Extracto
plasma, el cuarto estado de la materia, se define como un gas ionizado parcialmente o por completo que incluye una mezcla de electrones y de iones. Los avances en la física del plasma han hecho posible el uso de plasma a presión atmosférica no térmico (NTP) en la investigación del cáncer. Sin embargo, los estudios anteriores se han centrado principalmente en la muerte de las células cancerosas por apoptosis mediada por NTP como una terapia potencial de cáncer. En este estudio, se investigó el efecto de NTP en la invasión o metástasis, así como el mecanismo por el cual plasma induce propiedades anti-migración y anti-invasión en las líneas humanas de células de cáncer papilar de tiroides (BHP10-3 y TPC1). La cicatrización de heridas, desplegable, y los ensayos demostraron que Transwell NTP reduce la migración celular y la invasión. Además, NTP indujo cambios morfológicos y reordenamientos del citoesqueleto, tal como se detecta por microscopía electrónica de barrido y inmunocitoquímica. También se examinaron las metaloproteinasas de la matriz (MMP) -2 /-9 y activador plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) la actividad usando zimografía de gelatina, los ensayos de uPA y RT-PCR. FAK, Src, y paxillin expresión se detectó mediante análisis de Western blot e inmunocitoquímica. NTP disminuyó FAK, Src, y la expresión paxillin, así como la actividad de MMP /UPA. En conclusión, NTP inhibe la invasión y la metástasis de las células BHP10-3 y TPC1 por la disminución de las actividades de MMP-2 /-9 y uPA y reordenando el citoesqueleto, que está regulada por el complejo FAK /Src. Estos hallazgos sugieren nuevas acciones para NTP y pueden ayudar en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer localmente invasivos y metastásicos
Visto:. Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim Ki, Seo SJ, Yang SS, et al. Cancer Cell (2014) no térmica Presión atmosférica inhibe la invasión de plasma papilar de tiroides a través de la modulación del citoesqueleto, alterado MMP-2 /-9 /UPA actividad. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10.1371 /journal.pone.0092198
Editor: Jian Cao, Universidad de Stony Brook, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Noviembre 2013; Aceptado: 19 Febrero 2014; Publicado: 25 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Bio & amp; Programa de Desarrollo de Tecnología Médica de la NRF financiado por el gobierno de Corea (2012M3A9B2052870). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Keunho Lee es el director general de PSM America Inc., dedicada como consulta técnica en el dispositivo, y esto no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
carcinoma papilar de tiroides es una de las neoplasias más comunes en todo el mundo y, en general muestra el carácter indolente [ ,,,0],1]. Sin embargo, a veces puede ser agresivo, con la extensión extracapsular, el músculo de la correa, el nervio laríngeo recurrente, y la invasión de la tráquea, así como la metástasis a los ganglios linfáticos. En casos raros, el cáncer papilar de tiroides puede hacer metástasis al pulmón o el hueso [2], [3]. La presencia de metástasis locales o distantes afecta la recurrencia del tumor, las tasas de supervivencia de los pacientes, y la calidad de vida, lo que conduce a un mal pronóstico [4]. Por lo tanto, es necesario descubrir nuevos maneras de prevenir las características agresivas de la invasión y metástasis en el cáncer papilar de tiroides.
medicina de plasma es un campo en rápido crecimiento que implica una novedosa modalidad de tratamiento [5], [6]. Diferentes fuentes de plasma y dispositivos de plasma se utilizan para varias indicaciones, incluyendo la desinfección [7], cicatrización de heridas [8], coagulación de la sangre [9], y la muerte de células de cáncer [10]. Además, los avances tecnológicos han permitido la generación de plasmas a temperatura ambiente y presión atmosférica (plasma no térmico presión atmosférica, NTP) [10] - [12]. NTP se ha informado que tienen actividades anti-cáncer en diferentes tejidos, incluyendo el cáncer de pulmón [5], el cáncer colorrectal [10] - [12], y melanoma [13], lo que sugiere una nueva modalidad terapéutica anti-tumor. Además, nuestro grupo demostró previamente que NTP induce una detención del crecimiento y la invasión tumoral retrasado en células de cáncer colorrectal [10], [11]. Sin embargo, el mecanismo de lucha contra el cáncer de NTP se ha centrado principalmente en los mecanismos relacionados con la apoptosis con el aumento de las especies reactivas del oxígeno o el desequilibrio redox [14].
