marcado ISCU que carecen de la 3'UTR, mímica-210 mediada downregulation se observó solamente en la proteína endógena ISCU (Apoyo a la figura S2F). En conjunto, estas observaciones demuestran que el miR-210 regula a la baja ISCU mRNA y los niveles de proteína por la orientación de su 3'UTR.
Efectos de ISCU regulación a la baja en proteínas Fe-S
Un efecto esperado de la regulación a la baja de ISCU habría una reducción de la prestación de Fe-S a proteínas diana. Por lo tanto analizamos el impacto de ISCU represión en dos enzimas que requieren Fe-S para sus actividades, aconitasa mitocondrial y complejo I. siRNA contra ISCU actividad de la aconitasa reducido significativamente en MCF7 y células HCT116 en comparación con células de control en normoxia (Figura 2A). Una disminución similar en la actividad de la aconitasa fue evidente en ambas líneas celulares después de la transfección de imitador-210 (Figura 2A). Sin embargo no hubo ningún cambio en los niveles de proteína aconitasa como se evaluó mediante Western blot (Figura Apoyo S3A). Aconitasa agotado de Fe-S actúa como el regulador de la traducción-IRP1, para aumentar la captación de hierro. Nos pareció que el aumento de la captación imitador-210 hierro en las células HCT116 (Figura Apoyo S3 B). También era evidente la inhibición de la actividad del complejo I mitocondrial inducida por imitador-210, en las dos líneas celulares (Figura 2B). En ambas líneas celulares no había regulación a la baja de la actividad por la hipoxia, en una medida similar a la inducida por imitador-210 o por el agotamiento ISCU. Por otra parte, la transfección de anti-210 en las células MCF7 fue capaz de aumentar significativamente la actividad de la aconitasa en la hipoxia (Figura 2C).
Las células transfectadas con siRNA contra ISCU o con imitador-210 muestran una disminución significativa en la actividad de la Fe-S aconitasa proteínas (
Un
) y el complejo I (
B Opiniones) a las 48 hrs. La actividad se expresa en relación con SCR para siISCU3 o para imitar-ctrl para imitar-210. Media ± s.e.m. de tres experimentos independientes se muestra (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
C
, hipoxia disminuye la actividad del complejo I de la aconitasa y en MCF7 y HCT116. La actividad se expresa con relación a normoxia (N). La transfección de MCF7 con anti-210 aumenta el nivel de actividad de la aconitasa, en comparación con anti-ctrl. Media ± s.e.m. de tres experimentos independientes se muestra (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
D
, en normoxia, MCF7 transfectadas con imitador-210 tienen un aumento en la concentración de lactato secretada y una reducción en el piruvato extracelular después de 48 horas. Lactato: piruvato relación muestra un aumento significativo en las mismas condiciones. La transfección con anti-210 en la hipoxia reducción de la producción de lactato en comparación con las células transfectadas anti-ctrl. Media ± s.e.m. de tres repeticiones biológica se muestra (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
A medida que la disminución de la aconitasa y la actividad del complejo I se reduce el ciclo de Krebs y mitocondrial función que investigó si hubo un cambio de la glucólisis y la producción de lactato. Nuestros resultados mostraron una reducción muy significativa del piruvato y el aumento de lactato en normoxia con el sinóptico-210, con un aumento de la relación lactato piruvato. También hubo una disminución en la producción de lactato con el anti-210 en la hipoxia (Figura 2D).
Efectos de ISCU regulación a la baja en la producción de radicales libres
La pérdida de Fe-S del complejo I es que pueda afectar al transporte de electrones en la cadena de transporte de electrones y el impacto sobre la producción de radicales libres. Por lo tanto, medimos la producción de superóxido en MCF7 y células HCT116. En normoxia, ambas líneas celulares mostraron un marcado incremento en la producción de radicales libres tras la transfección de imitador-210 en comparación con imitar-control (Figura 3A).
A
, en normoxia, la transfección de imitador -210 aumenta significativamente la producción de superóxido a las 48 horas, medido por tinción MitoSOX. Imágenes representativas de-210 imitan las células transfectadas se muestran en los paneles superiores y la media ± s.e.m. de aproximadamente 300 células se muestran en los paneles inferiores (***, p & lt; 0,001).
