Extracto
El bloqueo del receptor del factor de crecimiento epidérmico actividad (EGFR) ha sido un objetivo terapéutico primario para no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Como los pacientes con EGFR de tipo salvaje han demostrado tener solo un modesto beneficio de los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (TKIs), hay una necesidad de enfoques terapéuticos adicionales en pacientes con EGFR de tipo salvaje. Como un componente clave de la señalización de integrina aguas abajo y receptor conocido diafonía con EGFR, la hipótesis de que centrarse en la actividad quinasa de adhesión focal (FAK), que también se ha demostrado que se correlaciona con la etapa agresiva en el CPNM, daría lugar a una mayor actividad del ITC del EGFR . Como tal, las células de NSCLC EGFR TKI-resistentes (A549, H1299, H1975) fueron tratados con el erlotinib EGFR TKI y los inhibidores de la FAK (PF-573,228 o PF-562,271), tanto como agentes individuales y en combinación. Se determinó la viabilidad celular, la apoptosis y el crecimiento de 3 dimensiones
in vitro
y el crecimiento tumoral evaluada
in vivo
. El tratamiento de células con CPNM EGFR TKI-resistentes con inhibidor de FAK sola viabilidad celular inhibe eficazmente en todas las líneas celulares ensayadas; sin embargo, su uso en combinación con el erlotinib EGFR TKI fue más eficaz en la reducción de la viabilidad celular que cualquier tratamiento solo cuando se ensaya tanto en 2- y 3-dimensionales ensayos
in vitro
, con beneficio mejorada observada en las células A549. Esta mayor eficacia puede ser debido en parte a la inhibición observada de la fosforilación de Akt cuando se utilizaron los fármacos en combinación, donde las células de nuevo A549 demostraron la inhibición más después del tratamiento con la combinación de fármacos. La combinación de erlotinib con un inhibidor de FAK también era potente
in vivo
como lo demuestra el crecimiento del tumor reducida en el modelo de xenoinjerto de ratón A549. Hemos comprobado, además, que el aumento de la sensibilidad era independientemente del estado mutacional LKB1. En resumen, se demuestra la eficacia de la combinación de inhibidores de erlotinib y FAK para su uso en conocido EGFR de tipo salvaje, las células resistentes a EGFR TKI, con el potencial de que un subconjunto de tipos de células, que incluye A549, podría ser particularmente sensibles a este tratamiento de combinación. A medida que se justifica tal, la evaluación adicional de esta terapia de combinación y podría llegar a ser una estrategia terapéutica eficaz para los pacientes con CPNM EGFR TKI resistente inherente
Visto:. Howe GA, Xiao B, Zhao H, Al-Zahrani KN, Hasim MS, Villeneuve J, et al. (2016) inhibidores de quinasa de adhesión focal en combinación con erlotinib Demostrar una mayor actividad antitumoral en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10.1371 /journal.pone.0150567
Editor: Jeremy J. W. Chen, Instituto de Ciencias Biomédicas, TAIWAN
Recibido: 28 Septiembre, 2015; Aceptado: 14 Febrero de 2016; Publicado: 10 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Howe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de CLA de la Fundación de Investigación del cáncer de pulmón (http://www.lungcancerresearchfoundation.org). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, recopilación o análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación de este manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas: DMSO, dimetilsulfóxido; ECM, la matriz extracelular; EGFR, epidérmico receptor del factor de crecimiento; FAK, quinasa de adhesión focal; LKB1, quinasa de hígado B1; NSCLC, cáncer de pulmón de células no pequeñas; PBS, solución salina tamponada con fosfato; PF-228, PF-573228; PF-271, PF-562271; TKI, inhibidor de la tirosina quinasa
Introducción
Los cánceres de pulmón representan más muertes en todo el mundo que cualquier otro tipo de cáncer [1] con el ~ 80% de los cánceres de pulmón se clasifica como no pequeñas de cáncer de pulmón de células (NSCLC) [2]. La proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se sobreexpresa en hasta el 80% de NSCLC, por lo tanto EGFR ha sido un objetivo terapéutico primordial de NSCLC [3,4]. Con este fin, los agentes han sido diseñados para apuntar a tanto el dominio extracelular y el dominio quinasa intracelular de EGFR. Inhibidores dirigidos al dominio quinasa de EGFR, tales como erlotinib y gefitinib, se han mostrado prometedores en pacientes con mutaciones activadoras (es decir, en los exones 18, 19 o 21) en EGFR [5-8], aunque estos inhibidores han demostrado modestos beneficios para los pacientes la acogida de tipo salvaje EGFR [9,10]. Además, las mutaciones secundarias en EGFR o la amplificación de c-MET pueden desarrollar, que confiere resistencia en pacientes previamente sensibles [11]. A medida que la incidencia de la activación de mutaciones de EGFR es relativamente baja en la mayoría de los de América del Norte y las poblaciones europeas [12-15], existe una necesidad de mejorar la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (TKIs) para los pacientes con EGFR de tipo salvaje.
