Extracto
Los fibroblastos de la microambiente tumoral es un determinante clave en la progresión del cáncer y puede ser un objetivo prometedor para la terapia del cáncer. factor de crecimiento similar a la insulina proteína de unión 7 (IGFBP7) se conoce como un supresor de tumores en el cáncer colorrectal (CRC). El presente estudio investigó el mecanismo de inducción de la expresión IGFBP7 en fibroblastos de sobrenadante de la línea celular de CRC, SW620. Los resultados mostraron que la expresión de IGFBP7 fue hasta reguladas en los fibroblastos cuando se tratan con SW620 sobrenadante y exógeno TGF-β1. El IGFBP7 inducida por SW620 sobrenadante o TGF-β1 se inhibió parcialmente por el TGF-β1 anticuerpo específico AF y antagonista del receptor de TGF-β1 SB431542. Los genes de señalización de orientación por Wnt, c-Myc, CCND1 y las proteínas Dvl2 /3, fueron hasta reguladas en los fibroblastos que expresan altos niveles de IGFBP7, y la sobre regulación puede ser inhibida tanto por la señalización antagonista Wnt Dickkopf-1 ( DKK1) y por el antagonista del receptor de TGF-β1 SB431542. En conclusión, las células de CRC promueven la alta expresión de IGFBP7 en los fibroblastos, lo más probable a través de la co-regulación de TGF-β y la señalización de Wnt en una forma dependiente de Smad2 /3-Dvl2 /3. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que los fibroblastos podrían ser una nueva diana terapéutica en la terapia tumoral
Visto:. Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen H, Wu DJ, Deng H (2014) alta expresión de IGFBP7 en fibroblastos inducida por las células del cáncer colorrectal es co-regulados por TGF-β y la señalización de Wnt en un /3-Dvl2 Manner Smad2 /3-dependiente. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10.1371 /journal.pone.0085340
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 7 Julio, 2013; Aceptado: 4 de diciembre de 2013; Publicado: 10 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Rao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LY12H16027), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30870971) y el Programa Principal de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81090420, 81090421). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores más malignos que amenazan la supervivencia humana en todo el mundo, ocupando el tercer lugar entre todos los tumores malignos [1]. La invasión y la metástasis de las células tumorales son la principal causa de muerte. La mayoría de la investigación se ha centrado en el propio tumor, sin embargo, el papel importante del microambiente en la progresión tumoral también ha llegado a ser reconocido.
Un tumor puede ser pensado como una herida que no se cura, la invasión y la metástasis no sólo se determinan por las células cancerosas, pero también por el estroma tumoral [2]. Los micro-metástasis forman mucho antes de que un tumor se puede diagnosticar, y la interacción tumor-estroma juega un papel importante durante la progresión tumoral. Los fibroblastos son uno de los componentes de las células más importantes del estroma tumoral, en el que siempre adquieren un fenotipo activado [3]. Al igual que en la fibrosis, tumores en los fibroblastos activados permanecen persistentemente; que secretan y modulan la matriz extracelular (ECM) en el estroma que juega un papel importante durante la progresión del tumor [3] - [5].
IGFBP7 es una proteína secretada que se sabe que es un supresor de tumor en la mama , cerebro, colon, pulmón, hígado y páncreas [6] - [11]. Es una glicoproteína de células adhesivo de ~ 30 kD [12]. In vivo, diferentes patrones de expresión de IGFBP7 se encuentran en diferentes tipos de tumores. expresión IGFBP7 es baja en el glioblastoma, el cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de hígado [6], [9], [10], [13], mientras que el aumento o disminución de la expresión de IGFBP7 se han reportado en el cáncer de mama y de próstata [14] - [17]. Estos hallazgos sugieren que el papel de IGFBP7 en las células tumorales es complejo, aunque estudios sobre IGFBP7 en células de estroma tumoral sí mismos son raros. En un informe, se encontró IGFBP7 para promover la angiogénesis en las células endoteliales [18], aunque el papel exacto de IGFBP7 en fibroblastos es aún desconocido.
