Extracto
El logro de un tratamiento eficaz del cáncer es difícil, sobre todo cuando se desarrolla la resistencia a la quimioterapia convencional. (P-gp) la actividad de la glicoproteína P gobierna la resistencia a múltiples fármacos para el desarrollo (MDR) en diferentes tipos de células cancerosas. Identificación de los agentes contra el cáncer con el potencial de matar las células cancerosas y al mismo tiempo inhiben la MDR es importante intensificar la búsqueda de nuevos enfoques terapéuticos. Se examinaron los efectos de sulfinosina (SF), una purina nucleósido análogo bastante inexplorada, en la MDR (P-gp sobre-expresión) El carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y líneas celulares de glioblastoma (NCI-H460 /R y U87-TxR , respectivamente). SF mostró la misma eficacia contra líneas celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos y sus contrapartes sensibles. Sin embargo, era no tóxico para los queratinocitos humanos normales (HaCaT). SF induce la muerte celular por apoptosis dependiente de caspasa y la autofagia en las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos. Después de la aplicación SF, especies reactivas de oxígeno (ROS) se generaron y se redujo el glutatión (GSH) de concentración. La expresión de la enzima clave para la síntesis de GSH, gamma glutamil-cisteína sintetasa (γGCS) se redujo, así como la expresión de
GST-π
mRNA. En consecuencia, SF disminuyó significativamente la expresión de
HIF-1α
,
MDR1
y
VEGF
ARNm, incluso en condiciones de hipoxia. SF causó la inhibición de la P-gp (codificada por
MDR1
) la expresión y actividad. La acumulación de agente quimioterapéutico estándar - doxorubicina (DOX) fue inducida por SF en forma de la concentración y dependiente del tiempo. Se obtuvo el mejor efecto de SF después de 72 h cuando se alcanza el efecto de los inhibidores de la P-gp conocidos (Dex-verapamilo y tariquidar). De acuerdo con ello, SF sensibiliza las células cancerosas resistentes a DOX en el tratamiento subsiguiente. Además, SF disminuyó la experssion de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ARNm y proteínas y modula su secreción. En conclusión, los efectos sobre la P-gp (implicados en la farmacocinética y la MDR), GSH (implicados en la desintoxicación) y VEGF (implicados en el tumor-angiogénesis y la progresión) califican SF como agente anti-cáncer de multi-potente, que su uso debe ser considerado , en particular para las neoplasias malignas resistentes
Visto:. Dačević M, Isaković a, Podolski-Renic a, Isaković AM, Stanković T, Milošević Z, et al. (2013) purina nucleósido análogo - sulfinosina modula diversos mecanismos de progresión del cáncer en líneas celulares de cáncer resistente a múltiples fármacos. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10.1371 /journal.pone.0054044
Editor: Michihiko Kuwano, Universidad de Kyushu, Japón
Recibido: 26 Julio, 2012; Aceptado: 5 de diciembre de 2012; Publicado: 11 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Dačević et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Ministerio de educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico de Serbia (los números de subvención III y III 41031 41025) apoya esta investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
sulfinosina o SF (figura 1, [R, S] -2-amino-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamida) es la forma oxidada de 6-tioguanosina [1]. Es un agente anti-cáncer bastante inexplorado en comparación con otros tiopurinas (6-tioguanina y 6-mercaptopurina). SF inhibe el crecimiento de células de cáncer, al menos parcialmente, por la incorporación de su derivado fosforilado en el ADN. La conversión metabólica de SF a correspondiente derivado 5'-monofosfato es más compleja que la de otros tiopurinas [2].
Desde SF utiliza diferentes rutas metabólicas para su activación intracelular, el tratamiento SF no induce resistencia en células de cáncer. En contraste, la supresión de una única enzima responsable de la activación metabólica de otros análogos de nucleósidos de purina es suficiente para el desarrollo de la resistencia. SF mejor penetra en el sistema nervioso central (CNS) que su molécula parental - 6-tioguanosina y es más eficaz en el tratamiento del cáncer. SF es útil contra tumores malignos resistentes a otros tiopurinas [3]. A pesar de las limitaciones para su uso, algunos análogos de la purina estrechamente relacionados con SF mostraron actividades anti-angiogénicos considerables que merecen atención científica [4].