Tumor invasión a los tejidos circundantes o metástasis a órganos distantes es la causa predominante de mortalidad en pacientes con cáncer [15]. Por lo tanto, se ha puesto énfasis en la inhibición de la invasión del cáncer y la metástasis. Muchas líneas de evidencia demuestran que un complejo proceso de pasos interdependientes, incluyendo la migración celular, invasión, adhesión a la superficie, y la degradación de la matriz extracelular (ECM), está estrechamente relacionada con la invasión tumoral y /o metástasis y está regulado por mecanismos muy complicados [ ,,,0],dieciséis]. Anteriormente, hemos sugerido que el tratamiento NTP disminuyó la migración celular y la invasión de células de cáncer de colon [10]. Sin embargo, los mecanismos implicados en la inhibición inducida por plasma de la migración celular y la invasión no se entienden completamente.
El propósito de este estudio fue explorar los efectos inhibidores de NTP en la migración y la invasión de células de cáncer de tiroides humana líneas. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que evalúa el efecto anticancerígeno de NTP en la migración celular y la invasión asociado con la modulación del citoesqueleto y los cambios de las metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 /-9 /tipo uroquinasa activador del plasminógeno (uPA actividades).
Materiales y Métodos
líneas celulares y reactivos
las líneas celulares de carcinoma papilar de tiroides humana y BHP10-3 TPC1 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas , VA, EE.UU.). La línea celular normal de la tiroides Nthy-ori 3-1 fue amablemente presentado por el prof. Minho Song (Universidad Nacional de Chungnam, Corea). BHP10-3 y Nthy-ori 3-1 células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.), mientras que las células TPC1 se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco mezcla de nutrientes /Ham F-12 (DMEM /F12; Gibco ), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U /ml de penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO
2 bajo condiciones de humedad.
especificaciones de los sistemas experimentales
Tal como se describe anteriormente [11], hemos diseñado y fabricado una forma de aerosol NTP sistema con una placa sin arco y antiestático de nuevo diseño que proporciona un chorro de plasma uniforme para aplicaciones de investigación biomédica. Este sistema muestra una alta eficiencia para la modificación de la superficie de bio-muestras a bajas temperaturas, lo cual es crítico para experimentos biológicos
.
Las especificaciones técnicas del sistema de plasma ( "antorcha con forma de aerosol") se muestran en las figuras . 1A y B. Las especificaciones de la fuente de alimentación para este sistema son 2 mínimo kV, 13 kV máximo, y una frecuencia media de 20 a 30 kHz; estas especificaciones pueden variar con el tipo y la cantidad de gas utilizado. En este estudio, el helio (He) y oxígeno (O
2) se utilizaron como gases portadores porque previamente se encontró que la adición de O
2 a un plasma Se mejoró la eficiencia de inhibición de las células del cáncer [10]. Los espectros de emisión del plasma de acuerdo con la potencia utilizada en este estudio (2 o 4 kV) se muestra en la Fig. 1B.
(B) los espectros de emisión óptica de la Él y O plasma mezcla de gas
2 de acuerdo con la intensidad eléctrica (2 o 4 kV) en el intervalo de 280-920 nm. (C) Imagen de la "antorcha con forma de aerosol" chorro de plasma con Él y O
2. El plasma visible tenía una longitud de aproximadamente 2,5 cm que varió con el flujo de gas y voltaje.
microscopía electrónica de barrido (SEM)
Para SEM, las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio y fijo durante 1 h a temperatura ambiente en 4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,2). Los cubreobjetos se procesaron tal como se describe anteriormente [17]. Las células fueron examinadas utilizando un microscopio electrónico de barrido. (S-4800; Hitachi, Tokio, Japón) que opera a 10 ó 15 kV
citoesqueleto tinción
Las células fueron cosechadas y re-chapada en fibronectina cubreobjetos recubiertas. Después de 24 h, las células se fijaron durante 20 min en 3,7% de formaldehído y re-hidratado en PBS con 0,1% de Triton X-100. Después de bloquear durante 45 min con PBS que contenía BSA al 5%, los portaobjetos se incubaron con faloidina de Texas-Red-conjugado (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Hoechst 33258 se añadió a contrateñir los núcleos. Los portaobjetos se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).