Durante las interacciones tumor-estroma, fibroblastos pueden verse afectados por la señalización paracrina generada por Células cancerígenas. Entre estas señalizaciones, se piensa que el TGF-β para ser el más potente. fibroblastos TGF-ß-activados crean un importante pro-invasión y nicho de pro-angiogénesis para el desarrollo de tumores [19] - [21]. Se ha informado de que la señalización de TGF-β actúa principalmente a través de las vías de Smad [22]. Tras la activación, el ligando TGF-β se une al receptor TGF-β I /II (TβRI /II), y los reclutas TβRI fosforilados y fosforila Smads regulados por el receptor (R-Smads). El complejo TβRII-ALK5 activa Smad2 /3, mientras que el complejo TβRII-ALK1 activa Smad1 /5/8. Una vez activado, R-Smads fosforilan y forman complejos con Smad4, y se mueven en el núcleo para regular la actividad transcripcional [23].
Además de la señalización de TGF-β, la señalización de Wnt también juega un papel importante en el desarrollo de CRC . Los informes han señalado que ~ 90% de los casos de CCR se deben a mutaciones de la vía de señalización Wnt [24]. Tras la activación de Wnt canónica, ligandos Wnt se unen a receptores Frizzled y PRL (proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) para promover la fosforilación de PRL de manera DVL-dependiente [25], [26]. Entonces p-LRP recluta Axins del complejo de degradación de la membrana celular, ayudando β-catenina para escapar de la degradación. Los acumulados β-catenina se mueve desde el citoplasma al núcleo, y forma un complejo de activación de la transcripción con TCF /LEF. El /LEF-β-catenina complejo nuclear TCF activa la transcripción de genes diana de señalización Wnt, tales como c-Myc, CCND1, FGF20, DKK1 y WISP1, que regulan la proliferación celular y la diferenciación [26] - [29].
En este estudio, se utilizó el sobrenadante de SW620, una línea celular de CRC que se deriva de la tumor metastásico de un carcinoma colorrectal, y HELF que es una de las líneas celulares de fibroblastos canónicas. El hecho de que tanto SW620 y HELF son líneas celulares negativas IGFBP7 hace que la interpretación de los hallazgos más inequívoca. El propósito de este estudio es examinar el patrón de expresión de IGFBP7 en fibroblastos y el mecanismo detrás de él.
Materiales y Métodos
Reactivo y los anticuerpos
proteína recombinante TGF-β1 se adquirió de PeproTech, EE.UU.. AF (TGF-β1 de anticuerpos neutralizantes) y la proteína recombinante DKK1 se adquirieron de R & amp; D, EE.UU.. SB431542 (TGF-β /ALK5 /inhibidor de Smad2) se obtuvo de Sigma, EE.UU.. Las fuentes comerciales de anticuerpos primarios fueron los siguientes: de conejo anti-fosfo-Smad2 (Ser465 /467), ratón anti-Smad2, conejo anti-β-catenina, conejo anti-TβRII y conejo Kit anti-Wnt de señalización Antibody Sampler, Señalización Celular tecnología, EE.UU.; anticuerpo anti-β-actina de conejo, Santa Cruz, EE.UU.. Los anticuerpos secundarios para Odyssey fueron adquiridos de Li-COR, EE.UU..
Los cultivos de células
fibroblastos (CAES) y el CRC línea celular SW620 eran ambos cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, EE.UU.) suplementado con penicilina estreptomicina Solution (100 U /ml de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, Gibco, EE.UU.), 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 50% de sobrenadante de la línea celular SW620 CRC. El medio de cultivo se cambió al día durante 3 días, para ambas líneas celulares. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera.
Preparación de SW620 sobrenadante
CRC línea celular SW620 se sembró en matraces de cultivo (8 × 10
5 células) en RPMI1640 suplementado con penicilina-estreptomicina Solution (como arriba), y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco, EE.UU.). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera. Se recogió el sobrenadante (SW620-S) después de 2 días, se filtra con una membrana de 0,22 micras filtro (Millipore, Irlanda) y almacenados a -80 ° C.