quinasa de adhesión focal (FAK) es una tirosina quinasa no receptora que se localiza en los sitios de adhesión celular a la matriz extracelular (ECM) y media en los eventos aguas abajo de la integrina acoplamiento de la ECM de señalización. FAK es conocido para regular la supervivencia celular, la proliferación y la migración [16]. la expresión de FAK también ha demostrado ser de hasta regulado en muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de pulmón [17], por lo tanto el posicionamiento FAK como un objetivo importante para la regulación en la terapia del cáncer. Con este fin, los inhibidores de la FAK se han desarrollado, incluyendo inhibidores farmacológicos de la actividad de la tirosina quinasa FAK [18,19]. La inhibición de la FAK se ha demostrado que afecta a una serie de procesos celulares importantes para el crecimiento del tumor y la progresión de la enfermedad, incluyendo la angiogénesis y metástasis [20-22]. Además, los inhibidores de la FAK se han demostrado para inhibir eficazmente el crecimiento del tumor en un número de modelos de xenoinjerto subcutáneos [23,24] muestra promesa como agentes únicos, así como en combinación con otros inhibidores de [24-26].
En NSCLC, aumento de los niveles de expresión de FAK se observan en el tejido tumoral en comparación con el tejido pulmonar normal, y este aumento de la expresión se correlaciona con mayores estadios de la enfermedad [27]. Estos resultados sugieren un papel importante para la FAK en la progresión del NSCLC. La evidencia reciente también ha implicado la expresión de la integrina β1 en la resistencia a la gefitinib EGFR TKI, con aumento de la sensibilidad gefitinib siendo visto tras el agotamiento de la integrina β1 en células de NSCLC [28]. Dado que FAK es una de las principales quinasas activadas aguas abajo de la integrina β1, se indica la importancia de la adherencia de señalización complejo ECM-focal en la resistencia al tratamiento EGFR TKI. Ya que es una práctica establecida para el tratamiento de pacientes con CPNM con ITC del EGFR y hay cada vez más pruebas de que la FAK desempeña un papel importante en el crecimiento del cáncer de pulmón y la progresión, nos dispusimos a probar la utilidad de combinar el inhibidor de EGFR erlotinib con la inhibición de FAK en el CPNM. Se investigaron los efectos de dos inhibidores de la FAK, PF-573228 (PF-228) y PF-562271 (PF-271) sobre el crecimiento de células de NSCLC en la cultura y el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de ratón ya que ambos fármacos solos y en combinación con erlotinib. Los resultados de nuestro estudio indican que la combinación de la inhibición de FAK con erlotinib reduce más eficazmente la viabilidad de EGFR de tipo salvaje células NSCLC
in vitro Opiniones y xenoinjerto el crecimiento tumoral en
in vivo
que cualquier tratamiento de drogas por sí sola, con especial eficacia en el tipo de células A549. Por lo tanto, nuestros resultados han identificado una estrategia de combinación de fármacos prometedores de orientación EGFR y FAK en el CPNM, e indican que un régimen de tratamiento que incluye un inhibidor de FAK puede resultar más beneficioso que el tratamiento con erlotinib solo en pacientes que albergan inherente CPNM EGFR TKI resistente.