desplegables ensayos (RhoA, Rac1, Cdc42 y ensayos de activación GTPasa) guía
A fin de determinar el efecto de NTP en los cambios morfológicos que afectan la migración celular, un kit de RhoA /Rac1 /Cdc42 Ensayo de activación Combo Biochem (Citoesqueleto Inc., York, Reino Unido) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 600 g de proteína total. En resumen, perlas de afinidad dominio efector Rhotekin-RBD se utilizan para obligar a RhoA activa, y perlas de afinidad dominio PAK-PBD efector se utilizaron para obligar a Cdc42 activa y Rac1. Después de la incubación durante 2 h, las proteínas se eluyeron con tampón de Laemmli y se separaron en 12% de acrilamida /bis-acrilamida geles. Los controles negativos y positivos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para confirmar la presencia de GTPasas en los extractos de proteínas de células, 5% de los controles de entrada también se corrieron en los geles. Los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se incubaron durante la noche con anticuerpos contra Cdc42, Rac1 y RhoA (incluido en el kit) con agitación suave. Las proteínas se detectaron utilizando un kit de transferencia de Western aumento de quimioluminiscencia.
herida ensayos
Para los ensayos de migración celular, se sembraron células en placas de cultivo de 12 pocillos de curación a una densidad de aproximadamente 1 x 10
5 /pocillo y se cultivaron hasta confluencia. Los ensayos de curación de heridas se realizaron como se describe anteriormente [10]. En resumen, la monocapa se rascó con una punta de pipeta estéril, seguido de un lavado extensivo para eliminar los desechos celulares. Las células fueron expuestas a gas (Él o O
2 solamente), 2 o 4 kV de NTP, respectivamente, durante 1 s. proporciones de curación de heridas fueron documentadas por la fotografía después de 24 h desde los tiempos de duplicación de BHP10-3 y TPC1 fueron 30,0 ± 1,2 hy 29,7 ± 0,8 h, respectivamente. Los tiempos de duplicación se calcularon a partir de la curva de crecimiento de las células durante tres días como sigue: (t
2: tiempo final, t
1: tiempo inicial, q
2: el número de células final, q
1 : número de células inicial)
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de lisis que contiene NaCl 150 mM, 1,0% NP-40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS, Tris 50 mM ( pH 8,0), y el cóctel inhibidor de proteasa (pH 7,4; Roche Ciencias Aplicadas, Viena, Austria) como se ha descrito anteriormente [18]. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el Western Blot: anti-quinasa de adhesión focal (FAK), -Src, -Paxillin, -extracellular quinasa regulada por señales (ERK), -Akt, y -α-tubulina (1:1000; Cell Signaling Technology , Danvers, MA, EE.UU.).
inmunocitoquímica
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de microscopio (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EE.UU.) y se trató con gas (He + O
2 ) solamente, 2, o 4 kV de NTP, respectivamente. Después de 24 h, los portaobjetos se lavaron con PBS, se fijaron durante 20 minutos en 3,7% de formaldehído, y re-hidratados en PBS. Después de bloquear durante 45 minutos en BSA (en 5% PBS), los portaobjetos se incubaron durante 1 h con conejo policlonal de anticuerpos anti-p-FAK y-paxillin (01:50; Cell Signaling Technology), se lavó con PBS, y se incubaron durante 45 min con anticuerpos anti-conejo de cabra Alexa 488 marcado con (1:250; Molecular Probes). Después de enjuagar en PBS, se añadió Hoechst 33258 durante 15 min para contrateñir los núcleos. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se montaron con Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) después se analizó mediante microscopía de fluorescencia (Carl Zeiss).