Célula de tratamiento
Los fibroblastos cultivados en frascos de cultivo se lavaron con PBS dos veces y luego reemplazado por RPMI1640 solo o 50% RPMI1640 suplementado con 50% frescos SW620-S, diferentes concentraciones de la proteína TGF-β1 recombinante, con o sin AF, SB431542 para varios períodos de tiempo; Los tratamientos se actualizan cada 3 días, y la expresión de IGFBP7 fue detectado por cuantitativa en tiempo real PCR, RT-PCR y análisis de transferencia Western.
Quantitative PCR en tiempo real (Q-PCR) y RT-PCR
ARN total a partir de fibroblastos tratados o no tratados se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE.UU.) y transcripción inversa en ADNc usando transcriptasa inversa Superscript II (Takara, Japón). reacciones Q-PCR se realizaron con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Japón) en el Sistema de PCR rápida en tiempo real ABI 7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.). Los cebadores utilizados para la Q-PCR fueron diseñados de acuerdo con el GenBank (Tabla S1). Las condiciones de Q-PCR fueron las siguientes: 10 segundos de desnaturalización a 95 ° C, 5 segundos de desnaturalización a 95 ° C, 30 segundos de hibridación de extensión a 60 ° C durante 40 ciclos. La fluorescencia se detecta al final de cada fase. La transcripción de IGFBP7 se normalizó a nivel de la transcripción del gen constitutivo GAPDH. reacciones de RT-PCR se realizaron con Taq (Takara, Japón). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: 5 minutos de desnaturalización a 94 ° C, 30 segundos de desnaturalización a 94 ° C, 30 segundos de hibridación a 59 ° C, extensión de 30 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos, la extensión 5 minutos a 72 ° DO. La transcripción de IGFBP7 se normalizó a nivel de la transcripción del gen constitutivo GAPDH.
Western blot
Los fibroblastos se lisaron en tampón RIPA. Los lisados celulares se centrifugaron a 1,33 × 10
5 rpm durante 1 hora a 4 ° C, y el contenido de proteína en el sobrenadante se midió usando el ensayo de proteína BCA. 50 g de extracto de proteína total se cargó en un gel de SDS-PAGE 10% y luego proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, EE.UU.). La membrana se bloqueó con 5% descremada TBST leche (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% v /v de Tween-20) durante 2 horas a temperatura ambiente y se incubó con el anticuerpo primario (1:1000) durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con TBST 3 veces, las transferencias se sondaron con anticuerpo secundario (1:5000) durante 1 hora a temperatura ambiente. β-actina se utilizó para normalizar la cantidad de la muestra de proteína cargado. Las inmunotransferencias fueron escaneados con Odyssey (LI-COR, EE.UU.). Evaluación semicuantitativa de las bandas se realizó por análisis densitométrico con el software ImageJ.
La inmunofluorescencia
Las células sobre cubreobjetos se fijaron en acetona fría durante 10 minutos. Los cubreobjetos con células entonces se lavaron con PBS 3 veces durante 5 minutos a temperatura ambiente, a continuación, permeabilizadas en 0,05% de Triton X-100 durante 20 minutos y se bloquearon con suero bovino normal al 10% durante 30 minutos. Las células se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en PBS durante la noche a 4 ° C. Los cubreobjetos se lavaron en PBS antes de la incubación durante 1 hora con anticuerpos secundarios y 20 minutos con DAPI (1: 5000; Invitrogen). Las imágenes fueron tomadas por un microscopio confocal Zeiss LSM510.
Análisis de los datos
Los resultados se expresan como media ± S.E.M. de 3 experimentos. Se utilizó la prueba t no pareada para las comparaciones individuales de los grupos con igual varianza y la distribución normal. Análisis de la varianza (ANOVA) seguido de Newman-Keuls post prueba se utilizó para comparar múltiples de datos para cada grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism (GraphPad, EE.UU.).