El metabolismo de SF implica sistema glutatión de las células. SF aducción fácilmente a compuestos de sulfhidrilo (glutatión y cisteína) y por la supresión del sistema glutatión desintoxicación y la elevación de la concentración de especies reactivas del oxígeno (ROS), SF puede inducir la muerte de las células del cáncer [2].
A la vista de su considerable eficacia en el tratamiento del cáncer y la toxicidad de moderada a las células normales [2], SF es adecuado para la combinación con otros agentes quimioterapéuticos. SF actúa sinérgicamente con doxorubicina (DOX), curcumina (CUR) y verapamilo (VER) en líneas de células no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [5] - [7]. La eficacia de la aplicación combinada con SF permitió el uso de estos fármacos a concentraciones más bajas que sean menos tóxicos, con menos efectos adversos. La hipótesis de que todos los mencionados efectos anticancerígenos de SF podrían ser útiles para la reversión de la resistencia a la quimioterapia.
resistencia a múltiples fármacos (MDR) es la principal limitación para la realización de un tratamiento exitoso. Fenotipo MDR a menudo se refiere a la expresión excesiva de P-glicoproteína (P-gp), un transportador de membrana que se extruye con eficacia los fármacos citotóxicos de las células cancerosas y cambia su farmacocinética. P-gp actúa como una bomba de eflujo para varios medicamentos contra el cáncer hidrófobos tales como antraciclinas, alcaloides de la vinca, taxanos, epipodofilotoxinas, y algunos de los nuevos medicamentos (por ejemplo imatinib, nilotinib, everolimus). P-gp sobre-expresión es común en los modelos experimentales de cáncer, así como en los tejidos cancerosos de pacientes [8]. Por lo tanto, P-gp se ha convertido en un objetivo terapéutico principal para la superación de MDR.
Entre muchas opciones para revertir la MDR, los agentes con una actividad anti-cáncer de su propia podrían examinarse como posibles moduladores de MDR. Especulamos anterior que además de la sinergia entre SF y DOX como fármacos contra el cáncer que actúan a través de vías separadas, las alteraciones de la expresión de genes relacionados con MDR y la reducción de la actividad de P-gp podrían contribuir al efecto quimio-sensibilización de SF [5], [6].
por lo tanto, se realizó una investigación de los mecanismos implicados en la acción SF en cánceres resistentes e incurables. A tal fin, se emplearon dos líneas diferentes de células cancerosas resistentes a múltiples fármacos con la sobre-expresión de P-gp (NCI-H460 /R y U87-TxR) [9], [10]. Se estudió el potencial de SF para matar células cancerosas resistentes e inducir la autofagia, así como para modular los mecanismos implicados en la progresión del cáncer, tales como glutatión (GSH) sistema de desintoxicación, el transporte del fármaco mediada por P-gp, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) expresión and.secretion. Hemos encontrado que la modificación del estado redox por SF llevó a la disminución en la expresión de factor inducible de hipoxia-1α (HIF-1α), que regula la expresión de P-gp y VEGF. Por lo tanto, la modulación de la MDR por SF es la consecuencia de la supresión del sistema de desintoxicación de GSH.
Materiales y Métodos
Medicamentos
SF ([R, S] -2-amino -9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamida) se sintetizó a partir 6-tioguanosina de acuerdo con el procedimiento publicado [1]. solución de DOX se obtuvo de EBEWE Arzneimittel GmbH, Viena, Austria. R ± verapamilo (Dex-VER) se adquirió de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania. Tariquidar (TQ) fue proporcionado amablemente por el Dr. Sven Rottenberg en el Instituto del Cáncer de Holanda, Ámsterdam. CoCl
2 se obtuvo de Fisher Scientific, EE.UU.. SF se mantuvo a -20 ° C. Antes del tratamiento, SF y CoCl
2 fueron recién diluido en agua, mientras que las alícuotas de DOX se descongelaron de -20 ° C. Dex-VER se mantuvo como solución madre 1 mM a temperatura ambiente. TQ se diluyó en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 10 mM alícuotas se mantuvieron a -20 ° C.