Métodos
cultivo de células y reactivos
líneas celulares humanas A549 (EGFR de tipo salvaje) y H1299 (EGFR de tipo salvaje) fueron adquiridos de ATCC, mientras H1975 (EGFR T790M y L858R mutaciones), HCC827 (EGFR ΔE746-E750) y HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) líneas celulares fueron un regalo del Dr. Ming Tsao (hospital Princess Margaret, Toronto, ON). Se mantuvieron células A549 en DMEM (Mediatech, Manassas, VA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Medicorp, Montreal, QC), mientras que H1299, H1975, HCC827 y HCC4006 células se mantuvieron en RPMI-1640 (Hyclone Laboratories, Logan , UT) con 10% de FBS. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2. La FAK inhibidor PF-573228 (PF-228) se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido) y se disolvió en DMSO. Erlotinib y la FAK inhibidor PF-562271 (PF-271) se adquirieron de Shanghai Biochempartner Co. Ltd. (Shanghai, China) y se disolvieron en DMSO para
vitro
trabajo de cultivo celular in.
Generación de células resistentes a erlotinib
células
HCC4006 que eran originalmente sensibles a erlotinib, se hicieron resistentes a erlotinib a través de 5 rondas de aumento de la dosis a partir de 0,005 erlotinib M y aumento de la concentración en un factor de 5 hasta que las células resistentes a 3 micras se aislaron erlotinib. células parentales fueron tratadas con cantidades equivalentes de DMSO a las células sometidas a selección para la resistencia durante la duración del experimento de escalado de dosis, y éstos se utilizaron como controles para todos los experimentos posteriores.
plásmido transfección de LKB1 en células A549
A549 células fueron transfectadas con pcDNA3-FLAG-LKB1 (plásmido 8590 [29], Addgene, Cambridge MA) para LKB1 sobreexpresan o con pcDNA3.1 como control de vectores usando GeneJuice reactivo de transfección (Novagen, Etobicoke, ON). Las células transfectadas se sembraron en múltiples placas de cultivo de tejido y después de 48 horas, dividiendo activamente células fueron tratadas con 500 mg /ml de geneticina (Invitrogen, Burlington, ON) para facilitar la selección de las células que expresan el plásmido. Las células en cada placa de cultivo de tejido que queda después de la selección se combinaron para crear una serie de clones agrupados tanto de LKB1 que expresan y no expresan las células A549. Confirmación de la expresión de LKB1 en las células transfectadas con FLAG LKB1 y continua falta de expresión de LKB1 en las células control fue confirmada por Western Blot para LKB1.
siRNA transfección
H1299 células fueron transfectadas ya sea simulada (PBS) o transfectadas con siGENOME no director de control de siRNA#2 o siGENOME SmartPool LKB1 siRNA (cat#M-005035-02, Dharmacon, Lafayette, CO) con el reactivo Oligofectamine (Invitrogen, Burlington, ON). Eficiencia de caída LKB1 se confirmó a través de Western Blot. Para los ensayos de MTT utilizando células transfectadas con siRNA, el tratamiento farmacológico se inició a las 48 horas después de la transfección. Para los experimentos que implican la estimulación de las células con EGF para el Western Blot, las células transfectadas con siRNA fueron privadas de suero durante la noche comienzo a las 48 horas después de la transfección antes de la estimulación del factor de crecimiento.
MTT viabilidad de las células de ensayo
Las células se sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 4.000 células /pocillo y se incubaron durante la noche. Para aumento de la dosis y de la combinación de drogas experimentos, las células se trataron con erlotinib o PF-228 solo o en combinación a diferentes concentraciones de fármaco en DMEM o RPMI-1640 suplementado con 5% de FBS durante 48 horas. La viabilidad celular se evaluó a continuación con el reactivo MTT (bromuro de tiazolilo azul tetrazolio; Sigma, Oakville, ON) como se describe anteriormente [30] con la absorbancia se determina a 570 nm con un lector de placas Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Rockford, IL). Los tratamientos se realizaron en réplicas de seis con los valores medios se expresan como el porcentaje de viabilidad en relación con el control tratado con DMSO (100% viable). La naturaleza del efecto de erlotinib en combinación con el inhibidor de FAK PF-228 se determinó por el método de Chou-Talalay [31] usando el software Calcusyn (Biosoft, Cambridge, UK). Los datos para la viabilidad celular medida por MTT para cada fármaco solo y en combinación se utilizó en el programa Calcusyn para producir parcelas CI fracción afectada (Fa-CI) que indican el índice de combinación (CI) valores para cada combinación de fármacos. los valores & lt CI; 1 indican las interacciones sinérgicas, los valores de CI & gt; Se realizaron 1 indican interacciones antagónicas y valores de CI = 1 indican interacciones aditivas.