B
, la exposición de las células a 0,1% de oxígeno durante 48 horas aumenta la producción de superóxido; este efecto se revirtió casi completamente tras la transfección de anti-210. Imágenes representativas de miR-210 transfectadas se muestran en los paneles de la izquierda y la media ± s.e.m. de aproximadamente 300 células se muestran en los paneles de la derecha (***, p & lt; 0,001).
C
, la producción de ROS inducida por la mímica-210 es inhibida en las células MCF7 por cotrasfection con el plásmido que expresa ISCU2. Media ± s.e.m. de aproximadamente 300 células se muestra (*** p & lt; 0,001). Bares = 10 micras.
En la hipoxia hemos observado un aumento muy significativo de la producción de superóxido, que fue casi completamente invertida por el anti-210 (Figura 3B). Además, la transfección del constructo ISCU2 invierte casi por completo los radicales libres inducida por el miR-210 (Figura 3C). Esto demuestra un nuevo mecanismo importante para la regulación de ROS en la hipoxia, y que no es un efecto pasivo de la reducción de la disponibilidad de oxígeno.
Efectos de miR-210 en la apoptosis y la supervivencia en normoxia e hipoxia
estudios anteriores en la levadura han demostrado las consecuencias letales de la eliminación homólogos ISCU [23]. Esta noción nos llevó a investigar los efectos de miR-210 en la apoptosis en normoxia e hipoxia. Hubo una notable diferencia en los efectos de miR-210 en estas condiciones opuestas. En normoxia, mímica-210 aumentó considerablemente la apoptosis medido por tinción con anexina V, pero en la hipoxia, el antagonismo de miR-210 aumentó la apoptosis (Figura 4A).
Un
, la apoptosis (anexina V + células) se midió en MCF7 (
izquierda) y HCT116 (
derecha) las células tratadas con el miR-210 o el inhibidor de la mímica, después de 48 horas de exposición a 0,1% de oxígeno o de normoxia. Media ± s.e.m. es representativa de 3 experimentos independientes (* P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
B Opiniones, después de la transfección de células MCF7 con LNA revueltos o miR-210 LNA y expuestos a 0,1% de oxígeno o de normoxia (48 horas), fueron re-chapada las células (100 y 500 células /pocillo). Después de una incubación de 12 días, las colonias se fijaron, se tiñeron, y las fracciones supervivientes se calcularon en base a la eficiencia de plaqueo.
C
, se calcularon las fracciones supervivientes como en (
B Opiniones) en células HeLa, que fueron transfectadas con anti-ctrl o anti-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, EE.UU.) y se expusieron a 0,01% de oxígeno o normoxia. En todos los ensayos de colonias, con una media ± s.e.m. es representativo de 2 experimentos independientes realizados por triplicado empleando 2 densidades diferentes de chapado. (** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
D
, RT-PCR para ISCU y miR-210 en xenoinjertos U87 tratados con la terapia antiangiogénica (bevacizumab). expresión relativa de ISCU normalizó a ß-actina, miR-210 normalizaron a tres controles pequeños nucleolares, RNU43, RNU44 y RNU48. la expresión significa ± s.e.m. en 4 animales /grupo se muestra (** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
Para evaluar los efectos de miR-210 en la proliferación celular bajo condiciones de hipoxia, se utilizó un ensayo clonogénico con un antagonista de ácido nucleico bloqueado (LNA) molécula de miR-210 (Figura 4B). Aunque la mayor parte de la reducción de la clonogenicidad en la hipoxia es claramente a través de otros mecanismos, los efectos de la anti-210 dio lugar a disminución de la supervivencia clonogénica en la hipoxia, que también encontramos en una línea celular más hipoxia resistente, las células HeLa (Figura 4C).
en la supresión in vivo de ISCU por la hipoxia y la importancia clínica de expresión ISCU
Hemos investigado si la expresión de la expresión génica ISCU estaba regulado in vivo, mediante el estudio de xenoinjertos de tumores humanos. Los xenoinjertos de la línea celular de glioblastoma U87 se trataron con el inhibidor de VEGF Avastin (bevacizumab), o con el control del vehículo. La inmunohistoquímica de estos tumores demostró necrosis Avastin inducida, la expresión de HIF1α y el HIF genes diana CA9 y VEGF (datos no mostrados). Se analizó el ARNm de los tumores y encontramos marcada regulación al alza de miR-210 y la regulación negativa recíproca de ISCU ARNm (Figura 4D).