Químicos
RPMI 1640, medio esencial mínimo (MEM), solución de penicilina-estreptomicina, antibiótico-antimicótico solución, L-glutamina y tripsina /EDTA se adquirieron de PAA, Viena, Austria. suero bovino fetal (FBS), sulforodamina B (SRB) y naranja de acridina se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania. Matrigel fue proporcionado amablemente por el Dr. Sanja Mijatovic, del Instituto de Investigaciones Biológicas "Sinisa Stankovic", Universidad de Belgrado, Serbia. yoduro de propidio (PI) se adquirió de Roche Applied Science, Basilea, Suiza y anexina-V-FITC (AV) de Abcam, Cambridge, Reino Unido. anticuerpo conjugado con FITC anti-P-gp fue proporcionado por BD Biosciences, Reino Unido, mientras que el anticuerpo anti-VEGF conjugado con PE se obtuvo de I + amp; D Systems, Minneapolis, MN EE.UU.. éster carboxifluoresceína succinimidil (CFSE), dihydroethidium (DHE) se obtuvo de Molecular Probes®, Invitrogen, CA, EE.UU.. Los anticuerpos primarios contra la caspasa 3 y β-actina fueron adquiridos de Señalización Cell Technology Inc, Danvers, MA, EE.UU., mientras que el anticuerpo primario contra glutamilcistina gama sintetasa (γGCS) fue una especie de regalo del Dr Bato Korac, Instituto de Investigaciones Biológicas "Sinisa Stankovic ", Universidad de Belgrado, Serbia. IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa se obtuvo de Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA, EE.UU..
Células y cultivo celular
líneas de células NCI-H460 y U87 se adquirieron de la American Type Culture Collection, Rockville, MD. células NCI-H460 se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 4,5 g /l de glucosa, 10 000 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina, solución de 25 mg /ml de anfotericina B a 37 ° C humidificado en un 5% de CO
2 atmósfera. células NCI-H460 /R se seleccionaron originalmente de células NCI-H460 en nuestro laboratorio y se cultivaron en un medio que contiene 100 nM DOX como se describe anteriormente [9]. células U87 se cultivaron en MEM suplementado con 10% de FBS, L-glutamina (2 mM) y 5.000 U ml penicilina, 5 mg solución estreptomicina //ml. Se seleccionaron las células U87-U87 TXR a partir de células en nuestro laboratorio después de la exposición continua a escalonadamente concentraciones crecientes de paclitaxel (1-300 nM) durante un período de 9 meses como ya se ha publicado [10]. línea celular HaCaT (queratinocitos humanos normales obtenidos de CLS - Móvil líneas de servicio, Eppelheim, Alemania) era generoso regalo del Prof. Andra Jorg, División de Biofísica, Centro de Investigación Borstel, Leibniz-Centro de Medicina y Ciencias Biológicas, Borstel, Alemania. células HaCaT se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 4 g /L de glucosa, L-glutamina (2 mM) y /ml penicilina, 5 mg solución estreptomicina 5.000 U /ml. las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos fueron sub-cultivadas a las 72 h intervalos utilizando 0,25% de tripsina /EDTA y se sembraron en un medio fresco a las siguientes densidades: 8.000 células /cm
2 para NCI-H460, 16.000 células /cm
2 para NCI-H460 /R y U87, 32.000 células /cm
2 para U87-TxR. células HaCaT fueron sub-cultivadas a 144 h intervalos utilizando 0,25% de tripsina /EDTA y se sembraron en un medio fresco a 64, 000 células /cm
2.