inmunoprecipitación FAK y ensayo in vitro quinasa
La inmunoprecipitación y quinasa reacciones como se ha descrito anteriormente [32]. En pocas palabras, cantidades iguales de lisado celular total (600 mg) se inmunoprecipitaron de FAK con anti-FAK anticuerpo (BD Bioscience, Mississauga, ON) y 20 l de proteína /perlas A G Sepharose (GE Healthcare, Uppala, Suecia), mientras que la rotación de 2 horas a 4 ° C. A continuación, las perlas se lavaron 3 veces con NETN 200 mM (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, 0,5% de Igepal CA-630), seguido de un lavado en tampón de quinasa (Navo 0,25 mM
3, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, mM NaF 1, 10 mM β-glicerofosfato, ditiotreitol 1 mM, MgCl 15 mM
2). DMSO (control vehículo) o inhibidor de FAK PF-228 a 1 o 5 M concentraciones se añade a la reacción en 20 l de tampón de quinasa y se incubó durante 20 minutos a 30 ° C. A continuación, el ensayo de la quinasa se inició con 1 l de [
32P] γATP (5 Ci /l) y se incubaron durante 30 minutos a 30 ° C con mezclado cada 10 minutos. La reacción se terminó después de la adición de tampón de muestra SDS 4X. Las muestras se resolvieron en un gel de poliacrilamida al 7,5% y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se sometió a autorradiografía para el desarrollo de los acontecimientos de fosforilación de FAK y se sondó para el total de los niveles de FAK por transferencia Western como se describe a continuación.
Citometría de flujo
Las células se trataron con control de disolvente (DMSO), erlotinib , PF-228, o ambos erlotinib y PF-228 en medio que contenía 5% de FBS durante 48 horas. se recogieron y se combinaron las células Tanto no adherentes y adherentes, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 70% de etanol para la permeabilización. Las suspensiones celulares se trataron a continuación con solución de yoduro de propidio (/yoduro de propidio 48 mg ml, 40 mg /ml de RNasa A) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Un total de 1 x 10
se evaluaron 4 células mediante el flujo de Beckman Coulter Epics XL citómetro (Beckman-Coulter, Mississauga, ON) y el porcentaje de células apoptóticas fue calculada a partir de las células con menos de contenido de ADN 2N utilizando el flujo FCS expreso citometría de software de análisis (software De Novo, Los Ángeles, CA).
Western blot
Después de la extracción de proteínas totales, se realizó el Western blot como se describe anteriormente [30]. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron los siguientes: (Cat.#9272) (. S473, Cat#9271) de conejo anti-Akt, pAkt, LKB1 (Cat#D60C5.) y PARP anticuerpos eran de Cell (Cat#9542). Signaling Technology (Danvers, MA), ratón anti-FAK (clon 77 /FAK) fue de BD Transduction Laboratories (Mississauga, ON), y el anticuerpo anti-β-actina de ratón (clon AC-74) era de Sigma (St. Louis , MO). Después de la incubación con el anticuerpo primario durante la noche, las membranas se lavaron 3 x 5 minutos y se incubaron en peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado de cabra anti-ratón o de cabra anti-anticuerpo secundario de conejo (Calbiochem, San Diego, CA) durante 1 hora. Las membranas se lavaron a continuación 6 x 5 minutos y se incubaron en Immobilon Western quimioluminiscente HRP Sustrato (EMD Millipore, Billerica, MA) antes de revelado de la imagen utilizando el sistema de GeneGnome Bio Imaging y software GeneSnap (Syngene, Frederick, MD).
crecimiento de colonias de ensayo
Lab-Tek II portaobjetos de cámara de 4 pocillos (Nalge Nunc International, Naperville, IL) se recubrieron con 100 l de factor de crecimiento reducido extracto de membrana basal (BME; Trevigen, Gaithersburg, MD) que solidificado durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se siembran a continuación sobre la capa de BME solidificado a una densidad de 5.000 células /pocillo en medio que contiene 10% de FBS y 2,5% BME. El medio se actualiza cada tres días. tamaños de colonias de células se determinaron con el software ImageJ de un total de 4 imágenes de cada uno de los pocillos duplicados para cada experimento.