P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados
La expresión de alto IGFBP7 en fibroblastos es inducida por SW620-S
Dado el tumor- papel supresor de IGFBP7 en líneas de CRC de células [30] y la alta expresión en el frente invasivo de tumores CRC (resultados no publicados), los presentes resultados mostraron que SW620-S indujo la expresión IGFBP7 en fibroblastos, después de la incubación de los fibroblastos en presencia de SW620-S para diversos períodos de tiempo. Los resultados revelaron que SW620-S sustancialmente hasta reguladas el nivel de IGFBP7, en comparación con el grupo control. Los fibroblastos expuestos a SW620-S mostró un tiempo dependiente de la regulación de IGFBP7 mRNA (Figura 1A y 1B). Además, la expresión de alto IGFBP7 también fue detectado en fibroblastos tratados con el sobrenadante de las otras dos líneas celulares de CRC HT29 y Lovo (Figura 1C y 1D, la figura S1).
A. B. expresión mRNA IGFBP7 determinado por RT-PCR (A) y Q-PCR (B) en los fibroblastos expuestos a SW620-S para 0, 2, 4 y 6 días, respectivamente. expresión C. D. IGFBP7 mRNA determinado por RT-PCR en los fibroblastos expuestos a HT29-S (C) y Lovo-S (D) para 0, 2, 4 y 6 días. El nivel de ARNm se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. *
P
. & Lt; 0,05 entre los fibroblastos tratados con SW620-S y el grupo control (0 días)
TGF-β1 en SW620-S induce la expresión en fibroblastos IGFBP7
estudio previo de los factores secretados por las líneas celulares de CRC han demostrado que las células cancerosas secretan TGF-β1 durante las interacciones tumor-estroma [31]. En el supuesto de que la inducción IGFBP7 era debido a TGF-β1, los fibroblastos se expusieron a 5 ng /ml de TGF-β1 exógeno; que mostraron un aumento dependiente del tiempo en IGFBP7 mRNA (Figura 2A y 2B). Además, los fibroblastos expuestos a diferentes concentraciones de TGF-β1 exógeno que van desde 5 ng /ml a 20 ng /ml para 6 días mostraron un aumento dependiente de la dosis en IGFBP7 mRNA (Figura 2C y 2D). Los datos mostraron que la expresión de IGFBP7 no es sólo depende del tiempo sino también de la concentración de TGF-β.
A. B. expresión mRNA IGFBP7 determinado por RT-PCR (A) y Q-PCR (B) en los fibroblastos expuestos a RPMI1640 o 5 ng /ml de TGF-β1 para 0, 2, 4 y 6 días. expresión C. D. IGFBP7 mRNA en fibroblastos expuestos a 0, 5, 10 y 20 ng /ml de TGF-β1 durante 6 días determinados por RT-PCR (C) y Q-PCR (D). EF Los fibroblastos fueron tratados con SW620-S o 5 ng /ml de TGF-β1 en presencia de 0, 20, 200 ng ml AF /durante 6 días, el ARNm IGFBP7 en fibroblastos fue detectado por RT-PCR (E) y Q-PCR (F). El nivel de ARNm se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. *
P Hotel & lt; 0,05 entre SW620-S /fibroblastos tratados con TGF-β1 y grupo de control.
+
P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos SW620-S-tratadas con o sin 20 ng /ml AF.
++
P
& lt; 0,05 entre los fibroblastos SW620-S-tratados con o sin 200 AF ng /ml.
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P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos TGF-beta 1-tratada con o sin 20 ng /ml AF.
##
P
. & Lt; 0,05 entre los fibroblastos TGF-beta 1-tratada con o sin AF 200 ng /ml
Para verificar que el TGF-β1 fue la proteína secretada por las células CRC responsable de la inducción IGFBP7, se utilizó immunodepletion con un anticuerpo TGF-β1-específico (20 ng /ml AF) para eliminar el TGF-β1 de la SW620-S. Este immunodepleted SW620-S no inducir IGFBP7 en fibroblastos (Figura 2E). Los fibroblastos tratados con SW620-S o TGF-β1 en presencia de AF inhibieron parcialmente la IGFBP7 inducida por SW620-S o TGF-β1 por sí solo, lo que indica que el TGF-β1 era la principal, pero no el único, factor que IGFBP7 inducida ( Figura 2F).