sulforodamina B Ensayo
Células crecido en 25 cm
2 frascos de tejido se trataron con tripsina, se sembraron en placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. líneas celulares investigadas NCI-H460, NCI-H460 /R, U87, U87-TXR y células HaCaT se sembraron a 4, 000, 8.000, 8.000 y 16.000 células /pocillo, respectivamente. tratamiento SF (1-100 mM) duró 72 h. Las proteínas celulares se tiñeron con sulforrodamina B de ensayo (SRB), siguiendo el protocolo ligeramente modificada de Skehan et al [11]. Brevemente, las células en placas de 96 pocillos se fijaron en ácido tricloroacético al 50% (50 l /pocillo) durante 1 h a 4 ° C, se enjuagaron en agua del grifo y se tiñeron con 0,4% (w /v) de sulforrodamina B en 1% acético ácido (50 l /pocillo) durante 30 min a temperatura ambiente. Después las células se lavaron tres veces en ácido acético al 1% para eliminar la mancha no unido. La mancha unido a proteína se extrajo con 200 l de base Tris 10 mM (pH 10,5) por pocillo. La densidad óptica se leyó a 540 nm, con una corrección a 670 nm (LKB 5060-006 lector de placas de micro, Viena, Austria).
Matrigel Crecimiento
Para tridimensional (3-D ) culturas, las células se sembraron a las mismas densidades como por dos culturas (2-D) en reconstituida (pre-gelificado) membrana basal (Matrigel; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) en medio RPMI 1640 con 10% de SFB. Las células se incubaron durante 72 h y se fotografiaron en vivo por microscopía de fase.
Determinación de la proliferación celular (CFSE tinción)
La tasa de proliferación celular se midió por análisis de citometría de flujo de células marcadas con carboxifluoresceína éster de succinimidilo o CFSE [12]. células Brevemente, individual (5 × 10
6 células /ml) fueron teñidas con CFSE 1 M durante 10 minutos en la oscuridad a 37 ° C, se lavaron dos veces en medio fresco, se siembran en placas de seis pocillos a 5 x 10
4 por pocillo, y después se expuso a SF. Después de 72 h de cultivo, las células se tripsinizaron y se lavaron dos veces en PBS. Finalmente, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron por citometría de flujo. emisión de fluorescencia verde se midió utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) y analizados utilizando el software Cell-Quest.
Detección de Muerte Celular
Los porcentajes de apoptosis, necrosis y células viables se determinaron por anexina-V-FITC (AV) y el etiquetado de yoduro de propidio (PI). NCI-H460 /R y células U87-TXR se sembraron y se incubaron durante la noche en placas de 6 pocillos a una densidad de 80.000 y 160.000 células /pocillo, respectivamente. Después de 72 h de tratamiento SF, las células unidas y flotantes se recogieron por centrifugación. El sedimento de células se resuspendió en 100 l de tampón de unión que contiene 10 mM HEPES /NaOH, NaCl 140 mM, CaCl mM 5
2 (pH 7,4), suplementado con 0,2 g de AV y 1 g PI. Después de que el período de incubación (30 min a 37 ° C en la oscuridad), se añadió adicional 400 l de tampón de unión y tinción AV /PI se analizó dentro de 1 h por citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia (FL1-H verde y rojo FL2-H) se midió en FACSClibur citómetro de flujo (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). En cada muestra, se registraron 10.000 células (cerrada para excluir los desechos celulares), y los porcentajes de viabilidad (AV-PI), a principios de apoptosis (AV + PI), apoptóticas y necróticas (AV + PI +), y ya muerto (AV células PI +) se analizaron mediante software CellQuest Pro análisis de datos.
caspasa activación
la activación de caspasas se midió por citometría de flujo después de marcar las células con una, pancreatitis conjugado con FITC de células permeable inhibidor de caspasas (apostat; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El aumento de la fluorescencia verde (FL1-H) como medida de la actividad de la caspasa en las células individuales de la población tratada se determinó usando FACSCalibur citómetro de flujo (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido).
autofagia Evaluación
La aparición de vesículas ácidas autofágicos fue detectado por citometría de flujo. Después se tripsinizaron las células de tratamiento SF, se lavaron y se incubaron durante 15 min a 37 ° C con naranja de acridina 1 M. Acridina núcleos celulares teñidos de color naranja fluorescente son de color verde, mientras que los lisosomas autofágicos son de color naranja-rojo fluorescente. El aumento en rojo frente a verde (FL3 /FL1) Relación de fluorescencia, lo que refleja la autofagia, se determinó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) y Cell Quest Software Pro.