In vivo el crecimiento tumoral
células de cáncer de pulmón A549 (1 x 10
6 células) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de los traseras izquierda y derecha de 6 semanas de edad CD-1 ratones desnudos (Charles River, Wilmington, MA). Los ratones se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos, en una luz de 12 horas /oscuridad ciclo con la alimentación ad libitum y agua para la duración del experimento. Tres días después de la inyección, los ratones (4 ratones /tratamiento) fueron tratados primero por sonda oral con control del vehículo, o con concentraciones eficaces anteriormente demostrados de erlotinib (50 g /g) [33], PF-271 (50 g /g) [ ,,,0],23], o la combinación de ambos fármacos en PBS con 5% gelucire (control vehículo). Los fármacos se administraron a continuación por sonda oral diaria durante cinco días consecutivos seguidos por dos días sin tratamiento y luego se repitió el proceso para la duración del experimento. Las mediciones de tamaño del tumor se tomaron una vez por semana por medición del calibre y el volumen del tumor se calculó utilizando la siguiente fórmula: volumen del tumor = (anchura)
2 x (longitud) /2. Todos los experimentos con animales se realizaron y aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales de Ottawa y se ajustaban a las directrices establecidas por el
Los animales de Ley de Investigación
y el Consejo Canadiense de los Animales de
Guía para el Cuidado y Uso de los animales experimentales
(Vol. 1, 2ª ed., 1993), y cumplir con los estándares de la práctica en las disciplinas de la ciencia de los animales de laboratorio y medicina veterinaria de animales de laboratorio. Según el protocolo aprobado, los animales fueron sacrificados por asfixia con dióxido de carbono seguido por dislocación cervical a pre-determinado criterios de valoración experimentales, incluyendo una masa tumoral) hasta el punto en que interfiere significativamente con las funciones corporales normales o causa dolor, b) pérdida de peso corporal consistente o rápida inferior o igual a 20% del peso corporal c) ulceración /infección del sitio del tumor (rotura de barrera de la piel), e) la carga tumoral & gt;. 10% del peso corporal g de ratón) de distrés respiratorio grave o h) angustia ambulatoria por cualquier razón
Ex vivo análisis de tumor de pulmón
tumores de NSCLC resecado quirúrgicamente y el tejido pulmonar normal adyacente se recogieron después de la evaluación patológica de cinco pacientes que dieron su consentimiento informado por escrito según el protocolo aprobado por el Consejo de Ética de Investigación del hospital de Ottawa ( Protocolo#20120559-01H). Características de los pacientes se describen en la Tabla 1. El tejido fue procesado el mismo día para su uso en
ex vivo
experimentos. Se utilizó un punzón de biopsia (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Alemania) para obtener núcleos de 2 mm de diámetro, tanto de tejido tumoral de pulmón y tejido pulmonar normal y de sección más en 1 mm rodajas gruesas con tres rebanadas luego se distribuye aleatoriamente en pocillos por triplicado de un 24 placa de cultivo de tejidos -bien. cortes de tejido se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 100 U /solución de antibiótico /antimicótico ml (Gibco, Waltham, MA) a 37 ° C y 5% de CO
2. A medida que cada lámina de tejido no es necesariamente idéntica en términos de su densidad celular o viabilidad en el momento de aislamiento, el día después del aislamiento, la viabilidad de cortes de tejido se evaluó en una base por bien antes de la adición del fármaco después de la incubación durante 4 horas con un 10 % de solución alamarBlue (ABD Serotec, Raleigh, Carolina del Norte). lecturas de tratamiento de drogas de correos se normalizaron luego a estas lecturas iniciales de viabilidad para cada pocillo. cortes de tejido fueron tratados el día después del aislamiento, ya sea con el control de vehículo (DMSO), erlotinib (10 mM), PF-271 (5 M), o la combinación de ambos fármacos durante 48 horas y la viabilidad celular fue luego evaluadas por solución alamarBlue 10% . Se midió la fluorescencia (excitación 530 nm /emisión 590 nm) con un lector de placas de fluorescencia Fluoroskan Ascenso (Thermo Scientific, Rockford, IL) Además de las 4 horas después de alamarBlue.