la expresión de alto IGFBP7 en fibroblastos es principalmente a través de TGF-β /ALK5 /Smad2 vía de señalización
en la señalización de TGF-β, el complejo TβRII-ALK5 fosforila Smad2 /3. Con el fin de determinar si la inducción de IGFBP7 fue a través de la señalización dependiente de Smad2, se añadió SB431542 (un antagonista selectivo de TGF-β ALK5 de señalización //Smad2) para fibroblastos. En fibroblastos expuestos a SW620-S o exógeno TGF-β1 con 10 M SB431542, la inducción IGFBP7 fue parcialmente inhibida (Figura 3C y 3D). Alta expresión de P-Smad2 se detectó en los fibroblastos tratados con SW620-S para diversos períodos de tiempo. Esta regulación de P-Smad2 fue dependiente del tiempo, alcanzando un máximo en el día 6 (Figura 3B). Los niveles de p-Smad2 (Figura 3E) y TβRII (Figura 3A) aumentó en SW620-S o exógeno TGF-β1 se redujeron al nivel normal por SB431542, lo que indica que esta regulación era a través de la TβRII-ALK5 Smad2 /3 vía.
A. La expresión de TβRII se detectó por Western blot. B. Los fibroblastos se expusieron a SW620-S para 0, 2, 4 y 6 días, y p-Smad2 se detectó por Western blot. Los niveles de proteína se normalizaron a la de la β-actina en los mismos extractos celulares. DISCOS COMPACTOS. Los fibroblastos se expusieron a SW620-S o TGF-β1 en presencia de 10 mM SB431542 durante 6 días, y la expresión IGFBP7 mRNA se detectó mediante RT-PCR (C) y Q-PCR (D). El nivel de ARNm se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. E. Los fibroblastos se expusieron a SW620-S o TGF-β1 con 10 M SB431542 durante 6 días, y la expresión de Smad2, p-Smad2 (E) se detectó por Western blot. Los niveles de proteína se normalizaron a la de la β-actina en los mismos extractos celulares.
*
P Hotel & lt; 0,05 entre SW620-S /fibroblastos tratados con TGF-β1 y grupo de control.
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P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos SW620-S-tratados con o sin SB431542,
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P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos TGF-beta 1-tratada con o sin SB431542.
IGFBP7 sobre regulación en los fibroblastos es parcialmente a través de la activación de la vía de señalización Wnt canónica
Desde vía de señalización Wnt regula la activación de fibroblastos, nos dispusimos a determinar si Wnt , en especial la vía de señalización Wnt canónica, era otro regulador. Los fibroblastos tratados con SW620-S mostraron alta expresión de c-Myc y CCND1, los genes diana aguas abajo de la señalización de Wnt, de una manera dependiente del tiempo. La canónica de Wnt proteína de señalización de β-catenina detectado por Western blot (Figura S2A) se incrementó y se activa tal como se muestra por microscopía immunofluorence (Figura S2B), que indica que la señalización de Wnt canónica se activó durante IGFBP7 regulación (Figura 4A y 4B).
A. B. Los fibroblastos fueron tratados con SW620-S para 0, 2, 4 y 6 días, y la expresión de mRNA de la Wnt de señalización de c-myc (A) y CCND1 de expresión (B) de ARNm se evaluó mediante Q-PCR genes diana. C-E. Los fibroblastos fueron tratados con SW620-S en presencia de 50 ng /ml DKK1 (Wnt antagonista) durante 6 días, y la expresión IGFBP7 mRNA se detectó mediante RT-PCR (C) y Q-PCR (D). La expresión de mRNA se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. El Wnt proteína de señalización DVL3 se detectó en fibroblastos por Western blot (E). La expresión de proteínas se normalizó a la de la β-actina en el mismo extracto celular. *
P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos tratados con SW620-S y el grupo de control. **
P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos tratados con DKK1 y grupo de control.