Invasion (Transwell) ensayos
transwell (24 pocillos) cámaras (Costar, Cambridge, MA, EE.UU.) se utilizaron para evaluar la invasión de células de acuerdo con el tratamiento NTP como se describe anteriormente [10]. Inicialmente, la fibronectina (2 g /filtro) se disolvió en 100 l de MEM y se vierte en la parte superior del filtro de polietileno (tamaño de poro, 8 micras) .Los pocillos se recubrieron durante la noche en una campana de flujo laminar.
a continuación, 10
5 células (en 100 l de medio de crecimiento) se añadieron a la parte superior del filtro en el pocillo superior. La cámara se incubó durante 24 h en 5% de CO
2 a 37 ° C. Por último, las células unidas en la parte inferior se tiñeron con H & amp;. E, y se contaron usando microscopía de luz
transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
El ARN total fue extraído a partir homogeneizada las células usando el reactivo Trizol (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.). se utiliza para invertir-transcribir RNA ReverTraAce qPCR RT mezcla maestra (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japón). El ARN total (1 g) se mezcló con 10 g de la mezcla. La transcripción inversa se realizó y se sintetizó ADNc. El cDNA se añadió a una mezcla de Taq Quick SA DyeMix (Toyobo Co. Ltd.) y los cebadores específicos, y amplificado utilizando un T100 ™ Thermal Cycler (Bio-Rad, Waltham, MA, EE.UU.). La metaloproteinasa de matriz (MMP) -2 y MMP-9 secuencias de los cebadores fueron: MMP-2-F, 5'-ACC TGG ATG CCG TCG TGG AC-3 '; MMP-2-R, 5'-TGT GGC AGC ACC AGG GCA GC-3 '; MMP-9-M, 5'-GGG GAA GAT TCG TCG GTT CA-3 '; y MMP-9-R, 5'-GGT CCC GGG AGT GAT TTA CA-3'.After desnaturalización durante 3 min a 94 ° C, las muestras se amplificaron durante 35 ciclos de 30 s a 94 ° C, 60 ° C, y 72 ° C, con una extensión de 5 min a 72 ° C. Los productos se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y se detectaron mediante luz ultravioleta (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Zymography
MMP-2 /-9 actividad fue ensayada utilizando zimografía de gelatina como se describe anteriormente [19]. células BHP10-3 y TPC1 fueron tratados con gas (He + O2), 2, o 4 kV de NTP para 1 s, y se incubaron durante 24 h adicionales. El sobrenadante (100 l) de cada muestra se mezcló con 1 l de 100 mM de acetato de 4-aminofenilmercúrico, y las muestras se activa durante 1 h a 37 ° C. A continuación, cada muestra se colocó en tampón de muestra durante 10 min y a electroforesis en geles de poliacrilamida en 125 V durante 120 minutos a 4 ° C utilizando un sistema Novex Xcell II (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los geles se incubaron en tampón de renaturalización de 60 min a temperatura ambiente, seguido de incubación durante 18 h en 100 ml de tampón de desarrollo a 37 ° C con la luz de agitación. Los geles se tiñeron durante 3 h con azul brillante de Coomassie. Después de la decoloración en 400 ml de metanol, 100 ml de ácido acético y 500 ml de agua destilada, se tomaron imágenes usando un analizador de imágenes.
activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) ensayos
BHP10-3 y TPC1cells (3000 células /pocillo) se añadieron a placas de 96 pocillos en medio completo que contenía 10% de FBS. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con gas (He + O
2) solamente, 2, o 4 kV de NTP, respectivamente. Las placas se incubaron entonces durante otras 24 h. Después las células se procesaron como se describe anteriormente [19]. Brevemente, las células se lavaron con DMEM carente de rojo de fenol y se colocan en 200 l de tampón de reacción que contiene 50% (v /v) de 0,05 U /plasminógeno ml en DMEM (sin rojo fenol), 40% (v /v) de 50 mM tampón Tris (pH 8,2), y 10% (v /v) de 2,25 mM cromozima PL en glicina 100 mM. Las mezclas se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en 5% de CO