Western Blot
Las células cultivadas en 100 mm en placas de Petri siguientes densidades: 400.000 células por placa de NCI-H460 /R y 750.000 por placa para U87-TxR se lisaron después del tratamiento SF con tampón de lisis (30 mM Tris-HCl pH 8,9, NaCl 150 mM, 1% NP-40) que contiene 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Alemania). Después de 30 min en hielo, las muestras se centrifugaron a 14 000 g durante 15 min a 4 ° C, y se recogieron los sobrenadantes. Igual cantidad de proteínas de cada muestra se separaron mediante SDS-PAGE en geles de 6-15% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Después de la incubación con anticuerpos primarios contra la caspasa 3, β-actina y gamma sintetasa glutamylcstein (γGCS) e IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa como anticuerpo secundario, las bandas de proteína específicas se visualizaron usando el reactivo de Amersham ECL (GE Healthcare Life Sciences, Reino Unido) . Los niveles de proteína de γGCS se cuantificaron por densitometría usando software ImageJ y expresaron en relación con ß-actina.
DHE tinción
mediciones de citometría de flujo de dihydroethidium (DHE)-fluorescencia se utilizaron para medir ROS concentración en las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos. Las células adherentes se lavaron con PBS y se recogieron mediante tripsinización. Las células se incubaron en PBS con 10% de FBS y 10 mM DHE para 45 min. DHE-fluorescencia se analizó por citometría de flujo (excitación 488 nm, y la emisión de 585 nm, canal FL2-H). La media de intensidad de fluorescencia (MFI) se calculó después de la corrección de la autofluorescencia.
La detección colorimétrica de glutatión (GSH)
Las células cultivadas en 25 cm
2 frascos de tejido se tripsinizaron y contaron. El mismo número de células (2,5 × 10
6) para cada muestra se expuso a otro procedimiento. Brevemente, las células se recogieron por centrifugación a 700 xg durante 5 minutos a 4 ° C y se eliminó el sobrenadante. A continuación, el sedimento celular se resuspendió en PBS 0,5 ml de hielo-frío y se centrifugó a 700 xg durante 5 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se retiró y las células se lisaron en tampón de glutatión 80 l de hielo frío (Kit de detección colorimétrico GSH, Bio-Vision, CA) durante 10 minutos en hielo. Después, se añadieron 20 l de 5% de ácido sulfosalicílico y las muestras se centrifugaron a 8000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se utiliza para el ensayo de GSH. El glutatión Buffer se añadió a cada (placa de 96 pocillos) bien en un volumen de 160 l y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 20 l de cualquiera de los estándares preparados o muestras a cada pocillo y se incubaron durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 20 l de solución de sustrato (kit de detección colorimétrico GSH, BioVision, CA) y la absorbancia de producto generado (ácido 2-nitro-5-tiobenzoico) se leyó a 405 nm (LKB 5060 a 006 Lector de Placas Micro, Viena , Austria). Las concentraciones de GSH se determinaron usando la curva de calibración estándar y GSH relacionados con las concentraciones de proteínas en los lisados celulares. La detección GSH para cada muestra se realizó al menos seis veces.
Extracción de ARN y RT-PCR
ARN total fue extraído de las células no tratadas NCI-H460 /R y U87-TXR y las células tratados con SF. El aislamiento se realizó utilizando Trizol (Invitrogen Life Technologies, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. ARN se cuantificó en un espectrofotómetro, y se determinó la calidad por electroforesis en gel de agarosa. Las reacciones de transcripción inversa (RT) usando 25 g ARN total se realizaron con cebadores oligo-dT utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Gibco BRL, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron con cebadores específicos para,
GST-π
,
VEGF
,
MDR1
y
HIF-1α
[13] - [16 ], β
-actina
[17] y
GAPDH
[18] se utilizó como control interno y co-amplificado con genes de interés en todos los experimentos de PCR.