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P
. & Lt; 0,05 entre los fibroblastos SW620-S-tratados con o sin DKK1
Después de haber demostrado que la señalización Wnt se activó, que luego investigó la relación entre este activación y la alta expresión de IGFBP7. DKKs se secretan glicoproteínas que son conocidos para antagonizar canónica Wnt de señalización [32]. Cuando los fibroblastos fueron tratados con DKK1, la alta expresión de IGFBP7 inducida por SW620-S fue parcialmente inhibida (Figura 4C y 4D). Las proteínas de señalización Wnt Dvl2 /3 detectados por Western blot fueron inhibidos por DKK1 (Figura 4E), lo que sugiere que la regulación de IGFBP7 estaba estrechamente relacionada con la vía canónica de señalización Wnt. Por lo tanto, los factores responsables de la alta expresión de IGFBP7 pueden ser TGF-β1 y Wnt como ligandos Wnt3a que activa el TGF-β y la vía de señalización de Wnt.
TGF-β y la vía de señalización Wnt canónica cooperar en la regulación de la expresión elevada de IGFBP7 en fibroblastos
con el fin de aclarar la relación entre el TGF-β y la vía de señalización Wnt, hemos tratado con fibroblastos TGF-β1, y se encontró que también aumentó el nivel de c-Myc , CCND1 y DKK1; Por otra parte, esta regulación se inhibió parcialmente por SB431542 (Figura 5A-5C). Estos resultados se observaron a nivel de proteínas, como las proteínas Dvls son mediadores positivos de Wnt de señalización situado aguas abajo de los receptores Frizzled y aguas arriba de β-catenina. DVL3 fue hasta reguladas por el tratamiento de TGF-β1 (Figura 5D), indicando que la señalización de Wnt se activó durante la interacción y este cambio se invirtió por el antagonista de TGF-β SB431542, lo que sugiere que con TGF-β activación de señalización, la señalización de Wnt también fue activado. Por lo tanto, encontramos la existencia de una novela de la diafonía entre Wnt y TGF-β señalización que era Dvl2 /3-Smad2 /3-dependiente.
A-D. Los fibroblastos se expusieron a SW620-S o TGF-β1 en presencia de 10 mM SB431542 para 6 días, y la expresión de mRNA de la Wnt genes diana señal de c-Myc (A), CCND1 (B) y DKK1 (C) fueron evaluados por Q-PCR. la expresión de ARNm se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. La expresión de DVL3 se detectó por Western blot (D). La expresión de proteínas se normalizó a la de la β-actina en el mismo extracto celular. *
P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos tratados con SW620-S y el grupo de control. **
P
. & Lt; 0,05 entre el TGF-beta 1 tratados con fibroblastos y grupo de control
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P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos SW620-S-tratados con o sin SB431542.
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P Hotel & lt; 0,05 entre los fibroblastos TGF-beta 1-tratada con o sin SB431542. E. Modelo de alta expresión de IGFBP7 inducida por las interacciones de células de fibroblastos de tumores. activación de la señal de TGF-β F. hasta regula Smad2 /3 y Dvl2 /3, acompañado por la sobre regulación de los genes Wnt objetivo de c-myc, CCND1 y DKK1, de tal manera que se expresa sobre IGFBP7.
Discusión
Estos experimentos han demostrado que el sobrenadante de la línea celular SW620 (SW620-S) IGFBP7 inducida en fibroblastos principalmente a través de la co-regulación de TGF-β ALK5 señalización Smad2 y la señalización //canónica de Wnt . Esta es la primera evidencia de la mecanismo subyacente a la expresión de alto IGFBP7 en fibroblastos durante las interacciones tumor-estroma. Nuestra hipótesis es que IGFBP7 es uno de los genes diana aguas abajo de TGF-β /Smad2 y la señalización de Wnt canónica, aunque la posición exacta de IGFBP7 todavía necesita más investigación.