2. La absorbancia a 405 nm se midió utilizando un lector de placas espectrofotométrico automatizado.
análisis estadísticos
Una forma de análisis de varianza (ANOVA) después de la prueba de Tukey post hoc se realizaron con SPSS 20,0 software estadístico ( SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Los parámetros de los datos de tres experimentos independientes se expresan como la media ± S.D. Un
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo (*
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P
. & lt; 0,001)
Resultados
NTP induce cambios en la morfología celular en las células del cáncer de tiroides papilar humanos
las células supervivientes que se adhirieron a la superficie después del tratamiento mostraron una NTP morfología diferente (Fig. 2A y B). células papilares de tiroides normalmente crecen en un patrón aplanado, que se caracteriza por muchas proyecciones citoplasmáticas (lamellipodia y filopodios) [20]. Después del tratamiento NTP, las células muestran una morfología muy diferente que se caracteriza por un aspecto más pequeño y contraído, y la disminución de microspikes citoplásmicos resultantes en la celda restringida la difusión (Fig. 2A).
(A) Después del tratamiento con gas ( él + o
2) solamente, 2 o 4 kV de NTP durante 1 s, respectivamente, las células se incubaron durante 24 h. La morfología de las dos líneas celulares se examinó luego por microscopía de luz. En los grupos tratados solamente con el control y el gas, las células fueron plana y alargada, con lamelipodia (asterisco) y filopodios (flecha) que estableció contactos célula-célula lateralmente. Por el contrario, las células tratadas con NTP mostraron cambios morfológicos que se caracterizan por un citoplasma contratado, inhibieron el contacto célula a célula, y abrogadas proyecciones citoplasmáticas (lamellipodia y filopodios). imágenes (B) SEM confirmaron el efecto de NTP en la morfología celular. El citoplasma de las células tratadas con NTP mostró contracción y una pérdida de polarización horizontal y protuberancias citoplasmáticas. Por otra parte, la superficie de las células tratadas con el plasma era más duro que el de las células tratadas sólo-control y gas. Se llevaron a cabo (C) ensayos de inmunofluorescencia utilizando faloidina de Texas-Red-conjugado para visualizar el citoesqueleto (actina F); Hoechst 33258 se utiliza para etiquetar núcleos celulares. En las células tratadas de control y de gas, se formaron haces contráctil de actina (fibras de estrés) y una malla de filamentos de actina diagonal. Sin embargo, en los grupos tratados con NTP, los filamentos de actina se distribuyeron en el citoplasma contraído la destrucción de la arquitectura del citoesqueleto, y no se observó la formación de fibras de estrés marcada. Barra de escala = 50 micras. Cada figura fue representativos de tres experimentos con los triplicados.
micrografías electrónicas de barrido de las dos líneas celulares confirmaron las conclusiones anteriores que controlan y sólo las células tratadas con gas mostraban características mesenquimales-como con muchas proyecciones citoplasmáticas. Por el contrario, las células tratadas con NTP tenían cuerpos celulares más compactas y superficies celulares en bruto en la que los procesos citoplásmicos que sobresalen aparentemente se redujo (Fig. 2B).
NTP induce una arquitectura citoesquelética dysregulated en células de cáncer papilar de tiroides humana
se utilizó inmunocitoquímica contra los filamentos de actina intracelular con tinte conjugado-faloidina y se encontró que la estructura del citoesqueleto de actina de las células tratadas con plasma se modificó. En el control y las células de gas tratado, se observaron haces contráctiles de actina (fibras de estrés) y una malla de filamentos de actina diagonal. Sin embargo, los filamentos de actina se distribuyeron en el citoplasma contraído, destruyendo así la arquitectura del citoesqueleto, y no se observó la formación de fibras de estrés marcada en las células tratadas con NTP (Fig. 2C).
NTP inhibe la actividad de Rho GTPasas (RhoA, Rac1 y Cdc42,) guía
La familia Rho GTPasas es bien conocido por su participación en las funciones celulares tales como la polaridad celular, la formación lamelipodia o filopodios, y la migración celular. Por lo tanto, se investigó el efecto de NTP en la familia Rho actividad (RhoA, Rac1, y Cdc42). Como se muestra en la Fig. 3, el tratamiento NTP significativa disminución de las formas activas de RhoA y Rac1.
familia Rho (Rho, Rac1, Cdc42 y) se evaluó la actividad usando los kits de detección desplegables después de la exposición a gas (He + O
2) solamente, 2 o 4 kV de NTP durante 1 s. tratamiento de las células NTP BHP10-3 y TPC1 redujo significativamente la expresión de GTP-RhoA y Rac1 GTP-(las formas activas de estas proteínas). Cada figura fue representativos de tres experimentos con los triplicados.