las reacciones de PCR se realizaron en el Sistema de PCR GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) bajo las siguientes condiciones para
HIF-1α
,
MDR1
y
GST-π
: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min, 24, 25 o 28 ciclos (respectivamente) a 95 ° C durante 15 s, 56ºC durante 30 s, 72ºC durante 30 s y a 4 ° C por tiempo indefinido. Cuando se realizó PCR para determinar la expresión de la
VEGF
gen, se aplicaron 35 ciclos con la temperatura de hibridación de 62 ° C. Los
GAPDH
cebadores se utilizaron en las proporciones siguientes: 1:04 a las
MDR1
cebadores y 1:06 de la
HIF-1α
cebadores con el fin de lograr la amplificación lineal condiciones. El β
-actina
cebadores se utilizaron en las proporciones siguientes: 1:02 a las
cebadores GST-π Opiniones y 1:05 de la
VEGF
cebadores con el fin de alcanzar condiciones de amplificación lineales. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Multi-Analista de Software /PC Image Analysis (Bio-Rad Gel Doc 1000, CA, EE.UU.) se utilizó para el análisis de densitometría.
DOX Acumulación Ensayo
acumulación DOX se analizó mediante citometría de flujo utilizando la capacidad de DOX para emitir fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia era proporcional a la acumulación de DOX. Los estudios se llevaron a cabo después de 24 h, 48 hy 72 h de tratamiento SF. células NCI-H460 /R y U87-TXR fueron cultivadas en 25 cm
2 frascos, con tripsina y se resuspendieron en 10 ml tubos de centrífuga en un medio que contiene DOX-(20 M). A continuación, se incubaron las células a 37 ° C en 5% de CO
2 de 120 min. Al final del periodo de acumulación, las células se sedimentaron por centrifugación, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se colocaron en PBS frío. Las muestras se mantuvieron en hielo en la oscuridad hasta el análisis en citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). La fluorescencia de DOX se evaluó en el canal de fluorescencia 2 (FL2-H) a 530 nm. Un mínimo de 10.000 eventos se ensayaron para cada muestra. Las diferencias en la forma de la curva se cuantificaron utilizando una estadística no paramétrica Komogorov-Smirnov. Los valores de p se calcularon (a petición) en CellQuest Pro y se ejecutan en un ordenador Macintosh.
Análisis de citometría de flujo de la P-gp y VEGF Expresión
Se utilizó citometría de flujo para medir P -gp niveles y expresión del VEGF en las células cancerosas resistentes a múltiples fármacos. células tratadas no tratados y SF (2 × 10
5) se recogieron por tripsinización, se lavaron en PBS enfriado con hielo, y luego directamente inmuno-manchado por FITC-conjugado anti-P-gp anticuerpo de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Biosciences, Reino Unido). Se evaluó un IgG2bκ de control de isotipo (Abcam, Cambridge, Reino Unido) para cada muestra experimental para discriminar el nivel de fondo de fluorescencia de las células negativas. Para el análisis de la expresión de VEGF, las células se fijaron en paraformaldehído al 4%, 10 min a temperatura ambiente, se lavaron y se resuspendieron en saponina al 0,05% (w /v) de tampón y se incubaron con anticuerpo anti-VEGF conjugado con PE según el protocolo de los fabricantes ( R & amp; D Systems, EE.UU.). Se evaluó un control de isotipo IgG2a (Abcam, Cambridge, Reino Unido) para cada muestra experimental para discriminar el nivel de fondo de fluorescencia de las células negativas. Intensidad media de fluorescencia se determinó para las células teñidas positivamente. Las muestras se mantuvieron en hielo en la oscuridad hasta el análisis en citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido). La fluorescencia de FITC-conjugado anti-P-gp se evaluó en el canal de fluorescencia 1 (FL1-H) a 530 nm, mientras que PE-conjugado anti-VEGF se evaluó en el canal de fluorescencia 2 (FL2-H) a 585 nm. Un mínimo de 10.000 eventos se analizaron para cada muestra (los restos celulares puerta excluidos y células muertas) y los resultados obtenidos fueron analizados mediante la célula de Quest Pro Software (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido).