En este estudio, hemos demostrado que las células CRC inducida por una alta expresión de IGFBP7 (Figura 5E). Como IGFBP7 es un supresor de tumor, más investigación sobre IGFBP7 se ha centrado en las propias células tumorales. En un modelo de xenoinjerto de tumor, por ejemplo, la sobre-expresión de IGFBP7 inhibió el crecimiento de melanoma [33]. ¿Por qué entonces las células tumorales secretan factores que inducen IGFBP7 que a su vez suprime su propio crecimiento? Este puede ser el resultado de la resistencia de los fibroblastos a las células tumorales. ¿Cuál es el significado de la expresión elevada de IGFBP7 en fibroblastos? En la actualidad, esto es difícil de evaluar, ya que hay poca investigación sobre el papel de IGFBP7 en el estroma tumoral. Se encontró IGFBP7 altamente expresado en los vasos de glioma [34]; que puede interactuar con la proteína de la matriz extracelular para inducir la adhesión y migración de las células endoteliales [35], [36]. Pen y colegas también informaron que IGFBP7 en las células endoteliales puede inducir la angiogénesis [18]. Otros encontraron que IGFBP7 probablemente participa en la activación y proliferación de fibroblastos [37]. Estas observaciones sugieren que IGFBP7 en las células tumorales en el estroma puede jugar un papel completamente diferente de IGFBP7 en las células del estroma de los tumores. Nuestros datos no publicados demostraron que IGFBP7 puede correlaciona con la activación de los fibroblastos, pero el significado detallada de su alta expresión en fibroblastos es aún desconocida y requiere más investigación
.
Nuestros resultados mostraron que la expresión en fibroblastos IGFBP7 está estrechamente relacionado con el TGF-β secretada por las células de CRC. Además, la expresión de IGFBP7 no sólo es dependiente del tiempo, sino también dependiente de la dosis con respecto a TGF-β. El anticuerpo y el inhibidor de TGF-β confirmaron este resultado. Se ha informado de que la señalización de TGF-β también ha regulado la expresión de IGFBP7 en las células cerebrales endoteliales [18], un ejemplo más de un compartimento de células del estroma. Y sabemos, el TGF-β de señalización /Smad3 se ha considerado como supresor de tumor durante la progresión tumoral desde CDKN1A inducida por TGF-β (P16), y CDKN2B expresión (P15) se correlaciona con la inhibición del tumor [38]. Sin embargo, otra investigación encuentra que CTGF y PAI-1, el gen diana aguas abajo del TGF-β /Smad3 señalización, se correlaciona con un alto riesgo de metástasis en el cáncer de mama [39]. Sugiere TGF-β /Smad3 puede promover inversamente la invasión y la migración en la última etapa de la formación de tumores [40], [41]. Por lo tanto, se especula que el TGF-β secretada por células de cáncer que promueven la expresión IGFBP7 en fibroblastos puede disminuir el papel supresor de tumores para los fibroblastos en el tejido tumoral
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La relación de IGFBP7 y la señalización de Wnt no se ha investigado, y nuestro estudio es el primero en mostrar que la señalización Wnt puede regular la expresión de IGFBP7 en los fibroblastos. Se ha informado de que la señalización de Wnt /β-catenina regula la diferenciación de los fibroblastos, lo que sugiere que la señalización /β-catenina Wnt es un importante regulador del fenotipo de fibroblastos [42]. Esto sugiere que la señalización de Wnt puede afectar IGFBP7 a través de la mediación de la estado de diferenciación de los fibroblastos.