NTP inhibe la migración celular a través del complejo FAK /Src en células de cáncer papilar de tiroides humana
Para investigar si NTP reduce la migración de las células tumorales, se llevaron a cabo ensayos de cierre de la herida cero. Como se muestra en la Fig. 4A y B, nuestros resultados demuestran que el tratamiento de plasma suprimió significativamente la migración de BHP10-3 (
P
& lt; 0,01) y TPC1 (
P
& lt; 0,001) de las células a través de la zona desnuda. El porcentaje de inhibición de la migración celular era 48,2 y 55,4% en BHP10-3 células y 63,6 y 84,1% en TPC1 células después de 24 h de incubación con 2 y 4 kV de NTP, respectivamente, en comparación con las células control. sólo el gas de tratamiento no afectó significativamente la migración celular en ambas líneas.
células (A) y BHP10-3 TPC1 se sembraron en placas de 12 pocillos, que se cultivan hasta la confluencia, y la monocapa fue herido con una punta de pipeta. La curación de heridas fue documentado por la fotografía después de 24 h de incubación. Barra de escala = 200 micras. (B) Cuantificación de la migración celular. El NTP inhibió significativamente la migración de BHP10-3 (
P Hotel & lt; 0,001) y TPC1 (
P Hotel & lt; 0,001) células en toda la zona desnuda. Los datos representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. NS: no significativo; **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
A fin de evaluar el efecto de NTP en la migración celular, se evaluó la proteína lisados para la fosforilación de FAK, Src, y paxillin, que son conocidos por su estrecha asociación con la migración celular, invasión, y el reordenamiento del citoesqueleto a través de la cinasa FAK /Src complejo [21]. Después del tratamiento NTP, se observó la inhibición de la fosforilación de FAK y una reducción consistente en la fosforilación de Src y paxillin, que son aguas abajo de FAK (Fig. 5A).
(A) Western Blot para p-FAK, p-Src, y p-paxillin. inmuno ensayo para (B) p-FAK y (C) p-paxillin. En las células tratadas de control y de gas, FAK se localiza en estructuras de adhesión pequeños en la periferia de la célula. Después del tratamiento NTP, la acumulación focal FAK se redujo significativamente en ambas líneas celulares. Por otra parte, la tinción de p-paxillin fue co-localizada con tinción p-FAK. NTP tratamiento también disminuyó la expresión de P-paxillin. Barra de escala = 50 micras. Cada figura es representativa de tres experimentos con los triplicados.
También se analizó la distribución intracelular de fosforilada (p) FAK y paxillin fosforilada (p). En las células tratadas solamente de control y de gas, p-FAK acumula en zonas bien definidas, incluyendo la periferia de la célula, mientras que después del tratamiento NTP, p-FAK tinción se redujo significativamente (Fig. 5B). Co-localización de las señales para p-paxillin y p-FAK se observó (Figs. 5B y C).