Ensayo MTT
actividad metabólica celular se evaluó mediante el ensayo de MTT basado en la reducción de 3- (4,5-dimetil-2-thizolyl) -2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT, Sigma, St Louis , MO) en el tinte de formazán por las mitocondrias activas de las células vivas. Los efectos combinados de tratamiento simultáneo y posterior se estudiaron en líneas celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos. NCI-H460 /R y células U87-TXR preparados para el tratamiento simultáneo se sembraron a 4, 000 y 8.000 células /pocillo, respectivamente. tratamiento SF (5 M) en combinación con diferentes concentraciones de DOX duró 72 h. Los tratamientos posteriores se realizaron en NCI-H460 /R y las células U87-TXR inicialmente sembraron a densidades más bajas (500 células /pocillo y 1.000 células /pocillo, respectivamente). El pretratamiento con 5 M SF duró durante 72 h y fue seguida por tratamiento de 72 h adicionales con diferentes concentraciones de DOX. MTT se añadió a una concentración final de 0,1 mg /ml en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos y las placas se incubaron a 37 ° C durante 4 h. Después, se añadió DMSO para disolver el producto formazan, que cantidad era proporcional al número de células vivas. La absorbancia del tinte disuelto se midió a 540 nm usando un lector de microplacas automático (LKB 5060-006 Micro Lector de Placas, Viena, Austria). Se determinó la inhibición del crecimiento (I) de acuerdo con la siguiente equitación:. donde A es la absorbancia
IC
50 valor se definió como la concentración de cada fármaco que inhibe el crecimiento celular en un 50%. IC
50 se calculó mediante análisis de regresión lineal utilizando el software Excel.
ELISA para la detección de VEGF humano
165 en medio de cultivo celular
células resistentes a múltiples fármacos (NCI-H460 /R y U87-TxR), se siembran en placas de 6 pocillos, se incubaron durante la noche y después se trató con SF. El medio celular (sobrenadante) se recogió 24 h, 48 h y 72 h después del tratamiento para la determinación de VEGF secretado
165 proteínas por kit VEGF inmunoensayo (Quantikine Human ELISA Kit VEGF, R & amp; D Systems, Minneapolis, EE.UU.). El procedimiento se cumplió de acuerdo al manual del fabricante. Los resultados se normalizaron sobre la base de la misma cantidad de células analizadas. Una curva estándar se ha generado utilizando recombinante VEGF
165 suministrado con el kit. Las concentraciones de VEGF en los sobrenadantes de cultivo libres de células se analizaron por triplicado en dos experimentos independientes.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa Statistica 6.0. Se probaron los resultados de la normalidad. Si los valores obtenidos no se distribuyen normalmente, los grupos fueron comparados por
t de Student
- prueba. Para las variables distribuidas normalmente, se utilizó el análisis de una vía de la varianza (ANOVA). Cuando se observó significación estadística, se aplicó la prueba de Tukey honesto diferencia significativa (HSD). La significación estadística fue aceptada si p & lt; 0,05 (*), p & lt; 0,01 (**), p. & lt; 0,001 (***)
Resultados y Discusión
SF inhibe el crecimiento de MDR Las células cancerosas
Hemos establecido NSCLC y glioblastoma P-gp líneas de células que sobre-expresan (NCI-H460 /R y U87-TxR) con fenotipo MDR con el fin de investigar los posibles agentes contra el cáncer [9], [10 ]. NCI-H460 /R y U87-TxR son líneas de células cancerosas resistentes a múltiples fármacos que se originaron de NCI-H460 (línea celular de NSCLC) y U87 (línea celular de glioblastoma). Las líneas celulares de sus padres fueron considerados como sensibles ya que las células derivadas de pacientes que no habían recibido quimioterapia. En el presente estudio, hemos tratado de dilucidar la acción de sulfinosina (SF), un análogo de nucleósido de purina sintética, en estas dos líneas celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos. Elegimos SF debido a evidencias de que sus concentraciones terapéuticamente eficaces no podían inducir la resistencia. SF también penetra de manera eficiente para CNS [2]. Por otra parte, el estudio clínico reciente demostró que la terapia de combinación incluyendo 6-tioguanina (molécula estrechamente relacionada con SF) es prometedor para los pacientes con glioma de alto grado anaplásico recurrente [19]
.