Los únicos datos disponibles para la comparación de miR-210 con ISCU ARN en muestras de tumores humanos es de nuestro pecho y de cabeza y cuello serie. Se observó una relación inversa altamente significativa de miR-210 a ISCU expresión en 216 pacientes con cáncer de mama (rho = -0,39, p & lt; 0,001) (Figura 5A,
la izquierda). Hubo una correlación inversa altamente significativa de ISCU con tumores más agresivos de alto grado (p = 0,008) y una baja supervivencia libre de recidiva (Figura 5A,
derecha). En un análisis multivariado, ISCU siguió siendo significativa (p = 0,028), junto con los nodos, grado y edad (cuadro justificante S2). En otras 2 series de cáncer de mama (Rotterdam [26], 286 casos: Uppsala [27]; 235 casos) bajo ISCU era un factor de mal pronóstico en el análisis multivariante (Defensa de los cuadros S3 y S4) (p = 0,038 y 0,015, respectivamente). En la serie de Uppsala [27] podríamos evaluar el precursor miR-210 utilizando las sondas de Affymetrix (Affymetrix U133b, 230710_at) y esto también mostró una relación inversa del precursor a ISCU y pobre supervivencia (Figura 5B). En nuestra serie cáncer de cabeza y cuello [25], existe una relación inversa de estas variables (Figura 5C,
la izquierda). En una serie publicada con el seguimiento, Chung et al [28], hubo una fuerte asociación de ISCU suprimida con un mal resultado (Figura 5C,
derecha). Análisis de la expresión en tejidos normales frente a tejidos tumorales en los conjuntos de datos 9 tumorales utilizando Oncomine mostró en todos los estudios de supresión en comparación con los tejidos normales (que apoya figura S4).
Un
, miR-210 qPCR expresión (DDCT) representa como una función de la expresión de ARNm ISCU (arrays) de Illumina en la serie cáncer de mama Oxford (
la izquierda), y, la supervivencia libre de recidiva en las muestras con alta y baja ISCU dividida por ISCU mediano en el Oxford serie cáncer de mama (
derecha).
B
, la expresión de ARNm de la transcripción que aloja el precursor miR-210 representa como una función de la medida de la expresión de mRNA ISCU por Affymetrix U133A U133b y respectivamente en la serie de cáncer de mama Uppsala (
izquierda
), y la supervivencia libre de recaída para muestras con alta y baja ISCU ISCU dividido por la mediana de la serie cáncer de mama Uppsala (
derecha).
C
, la expresión de miR-210 qPCR (DDCT) representa como una función de la expresión de ARNm ISCU (Affymetrix arrays) en la serie cáncer de Oxford-Manchester CECC donde ISCU se encontró inicialmente asociado a la hipoxia (
la izquierda), y la supervivencia libre de recaída para muestras con alta y baja ISCU ISCU dividido por el valor de la mediana en el Chung et al. serie CECC (
derecha).
Discusión
Nuestros estudios muestran claramente el miR-210 regula la expresión de ISCU ARN y proteínas utilizando la mímica en normoxia en el cáncer líneas celulares. ISCU ARNm y proteínas fueron suprimidas en condiciones de hipoxia y este efecto se invirtió significativamente por anti-210. La reversión incompleta implica otros mecanismos también están involucrados en la regulación negativa ISCU y es bien sabido que la traducción del ARN se reduce por la hipoxia a través de la respuesta a proteínas desplegadas [29].
Una disminución en ISCU podría poner en peligro la capacidad de las células generar Fe-S racimos y impactaría posteriormente en la actividad de las enzimas que requieren estos restos co-factores. Hemos demostrado que la aconitasa, una enzima clave del metabolismo intermediario que requiere Fe-S, las agrupaciones, había disminuido la actividad después de la reducción ISCU. De especial relevancia para el cáncer es el doble papel de la aconitasa como IRP1 cuando carece de su cúmulo de Fe-S. IRP1 regula la estabilidad y la traducción del ARNm para la transferrina y ferritina [24]. Los efectos de la pérdida de la aconitasa sería modificar el metabolismo del hierro y aumentar su captación, que es fundamental para el crecimiento tumoral. De hecho, se observó una acumulación de hierro intracelular después de la transfección de las células con mímica-210 o siISCU.