NTP inhibe la invasión de células por la disminución de MMP-2 /-9 y la actividad de uPA, y Akt y ERK de señalización en células de cáncer papilar de tiroides humanos
estudios anteriores han demostrado que FAK regula la invasión de células, así como la migración, la supervivencia y metástasis en una variedad de tipos de células, incluyendo el cáncer de tiroides [22], [23]. Para investigar si la NTP reduce la invasión tumoral, invasión ensayos se realizaron con cámaras Transwell y Matrigel. La invasión tumoral requiere la degradación de la membrana basal y ECM, extensión citoplasmática, y la migración celular. Transwell ensayos imitan este entorno para la invasión tumoral. Las células unidas en la parte inferior pasaron a través del filtro de la cámara, lo que indica las células invasoras. Como se muestra en la Fig. 6A, H & amp; células teñidas-E estaban presentes en la superficie inferior de la membrana 24 h después de la incubación. Sin embargo, el tratamiento de plasma inhibe significativamente el número de células invasoras en comparación con las células no tratadas (
P
& lt; 0,001). (Fig. 6B)
Se sembraron células (A) y BHP10-3 TPC1 en filtros (tamaño de poro, 8 m) recubiertas con Matrigel en el compartimiento superior y expuestos a He + o
2 de gas solamente, 2 o 4 kV de NTP para 1 s. Después de 24 h, se contaron las células en los poros o células unidas a superficie inferior de la membrana, y las células unidas a la sección inferior se tiñeron con H & amp; E y se contaron usando microscopía de luz (200 ×). Barra de escala = 100 micras. (B) Cuantificación de los datos de ensayo de invasión. tratamiento NTP redujo significativamente el número de BHP10-3 (
P
& lt; 0,001) y TPC1 (
P
& lt; 0,001) de las células que penetraron la membrana. Los datos representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
Para comprender el mecanismo por el que la invasión impactos NTP tumor
in vitro
, se realizó zimografía de gelatina para MMP-2 /-9 actividad. Nuestros resultados revelaron una notable reducción en la actividad de MMP-2 /-9 cuando las células BHP10-3 y TPC1 fueron tratados con NTP para 1 s (Fig. 7A). Para identificar aún más la influencia de NTP en MMPs, RT-PCR se utilizó para evaluar la expresión de ARNm de MMP-2 /-9. Como se muestra en la Fig. 7B, el tratamiento NTP inhibió marcadamente la expresión de mRNA de MMP-2 /-9. Estos hallazgos sugieren que la NTP inhibió la invasión de células por la disminución de la transcripción de MMP-2 /-9 y la inhibición de la actividad de la enzima existente. El NTP también inhibió la actividad de uPA como se ha demostrado mediante ensayos de uPA (Fig. 7C).
(A) zimografía de gelatina para la MMP-2 /-9. NTP atenúa la actividad enzimática de MMP-2 /-9 en ambas líneas celulares. (B) RT-PCR para la MMP-2 /-9. Los niveles de mRNA de MMP-2 /-9 disminuyeron después del tratamiento NTP tanto en las células. Cada figura fue representativos de tres experimentos con los triplicados. ensayos (C) AUP. tratamiento NTP disminuyó significativamente la actividad de uPA. Los datos representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes. NS: no significativo, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001. (D) de Western Blot. expresión ERK y Akt se redujo significativamente después del tratamiento NTP de una manera dependiente de la intensidad. Cada figura fue representativos de tres experimentos con los triplicados.
Por último, la expresión de la proteína de Akt y ERK se examinó mediante Western Blot. NTP tratamiento inhibe la expresión de Akt y ERK en ambas líneas celulares en comparación con el control o gas único grupo (Fig. 7D).
Discusión
Nuestros datos actuales indican que la NTP ejercieron un efecto anti-tumoral mediante la inhibición de la migración de células de cáncer y la invasión. NTP es una técnica prometedora y emergentes en la investigación del cáncer, y ya se ha informado de que los efectos anticancerígenos de NTP están mediadas a través de una detención del crecimiento y muerte celular [10], [11]. Sin embargo, el primer punto de contacto entre una NTP y las células es la membrana de la célula, que contiene diversas proteínas que realizan funciones dinámicas. Por lo tanto, en este estudio nos centramos en cambios en la apariencia de células que se produjeron en la superficie celular después del tratamiento NTP. Nuestros datos muestran que las células del cáncer de tiroides tratadas con plasma perdieron su, polarización horizontal plana en forma de huso y habían disminuido proyecciones citosólicas, que son importantes para la movilidad celular y la detección del medio ambiente, mientras que las células no mostraron apoptosis significativa por el tratamiento NTP (fig complementaria . S1). Estas protuberancias celulares basadas en actina, denominada lamelipodia (actina malla de filamentos) y filopodios (filamentos de actina radialmente orientados), son controladas por la familia Rho pequeñas proteínas de unión a GTP (Rho-GTPasas; RhoA, Rac1 y Cdc42) [24]. Estas proteínas altamente reguladas también controlan la polarización mesenquimales-como de las células y los reordenamientos del citoesqueleto, que son la primera etapa en la migración [24]. Se confirmó la inducción de cambios morfológicos de la NTP por medio de la tinción del citoesqueleto, que reveló reordenamiento de fibra de actina. En conjunto, nuestros datos migración y desplegable ensayo indican que el plasma inhibe eficazmente la migración de células BHP10-3 y TPC1, en relación por lo tanto los cambios morfológicos de células a reordenamiento del citoesqueleto.