Los análisis estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Se realizaron comparaciones múltiples por ANOVA mientras que las comparaciones individuales se realizaron por
t
pruebas de Student para datos independientes. Estadísticamente se determinaron diferencias significativas como
P Hotel & lt; 0.05 desde un mínimo de dos experimentos realizados independientemente.
Resultados
La inhibición de la FAK reduce la viabilidad celular en las células NSCLC TKI del EGFR-resistentes
Con el fin de evaluar la eficacia del tratamiento líneas celulares de NSCLC EGFR TKI-resistente con FAK TKIs, hemos utilizado dos líneas de EGFR de tipo salvaje de células (A549, H1299) con insensibilidad conocida a EGFR TKIs [34], así como el EGFR línea celular mutante H1975, con la resistencia adquirida EGFR TKI debido a una mutación T790M en el gen EGFR [35]. Estas tres líneas de células así nos proporcionó ejemplos razonables para probar la eficacia de la adición de un inhibidor de la tirosina quinasa FAK al tratamiento erlotinib el fin de inhibir más potentemente el crecimiento de células de NSCLC EGFR TKI-resistentes.
primera prueba la FAK inhibidor PF-228 [36] y se evaluó su capacidad para dependiente de la dosis (0,001 a 25 mM) inhibir el crecimiento de líneas celulares de NSCLC
in vitro
. El tratamiento de las células con dosis crecientes de PF-228 indicó que todas las líneas celulares resistentes a TKI de EGFR tres (A549, H1299, H1975) eran sensibles a este fármaco a concentraciones superiores a 1 mM (Fig 1A). Los valores de IC50 para PF-228 determina a partir de la gráfica fueron: 5,6 M (R
2 = 0,92) en el A549, 6,6 M (R
2 = 0,95) en H1299 y 10,4 M (R
2 = 0,80 ) en H1975. Curiosamente, la viabilidad de las dos líneas de células EGFR TKI-sensibles (HCC827, HCC4006) [34] fue mucho mayor (~ 75% de las células restantes viables en comparación con el control tratado) que las líneas celulares de EGFR TKI-resistentes (~ 10% de las células restantes viable en comparación con control tratado) a la dosis más alta de PF-228 probado (25 M) (Fig 1A), aunque la razón de esta diferencia en la viabilidad todavía no se entiende. Como las dos líneas celulares que tenían resistencia inherente a erlotinib y eran tanto EGFR de tipo salvaje parecía ser más sensibles al inhibidor de FAK que las células H1975 que tenían mutaciones de EGFR que resulta en la sensibilidad adquirida, se examinó si las células inicialmente sensibles a erlotinib también se convirtieron más sensibles a la FAK al obtener la resistencia a los medicamentos adquiridos. HCC4006 células que se hizo resistente a erlotinib siguiente pasos en serie en concentraciones crecientes de erlotinib hasta 3μM, dio lugar a clones de células con un número significativamente menor sensibilidad a erlotinib con CI50 de 1,3 M (R
2 = 0,87) y 16,8 micras (R
2 = 0,73) para los clones resistentes a 1 y 2, respectivamente, en comparación con las células control que se sometieron a pases en serie en volúmenes iguales de control de DMSO con un IC50 de 0,21 M (R
2 = 0,91) (Fig 1B). Hay que señalar que estos dos clones exhiben resistencia erlotinib a niveles similares o superiores a las líneas parentales resistentes elegido (con CI50 que van desde 1.2μM, 5.3μM y 5.9μM para A549, H1299 y H1975, respectivamente). Erlotinib células HCC4006 resistentes mostraron una mayor sensibilidad a Fak inhibidores con IC50 de 8,0 M (R
2 = 0,96) y 8,7 M (R
2 = 0,95) para los clones 1 y 2 respectivamente, en comparación con el control clon HCC4006 con una IC50 de 12,3 M (R
2 = 0,90) (figura 1C). Mientras que los clones de células resistentes a erlotinib sí mostraron una mayor sensibilidad a los inhibidores de la FAK, permanecieron menos sensible a PF-228 en comparación con EGFR de tipo salvaje A549 intrínsecamente resistentes o erlotinib células H1299. Por tanto, es poco probable que el principal mecanismo de resistencia adquirida a erlotinib en el mutante EGFR NSCLC depende significativamente de la actividad de FAK.
