Extracto
Antecedentes
Las tirosina quinasas conducen a la proliferación y la supervivencia de muchos cánceres humanos. Por lo tanto perfilado el estado global de fosforilación de la tirosina de un tumor es probable que proporcione una gran cantidad de información que puede ser utilizado para clasificar los tumores para el pronóstico y la predicción. Sin embargo, el análisis exhaustivo de fosforilación de la tirosina de un gran número de especímenes de cáncer humano es técnicamente difícil con los métodos actuales.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizó un método de phosphoproteomic denomina SH2 de perfiles para caracterizar el mundial estado de la señalización fosfotirosina (pTyr) en líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Este método cuantifica los sitios de unión para los dominios SH2 fosforilados, que son utilizados por las células para responder a cambios en pTyr durante señalización. Las células se podrían agrupar en base a los patrones de unión de SH2, con algunos grupos correlacionados con el receptor de EGF (EGFR) o estado de la mutación K-RAS. La unión de los dominios SH2 específicos, lo más prominente vía RAS activadores Grb2 y SHCA, en correlación con la mutación de EGFR y la sensibilidad a la erlotinib inhibidor de EGFR. patrones de unión SH2 también reflejaron la activación MET y pudieron identificar células impulsados por múltiples quinasas. Las respuestas pTyr de las células tratadas con inhibidores de la quinasa proporcionan evidencia de mecanismos distintos de la inhibición.
Conclusiones /Importancia
Este estudio ilustra el potencial de dominios proteicos modulares y sus perfiles proteómicos de unión tan poderosa de diagnóstico molecular herramientas para la clasificación de los tumores y la identificación de biomarcadores
Visto: Machida. K, S Eschrich, Li J, Bai y, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) Caracterización de la tirosina fosforilación de señalización en cáncer de pulmón Usando SH2 de perfiles. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10.1371 /journal.pone.0013470
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2010; Aceptado: September 23, 2010; Publicado: 19 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Machida et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Centro Nacional de Genómica funcional (http://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), los Institutos nacionales de Salud (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (P50-CA119997, CA107785-R33, y RC1-CA146843) y la mama CT Health Initiative, Inc. (http://ctbhi.org/). Este trabajo ha sido financiado en parte por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (P30CA076292) al Núcleo de Biología Molecular y Bioinformática Plataformas en el Lee Moffitt Center & amp H. Cáncer; Instituto de Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptor y tirosina quinasas no receptoras regulan muchas actividades importantes para el cáncer, incluyendo la proliferación celular, la supervivencia, la invasión /metástasis y la angiogénesis [1]. Por tanto, estas proteínas de señalización representan una clase importante de dianas de medicamentos para el tratamiento de cáncer, y numerosos inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) se encuentran en desarrollo o están siendo utilizados en la clínica. El cáncer de pulmón representa más de 160.000 muertes por año en los EE.UU. [2], por lo que hay una razón poderosa para identificar los factores clave de cáncer de pulmón que pueden ser explotadas terapéuticamente. La actividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es frecuentemente elevada en el cáncer de pulmón, y la inhibición de EGFR a través de la erlotinib TKI puede prolongar la supervivencia en pacientes con avanzado refractario cáncer de pulmón a la quimioterapia [3]. Además de EGFR, un número de otras tirosina quinasas se han propuesto como dianas terapéuticas en el cáncer de pulmón, incluyendo MET, receptores de factores de crecimiento similares a la insulina (IGFR), SRC quinasas, receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), factor de crecimiento derivado de plaquetas receptores (PDGFR), cinasa del linfoma anaplásico (ALK), y EPH receptores [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .
Una cuestión clave en la terapia de TKI para el cáncer de pulmón es el que los pacientes se beneficiarán de estos fármacos, ya que el costo es sustancial y muchos no reciben ningún beneficio del tratamiento. Un avance importante fue el descubrimiento de la activación de mutaciones somáticas en EGFR que mejoran la señalización del receptor y predecir la sensibilidad a la orientación TKIs el EGFR, tales como erlotinib y gefitinib [13], [14], [15]. En pacientes con cáncer de pulmón que albergan estas mutaciones, las tasas de respuesta a EGFR TKIs pueden ser altos y la supervivencia es mejor que la observada con agentes citotóxicos [16]. Sin embargo algunos pacientes sin la mutación de EGFR se pueden beneficiar de los inhibidores de EGFR, y marcadores tales como la amplificación de EGFR gen, la producción autocrina TGF, o perfiles de expresión génica se han propuesto para identificar a estos pacientes [17], [18], [19]. Además, los mecanismos de resistencia como la amplificación MET o mutaciones secundarias en EGFR pueden llevar rápidamente a la resistencia a los medicamentos [20], [21], [22]. Por último, algunas células tumorales son susceptibles de ser impulsado por múltiples tirosina quinasas, y los métodos para identificar y clasificar éstas son necesarias [23].
estrategias proteómicas (que examinan los patrones globales de expresión de la proteína o fosforilación) también están siendo utilizado para clasificar los tumores [24]. Espectrometría de masas (MS) junto con anticuerpos anti-fosfotirosina identificados distintos patrones de señalización de la tirosina quinasa en células de cáncer de pulmón y tumores, y este método fue capaz de identificar las células impulsadas por EGFR oncogénico, PDGFR, y ALK [4]. Otros estudios utilizando el mismo enfoque encontraron patrones de fosforilación de la tirosina asociadas con la señalización del EGFR mutante [25], [26]. En general, este trabajo proporciona una prueba de principio de que los patrones globales de fosforilación de la tirosina pueden proporcionar información útil para la clasificación de tumores. Sin embargo, los métodos actuales MS requieren cantidades relativamente grandes de muestra y cuantificación de los sitios fosforilados es se necesitan desafiantes, por lo tanto nuevas estrategias phosphoproteomic.
Hemos desarrollado un método phosphoproteomic alternativa, denominada SH2 de perfiles, que complementa los enfoques basados en MS [27], [28]. SH2 de perfiles es muy sensible y el rendimiento es relativamente alta, por lo que es ideal para perfiles de fosfotirosina (pTyr) de señalización en células de cáncer. La base conceptual de SH2 de perfiles es utilizar propio mecanismo de respuesta de señal pTyr de la célula para interrogar el estado de la señalización pTyr. Tras la activación del receptor tirosina quinasa (RTK), el aumento resultante en la fosforilación de tirosina de proteínas genera sitios de unión para los dominios de unión modulares-pTyr específica; es la relocalización de los efectores intracelulares que contienen dominios de unión pTyr a estos sitios fosforilados que es el paso clave en la transmisión de señales [29]. Con mucho, el módulo de unión a pTyr más abundante en los seres humanos es la Src homología 2 o SH2 dominio [30]. Hay 120 dominios SH2 codificadas por el genoma humano, y cada dominio SH2 se une a un espectro único de tirosina fosforilada sitios [28], [31]. Debido a que los dominios SH2 son los que utiliza la célula para responder o "leer" los cambios en la fosforilación de la tirosina en la señalización, el grado de unión de los diferentes dominios SH2 puede proporcionar una gran cantidad de información acerca de los mecanismos y el estado de la señalización pTyr.
para probar si este enfoque es útil en la caracterización y clasificación de tipos de tumores complejos, tales como cáncer de pulmón, donde múltiples tirosina quinasas en coche de señalización corriente abajo y mantener el crecimiento del tumor, se aplicó perfiles SH2 a las líneas celulares de cáncer de pulmón. Nos encontramos con que los patrones pTyr podrían estar relacionados con las características conocidas de las células, incluyendo el estado de mutación de EGFR y la sensibilidad a EGFR TKI. Nuestros resultados sugieren que SH2 de perfiles proporciona nuevos conocimientos sobre la señalización pTyr que puedan ser útiles para la predicción y pronóstico del cáncer de pulmón.