FAK es una tirosina quinasa no receptora que se localiza en las adhesiones focales. FAK mRNA y expresión de la proteína se incrementa en la gran mayoría de tumores invasivos y metastásicos, incluyendo cáncer de tiroides humana [25]. Sin embargo, FAK es apenas detectable en los tejidos normales o tumores no invasivos [25] - [28]. Además, es una de las proteínas más prominente fosforilada en células de cáncer papilar de tiroides [29]. Los estudios han demostrado que FAK promueve la migración celular a través de la formación del complejo con Src, y la posterior fosforilación de la citoesqueleto paxillin molécula adaptadora por la FAK /Src complejo [30]. Además, paxillin está asociado con el efector Cdc42 /Rac objetivo, que puede enlazar Cdc42 y Rac a otras quinasas y objetivos de abajo [31], [32]. FAK también es conocido para regular la migración celular mediante la modulación de la montaje y desmontaje del citoesqueleto de actina a través de sus efectos sobre la subfamilia Rho de pequeñas GTPasas [33], [34]. Los resultados de este estudio están de acuerdo con estos estudios anteriores porque hemos encontrado que la migración celular NTP significativamente inhibido por la supresión de la expresión del complejo de señalización y paxillin FAK /Src, que están relacionados con la regulación del citoesqueleto.
Además de su papel bien caracterizado en la migración celular, la señalización de FAK está relacionada con la invasión tumoral por un número de mecanismos de [35], [36]. Por ejemplo, el sistema de MMP /UPA juega un papel importante en la degradación de ECM y es crucial para facilitar la migración y la invasión del tumor durante la metástasis [37]. Por lo tanto, se investigó el efecto de NTP en la invasión de células tumorales y el sistema de FAK y MMP /UPA. La relación entre la FAK y de la vía de MMP-2 /-9 se ha investigado anteriormente [22], [38]. inhibición FAK se ha demostrado para reducir la secreción de MMP-9 en células de carcinoma [39]. Además, la fijación de uPA al receptor del activador del plasminógeno uroquinasa activa la conversión de plasminógeno a plasmina. plasmina activada media la conversión de pro-MMP MMP. Por lo tanto, la inhibición de MMP /UPA está estrechamente relacionada con la invasividad reducida de las células cancerosas. En este estudio, los resultados con zimografía y RT-PCR indican que la disminución inducida por el tratamiento NTP en MMP-2 /-9 expresiones y sus actividades, también. Estos datos estaban de acuerdo con los estudios publicados previos en los que las expresiones de la pro-MMP-2 /-9 y sus actividades enzimáticas están estrechamente correlacionados con maligna y /o fenotipo metastásico del cáncer [40] - [42]. En conjunto, nuestros resultados actuales muestran que NTP disminuye eficazmente la invasión de células de cáncer a través del sistema /-9 /UPA MMP-2, que se asocia con Akt y ERK señalizaciones. Los datos anteriores revelan que el sistema de MMP /UPA se regula a través de la ERK señalizaciones /p38 PI3K-Akt y /o [22], [43], [44].
También examinó el efecto de NTP en el línea celular normal de la tiroides (Nthy-ori 3-1). tratamiento NTP no indujo la muerte celular por apoptosis significativa en las células normales de la tiroides (higos complementarios. S2 y S3). Por otra parte, en contraste con las células tumorales, células de la tiroides normales no mostraron cambios significativos morfológicas (fig complementario. S4) y la reducción en la migración celular después del tratamiento NTP (fig complementario. S5) lo que sugiere sensibilidad diferencial al tratamiento NTP entre las células cancerosas y normal de la tiroides Células. Estos resultados están de acuerdo con estudios anteriores, que informaron el efecto selectivo contra el cáncer de tratamiento de plasma [5], [45]. de tres experimentos independientes. Barra de escala = 50 micras.