(A) La viabilidad celular se evaluó después del tratamiento con PF-228 a dosis variables durante 48 horas en completa medios con FBS al 5%. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT con la viabilidad de las células tratadas con DMSO establecidos como 100%. Los datos indican la media ± SEM para acceder [inhibidor] vs. respuesta normalizada a partir de dos experimentos llevados a cabo de forma independiente. las células (B) en serie HCC4006 cultivadas en concentraciones crecientes de erlotinib hasta 3 M se confirmaron resistente en comparación con células parentales siguiente ensayo de MTT de las células tratadas con concentraciones crecientes de erlotinib. Los datos se representa gráficamente como la media de log [inhibidor] vs respuesta normalizada ± SEM (N = 2). las células (C) HCC4006 resistente Erlotinib son más sensibles a Fak inhibidor PF-228 que las células HCC4006 parentales. Las células se trataron con concentraciones crecientes de PF-228 y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Los datos se presentan como la media de log [inhibidor] vs respuesta normalizada ± SEM (N = 2). (D) la expresión de proteínas resistentes relativa entre erlotinib (A549, H1299, H1975) y sensible (HCC827, HCC4006) líneas celulares de sus padres. (E) A549 lisados celulares se inmunoprecipitaron para endógeno FAK y se sometieron a
in vitro
ensayos in quinasa en presencia de DMSO (control vehículo) o PF-228 (1 M o 5 M). Autorradiografía reveló la fosforilación de FAK (FAK autorradiografía) y Western Blot indicó niveles totales de FAK (IB: FAK).
También evaluamos si la sensibilidad a los inhibidores de la FAK observados en las líneas celulares de cáncer de los padres se asoció con expresión basal de cualquiera de las proteínas principales en estas vías objetivo de drogas. La sensibilidad a la droga FAK no parece que se correlaciona con los niveles generales de FAK, EGFR o proteínas beta 1 integrina, ya que estos niveles aparecieron variable en ambas líneas celulares sensibles e insensibles (Fig 1D). Dado que las líneas celulares de NSCLC tres EGFR TKI resistentes tenían valores de CI50 para PF-228 va de 5 a 10 mM, y que nuestro laboratorio habían observado previamente la inhibición de tanto la actividad de autofosforilación y quinasa de FAK en 5 M PF-228 [20] , se confirmó la actividad de este inhibidor en las células A549 después de
in vitro
ensayos de quinasa en la autofosforilación de FAK. La adición de PF-228 a la reacción de la quinasa inhibida significativamente FAK autofosforilación en las células A549 (Fig 1E) con resultados similares se observaron en las líneas celulares H1299 y H1975 (datos no mostrados). Por lo tanto, los experimentos posteriores se realizaron con concentraciones de PF-228 en el intervalo de 1-10 mM.
FAK inhibidor PF-228 sinergia con erlotinib para reducir más eficazmente la viabilidad celular en células de NSCLC de EGFR de tipo salvaje
Como el tratamiento con FAK TKI solo parecía inhibir la viabilidad de las células de NSCLC EGFR TKI resistentes probados en la figura 1, el próximo querían determinar si la adición de PF-228 podría sensibilizar a las células a erlotinib, o por lo menos , dar lugar a una reducción aditiva en la viabilidad celular por encima y más allá de la de un tratamiento con erlotinib solo. Las células fueron así tratados con erlotinib (1-25 mM) o PF-228 (1-10 mM) solo y en combinación y la viabilidad celular se evaluó por la actividad de MTT. Las tres líneas celulares ensayadas exhibieron resistencia al tratamiento con erlotinib solo, incluso a concentraciones muy altas (es decir, 25 M, figura 2A), que confirma los resultados de estudios anteriores con respecto a EGFR resistencia TKI de EGFR de tipo salvaje y T790M líneas celulares que contienen la mutación [34, 35,37-39]. Cuando erlotinib y PF-228 se utilizaron en combinación se observó un aumento del efecto citotóxico en el A549, H1299 y H1975 células como lo había hecho la hipótesis (Figura 2A). Se utilizó el método de Chou-Talalay para determinar la naturaleza del efecto de la combinación de drogas [31]. Se determinó el índice de combinación (IC) mediante el trazado de la fracción afectada, donde IC valores inferiores a 1 se consideran sinérgico; IC valores superiores a 1 se consideran antagónicas, y los valores de CI igual a 1 se considera aditivo. Se encontró que la combinación de erlotinib y PF-228 que resulta en la reducción de la viabilidad celular para ser sinérgico en las tres líneas celulares analizadas (Fig 2B). Como un sistema secundario se empleó el uso de explantes tumorales paciente de cáncer de pulmón humano para poner a prueba la eficacia de FAK TKIs en células de cáncer de pulmón. explantes tumorales de pacientes no seleccionados sometidos a toracotomía para los cánceres de pulmón en fase inicial fueron tratados