señalización de Wnt se sabe que se activa cuando los fibroblastos se activan por el TGF-β [43]. Aquí nos dimos cuenta de que la señalización Wnt se activa durante la inducción IGFBP7 en fibroblastos TGF-β por. Es extraño que a excepción de c-Myc y CCND1, la expresión de DKK1 era también hasta reguladas por el TGF-β. Sabemos que es un antagonista DKK1 canónica de señalización Wnt. Estos hallazgos publicados son incompatibles con nuestros resultados. Sin embargo, además, debemos señalar que DKK1 es también el objetivo del gen Wnt de señalización [28]. Esto puede ser un mecanismo de retroalimentación negativa entre estas dos vías de señalización. Estas dos señales pueden cooperar durante la inducción IGFBP7 en los fibroblastos. Con respecto a la forma en que cooperan: se encontró que estaban conectados por Smad2 /DVL3. Hay varias explicaciones para la interacción entre estas dos vías de señalización. Un modo de interacción entre Wnt /β-catenina y TGF-β /Smads señales es la interacción entre Smads y β-catenina /TCF4 [44]. Otro modo puede ser por Wnt5a inducir la formación de la MARK2 /DVL3 /Smad4 complejo [45]. Sin embargo, otro modo puede ser Wnt3a promover un fenotipo asociados con el cáncer fibroblastos-como en los fibroblastos, parcialmente a través del TGF-β /Smad2 de señalización de activación por un mecanismo de β-catenina dependiente de [46], lo que indica que Wnt y la señalización de TGF-β están vinculados por Smad. A partir de nuestros resultados, en los fibroblastos, la activación de Wnt inducida por el TGF-β era más probable es que a través de la regulación de Smad y DVL3. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que DVL3 puede ser un nuevo punto de diafonía entre el TGF-β y vías de señalización Wnt en los fibroblastos. Smad2 /3 y Dvl2 /3 pueden formar algún tipo de compuesto que podría ligarse TGF-β y la señalización de Wnt (Figura 5F). Se ha informado de que el TGF-β y la señalización de Wnt co-regulan la determinación del destino de células madre mesenquimales en células mamarias, incluyendo la inducción de células madre de cáncer. Por lo tanto, la combinación de estas dos vías de señalización puede ser un mecanismo detrás de unas condiciones tales como enfermedades fibróticas [47] - [49].
Sabemos que la moléculas secretadas por las células de CRC durante las interacciones estroma tumoral señalización paracrina incluyen TGF -β, Wnt y algunos otros factores, y que estos pueden cambiar los fibroblastos vecinos. También sabemos que los fibroblastos en estroma tumoral son responsables de la síntesis de MMP y las fibras de colágeno. Las células tumorales ayuda MMP invaden la membrana basal, mientras que las fibras de colágeno proporcionan células tumorales con un sustrato físico conveniente sobre el que se transfieren [50]. Esta es la razón por fibroblastos en estroma tumoral han sido llamados "invasores y migradores distantes" [51].
Con todo, la interacción tumor-estroma es un proceso complejo. Durante este proceso, las células tumorales pueden secretar factores de alterar la diferenciación de los fibroblastos normales, y los fibroblastos modificados en retorno secretar factores que afectan a la progresión de la invasión tumoral y la migración. Hemos presentado datos que indican el mecanismo de cómo IGFBP7 pueden estar involucrados en esta interacción, y esta interacción, se fomente la participación de los fibroblastos del estroma del tumor, podría constituir el foco de un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento del cáncer.
La información que sustenta
figura S1.
HT29-S y S-Lovo inducen una alta expresión de IGFBP7 en los fibroblastos. análisis semi-cuantitativo del nivel de expresión de ARNm IGFBP7 determinado por RT-PCR en los fibroblastos expuestos a HT29-S (A) y Lovo-S (B) para 0, 2, 4 y 6 días. El nivel de ARNm se normalizó a la de GAPDH en los mismos extractos celulares. *
P Hotel & lt; 0,05 entre HT29-S /fibroblastos tratados con Lovo-S y el grupo control (0 días)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085340.s001 gratis (TIF)
figura S2.
β-catenina se activa durante la sobre regulación de IGFBP7 en los fibroblastos. A. Los fibroblastos fueron tratados con SW620-S o TGF-β para 6 días y la expresión de Wnt proteína de señalización de β-catenina se detectó en fibroblastos por Western blot. La expresión de proteínas se normalizó a la de la β-actina en el mismo extracto celular. *
P Hotel & lt; 0,05 entre el TGF-beta 1 tratados con fibroblastos y grupo de control. B. Los fibroblastos fueron tratados con SW620-S o TGF-β para 6 días y β-catenina (rojo) y DAPI (azul) fueron detectados en fibroblastos por microscopía de inmunofluorescencia (Aumento original × 1000)
doi:. 10.1371 /revista .pone.0085340.s002 gratis (TIF)
Tabla S1. Los cebadores
Q-PCR
doi: 10.1371. /Journal.pone.0085340.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias por el Dr. Brian Eyden (Manchester) para la edición de idioma Inglés, estimular la discusión y revisión del manuscrito. Agradecemos al profesor Mao-De Lai y los miembros del laboratorio en busca de ayuda y asesoramiento a través de este trabajo.