Las mutaciones en ISCU dar lugar a acidosis láctica en los individuos después de ejercicio moderado, que proporcionan una fuerte evidencia de la importancia de este objetivo en el mantenimiento de la actividad del ciclo de Krebs eficiente [30], [31]. Un efecto asociado de los niveles ISCU disminuido y la posterior disminución de la actividad del ciclo de Krebs era un interruptor para la glucólisis y el aumento de la producción de lactato. Este fue inducida en normoxia por miR-210 y de este modo es similar al efecto Warburg. Esto puede ser relevante en situaciones en las que el miR-210 se produce la regulación al alza en normoxia. Por ejemplo, esto se ha demostrado en líneas celulares de cáncer renal con mutaciones en la proteína de von Hippel Lindau [14]. Por el contrario, en la hipoxia, anti-210 reduce la producción de lactato, revirtiendo el efecto Pasteur (cambia a la glucólisis en hipoxia).
Clústeres de hierro-azufre son esenciales para la actividad eficiente de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. Hemos demostrado que la actividad del complejo I se reduce en condiciones de hipoxia y después de la transfección de imitador-210 en normoxia. Además de Complejo I, II y III Complejos también contienen Fe-S, las agrupaciones y se especula que las actividades de los tres complejos se podrían reducir de una manera dependiente de miR-210. Una cadena de transporte electrónico deteriorada conduciría a un aumento de la producción de radicales libres como consecuencia de la fuga de electrones. En particular, el complejo III es un importante contribuyente a ROS en la hipoxia [32] y complejo I y II contribuyen aproximadamente el 30% de la ROS [33]. En condiciones de normoxia, la transfección de mímica-210 dio lugar a una mayor producción de radicales libres. Por otra parte, la producción de ROS normoxia observada con mímica-210 se impidió casi por completo con una construcción resistente ISCU miR-210. Por el contrario, en la hipoxia, se observó que la inducción de miR-210 se asoció con un aumento de ROS, y esto podría ser casi completamente revertido por anti-210. Esto proporciona un importante nuevo enlace para explicar el mecanismo de inducción de ROS en la hipoxia, que se ha informado por diversos grupos [33] y puede dar cuenta de la mayoría de los hipóxico ROS inducción. El ROS liberado en la hipoxia se han demostrado que funcionan como O
2 sensores, en calidad de agentes que activan HIF [32] de señalización, de mediar el crecimiento del tumor in vivo a través de un mecanismo dependiente de HIF [5] y extender la vida útil de las células [34] .
a diferencia de la inducción hipóxica de ROS y el alivio con anti-210 observada en nuestro estudio, Chan et al. no pudo medir cualquier cambio significativo en la producción de ROS después de la exposición a la hipoxia, y mostró una tendencia invertida cuando miR-210 se inhibió [20]. La razón de esta discrepancia no está clara, pero puede reflejar una diferencia de potencial subyacente de cáncer en comparación con las células endoteliales normales.
Finalmente, se analizó si existía alguna asociación de ISCU regulación a la baja en los cánceres humanos primarios con la hipoxia y el resultado, y encontrado un fenotipo agresivo se asoció con este cambio en los estudios de más de 1000 pacientes, y regulación a la baja en comparación con los tejidos normales en muchos tipos de tumores.