Los efectos de SF en el crecimiento de las células cancerosas después de 72 h de tratamiento fueron evaluados por la quimio-sensibilidad del ensayo - sulfordamina B (SRB). SF inhibió el crecimiento de líneas celulares de cáncer sensibles y resistentes a múltiples fármacos en una forma dependiente de la dosis (Figura 2A, C). Desde la aplicación de agentes anti-cáncer está limitado por su toxicidad hacia las células normales, probamos el efecto de SF en células HaCaT (queratinocitos humanos normales). Se evaluaron los efectos sobre el crecimiento de HaCaT después del tratamiento continuo de 72 h también por el ensayo de SRB. SF no redujo significativamente el número de células normales, incluso con la concentración más alta (100 M) (Figura 2C). Hemos demostrado que la SF inhibe el crecimiento de sensible, así como células de NSCLC y glioblastoma resistentes en el rango de micro-molar de las concentraciones, y que su eficacia no se vio afectada por la presencia del fenotipo MDR. Además, SF era no tóxico para las células normales (HaCaT) en el rango de concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento de células cancerosas.
Los efectos inhibidores del crecimiento de SF en NCI-H460 y NCI-H460 /R ( a), las células U87, U87-TXR y HaCaT (C) obtenidas en plástico después del tratamiento 72 h se evaluaron mediante el ensayo de SRB. Media ± S. D. Se calcularon los valores de cinco experimentos independientes (n = 5). células U87-TXR (D) NCI-H460 y NCI-H460 /R (B), U87 y se tiñeron con CFSE y se incubaron durante 72 h con 10 mM SF. La tasa de proliferación (CFSE declinación) se determinó mediante citometría de flujo en el canal FL1. Microscopía de luz de, U87 y TxR U87 (F) el crecimiento celular en (cultivo de 2-D) de plástico y el crecimiento matrigel (cultivo de 3-D) NCI-H460 y NCI-H460 /R (E) después de 72 h de 10 M SF tratamiento.
a continuación, se evaluó el efecto citostático de 10 M SF en cada línea celular por tinción con CFSE (Figura 2B, D). CFSE es un colorante vital estable en el citoplasma durante aproximadamente 7-8 generaciones, pero la intensidad de la fluorescencia CFSE declina debido a su reducción a la mitad progresiva dentro de las células hijas después de cada división celular. De esta manera, la distribución de CFSE en las células se puede estimar la tasa de proliferación celular. La distribución de CFSE en control y SF muestras tratadas se ilustra mediante histogramas perfiladas citometría de flujo (Figura 2B, D). La inhibición de la proliferación observada en presencia de SF fue el más pronunced en células NCI-H460 /R. Estos resultados indican que la inhibición de la proliferación es en parte responsable de la actividad anticancerígena de SF.
Ya que las líneas celulares de cáncer y de glioblastoma tienen un alto potencial metastásico, se compararon los efectos de SF para inhibir el crecimiento de las células después de 72 h sobre plástico (cultivo de 2-D) y en la membrana basal reconstituida - matrigel (cultivo de 3-D) (Figura 2E, F). Se encontró que el SF inhibió el crecimiento en cultivo en 3-D con la misma eficacia observada en cultivo de 2-D. El hecho de que las células se separaron de cada tratamiento al otro después de SF en matrigel, especialmente células de glioblastoma, apunta al cambio en sus propiedades adhesivas. Por lo tanto, se especula que SF podría afectar a la afinidad de las células cancerosas de invadir los vasos sanguíneos, inducir tumor-angiogénesis y la metástasis.
SF Induce Apoptosis dependiente de caspasa en células MDR del cáncer
A continuación, se procedió a examinar si inducción de la apoptosis contribuye a la acción anticancerígena de SF en líneas celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos. Para evaluar la apoptosis inducida por SF después de 72 h las células se sembraron a una densidad óptima para sus propiedades de crecimiento. De ese modo, los controles no tratados no alcanzaron confluencia al final del período de incubación. Anexina-V-FITC /yoduro de propidio tinción reveló que SF aumenta la proporción de células apoptóticas (AV + PI-) en ambas líneas celulares de cáncer resistentes a múltiples fármacos. Los resultados se resumen en la (Figura 3A, B, C, D): células vivas son negativos para ambos, Anexina-V y yoduro de propidio (AV-PI-);