in vitro
con erlotinib o FAK ITC solos o en combinación. El tratamiento del tumor de pulmón explantado con erlotinib solo mostró una disminución modesta, pero no estadísticamente significativa en la viabilidad celular (Fig 2C, panel izquierdo). modestas reducciones similares de la viabilidad celular, también se observaron en los tejidos pulmonares normales adyacentes después del tratamiento erlotinib solo (Fig 2C, panel derecho). Hemos observado que los cánceres de pulmón de pacientes también fueron sensibles a la inhibición de FAK TKI con una tendencia hacia la inhibición más eficaz cuando se utiliza en combinación con erlotinib (Fig 2C). A pesar del tamaño pequeño de la muestra y la variabilidad asociada con las pruebas en los tejidos heterogéneos (es decir, diferentes relaciones de tumor de estroma pueden ocurrir en cada muestra de paciente), nos animaron por el beneficio obvio de la combinación de fármacos durante el tratamiento con erlotinib solo, similar a lo que hemos observado en nuestros experimentos de líneas celulares. De importancia adicional, el tejido pulmonar normal adyacente parecía ser afectada por los tratamientos de FAK TKI solos o en combinación con erlotinib (Fig 2C), lo que sugiere un potencial de inhibición selectiva de tumores de NSCLC.
Las células (A) fueron tratados con PF -228 y erlotinib durante 48 horas y se ensayó la viabilidad celular usando el ensayo de MTT. Los datos indican la media ± SEM para la viabilidad celular se presenta como un porcentaje de células tratadas con DMSO de control (100% viable) a partir de dos experimentos realizados independientemente. (B) Índice fracción afectada /Combinación (IC) parcelas que indican la citotoxicidad sinérgica de erlotinib y PF-228. IC & lt; 1 se consideran sinérgico, IC & gt; 1 son considerados antagónicos, y los IC = 1 se consideran aditivos. (C) FAK inhibición reduce la viabilidad celular en el tejido tumoral de pulmón humano normal, pero no tejido pulmonar
ex vivo. Los tejidos de cinco pacientes no seleccionados fueron tratados durante 48 horas con control de vehículo (DMSO), erlotinib (10 mM), PF-271 (5 M), o la combinación de erlotinib y PF-271. La viabilidad celular se evaluó tanto para el tejido tumoral y el tejido normal por alamarBlue de tres pozos por condición con cada uno de tres piezas de tejido 1 mm x 2 mm y que contienen. La fluorescencia se normalizó a las lecturas de fluorescencia base para cada tratamiento bien llevado fármaco antes. La experimentación se llevó a cabo de forma independiente en cada muestra de paciente fluorescencia media se indican para cada condición como una línea horizontal y diferencias estadísticamente significativas se determinaron por ANOVA y se indican como
P
valores por encima de la comparación.
a fin de determinar si la disminución observada en la viabilidad celular correlaciona con un aumento del nivel de apoptosis en las células tratadas, se analizó la población subG1 de las células después del tratamiento ya sea con erlotinib o PF-228 solo o en combinación con la tinción de yoduro de propidio de contenido de ADN y citometría de flujo análisis. En las células A549, el tratamiento de combinación de erlotinib y PF-228 (5 tratamiento mu M) produjo un aumento estadísticamente significativo de la población subG1 de las células en comparación con el control (aumento ~ 6 veces), además de exhibir un incremento significativo de la porcentaje de células subG1 en comparación tanto con el tratamiento erlotinib solo (
P
& lt; 0,001) y el tratamiento PF-228 solo (
P
& lt; 0,001) (Fig 3A). ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga. ß-actina se utilizó como control de carga.