en conclusión, hemos encontrado un nuevo mecanismo importante para la respuesta de las células cancerosas a hipoxia, coordinado por el miR-210 supresión de ISCU y la consiguiente disminución de la actividad de las proteínas hierro-azufre grupo de apoyo (Figura S5). Además de la aconitasa, muchas enzimas metabólicas requieren Fe-S, las agrupaciones para su actividad que sugiere que la regulación a la baja de ISCU tendría consecuencias de gran alcance en el metabolismo celular. Las mutaciones en muchas de estas Fe-S enzimas racimo incluyendo succinato deshidrogenasa subunidades SDHD, SDHB y SDHC [35] y fumarato hidratasa [36] están implicados en trastornos hiperproliferativos y cáncer, lo que demuestra una importante relación entre el metabolismo celular y la posterior transformación y destaca un papel de HIF, a través de un eje de miR-210-ISCU en estos procesos. Además de las enzimas metabólicas, varias enzimas de reparación del ADN [37] con Fe-S, las agrupaciones son objetivos potenciales. Hemos demostrado anteriormente miR-210 se puede detectar en un nivel elevado en el suero de pacientes con cáncer [38] por lo que será de interés si reflejan el estado metabólico de su cáncer primario y por lo tanto podrían ser utilizadas en el futuro selección de la terapia. La regulación de las vías biológicas distintas por ISCU regulación a la baja sugiere un enfoque terapéutico potencial de letalidad sintética mediante el cual los medicamentos que median el daño del ADN reparado por el cluster hierro-azufre que contiene helicasas Rad3 [39] o la anemia de Fanconi [37] podría ser el uso en sinergia con los inhibidores de PARP o inhibidores de la glicólisis [36] y glutaminolysis en el subgrupo de pacientes con altos niveles de miR-210.
Mientras este trabajo estaba en preparación, se validaron tres nuevos miR-210 objetivos, es decir, HOXA1, Hoxa9 y FGFRL1 y el análisis de xenoinjertos de tumores derivados de líneas celulares de cáncer que sobreexpresan el miR-210 sugiere una posible participación de miR-210 en la iniciación del crecimiento del tumor [40].
Materiales y Métodos
cultivo celular
exposición de la célula a la hipoxia (1%, o 0,1%, o 0,01% de oxígeno) se llevó a cabo en un incubador de hipoxia (MiniGalaxy a, RS Biotech, Escocia, Reino Unido), utilizando un flujo continuo de una atmósfera humidificada una mezcla de 95% N
2 y 5% de CO
2.
miARN transfección imitan o inhibidor
la transfección se realizó con Dharmacon anti-210, miR-210, o oligos de control mímicos (Thermo Scientific, CO, EE.UU.), a una concentración final de 20 nM, utilizando un medio libre de suero y reactivo Optimem Oligofectamine (ambos de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
transfección y luciferasa Los ensayos
plásmidos informadores de luciferasa que contenían 3 'no traducidas (UTR) de ISCU o secuencia genómica aleatoria (control) se obtuvieron a partir de aparamenta genómica (Menlo Park, CA. Un plásmido de expresión de luciferasa de Renilla (PRL-TK vector, Promega, Southampton, Reino Unido) se utilizó como control de transfección.
ensayos de actividad enzimática
actividad Aconitasa estaba usando el ensayo Bioxytech Aconitasa-340 (Oxis International Inc, Beverly Hills, CA). Los datos se presentan como% de la actividad en comparación con el control.
Las células se ensayó la actividad de Complejo I utilizando el Complejo I Mitoprofile rápido Kit ELISA (MitoSciences, Eugene, Oregón, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los datos se presentan como% de la actividad en comparación con el control.
mediciones de lactato y piruvato
El lactato y piruvato se analizaron utilizando kits de Instruchemie (Delfzijl, Países Bajos).
MitoSOX tinción
dismutasa mitocondrial se ensayó usando MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.). Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal (Resplandor de 2000, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Reino Unido), y se analizaron como se ha descrito anteriormente [41].
La expresión génica de minería de datos
previamente derivamos un MetaGene hipoxia en la cabeza primaria y el cáncer de cuello carcinoma de células escamosas [CECC] [25]. Grupos de genes anti-correlacionada con la expresión de miR-210 se formaron como se describe anteriormente [25]; correlación de Spearman se utilizó para identificar los genes significativamente correlacionados anti-miR-210 y la tasa de falso descubrimiento (FDR) se estimó utilizando un método basado en la permutación [42]. Los genes con FDR & lt; 0,05 fueron seleccionados. También utilizamos 5 algoritmos de predicción de destino: - TargetScanHuman (http://www.targetscan.org/); PicTar [43]; Miranda (http://microrna.sanger.ac.uk/); DianaLab (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (http://mirdb.org/miRDB/).
Los análisis de supervivencia y otros análisis estadísticos
correlación de Spearman se utilizó para las variables continuas y la prueba Wilcox para las variables categóricas.