Resultados
perfiles SH2 identifica subconjuntos de líneas celulares de cáncer de pulmón
Hemos seleccionado a un grupo de 22 no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células con EGFR conocido y estado de la mutación K-RAS y sensibilidad conocida a la EGFR TKI erlotinib (Suppl. Tabla S1). La estrategia general para nuestros estudios se muestra en la Fig. 1. Los lisados celulares se prepararon a partir de células en crecimiento activo cultivadas en medio suplementado con suero. Dos enfoques para generar perfiles se utilizaron SH2, matriz de proteínas de fase inversa y de largo Western Blot [28]. En el primer método, múltiples muestras de proteínas (lisados celulares) son vistos en las matrices en coincidencia con los pozos de un aparato de cámara de 96 pocillos. Cada pocillo se llena a continuación con una solución que contiene una sonda de dominio GST-SH2 diferente, y después de la incubación y el lavado, la sonda unida se cuantifica para cada mancha. La cantidad de unión depende del número y la afinidad de tirosina fosforilada sitios de proteína en la muestra. Con este enfoque, lo que llamamos el ensayo de "roseta", es posible perfilar el nivel total de unión para prácticamente todos los dominios SH2 en el genoma (94 sondas de dominio SH2 y un dominio PTB en representación de 90 proteínas diferentes) usando cantidades mínimas de proteínas muestra.
líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Suppl. Tabla S1) se cultivaron en presencia o ausencia de inhibidores de tirosina quinasa erlotinib o dasatinib. proteínas celulares se extrajeron y analizaron por roseta y transferencia de largo Western utilizando una matriz de sondas de dominio SH2 (Suppl. Tabla S3). Se utilizó el análisis bioinformático de los datos cuantificados para la detección y clasificación de biomarcadores.
Para investigar la relación de las diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón de células, los valores de unión de SH2 cuantitativos fueron sometidos a análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado (ver Métodos). Los resultados se muestran en formato de mapa de calor en la Fig. 2A y los datos de imágenes en bruto se muestra en Supl. Higo. S1. Se descartaron los datos con baja relación señal /fondo; los datos de las sondas 70 restantes eran centrado en la mediana para la agrupación; rojo indica más alta que la mediana de unión, verde inferior. Los datos procesados se pueden encontrar en Suppl. Tabla S2. Los datos también se puede acceder mediante un visor basado en la web (http://proteome.moffitt.org/sh2/). En este análisis, las líneas celulares que albergan clúster EGFR mutante juntos en tres sub-grupos distintos, mientras que dos grandes grupos (de cuatro y ocho líneas celulares) consisten enteramente en líneas de tipo salvaje (wt) EGFR. Estos resultados sugieren que los perfiles SH2 puede identificar subconjuntos de células de cáncer de pulmón, y que estas agrupaciones aparecerá relacionada con el estado de mutación del EGFR.
Los datos del rosetón (A) agrupados por el dominio SH2 y la línea celular. Cada fila representa un único dominio SH2 y cada columna representa una sola línea celular. Características biológicas (mutación de EGFR, la mutación K-RAS, sensibilidad a erlotinib) se muestran más arriba en blanco y negro. Para la sensibilidad a erlotinib, positivo /sensible: IC
50 & lt; 10 nM; intermedia /moderadamente sensibles: 10-1000 nM; negativo /minúsculas: & gt; 1000 nM. (B) los datos más occidentales agrupados por SH2 bin-dominio específico y la línea celular. Cada fila representa un solo bin MW (20 contenedores /carril) para un dominio SH2 particular y cada columna representa una sola línea celular.
El segundo enfoque utiliza perfiles SH2 transferencia del lejano oeste para obtener más detallada información sobre la abundancia relativa y el peso molecular aparente (MW) de fosfoproteínas que se unen diferentes sondas de dominio SH2. Las muestras de proteínas se separan en función de su tamaño por electroforesis en gel y transferidos a membranas, que luego se probaron con dominios SH2 etiquetados. proteínas de unión a SH2 se revelan como bandas, y el MW aparente de estas bandas pueden proporcionar pistas sobre su identidad. Hemos desarrollado herramientas de software que permiten el enlace de datos SH2 de manchas de gran occidentales para ser cuantificado en "contenedores" por la aparente MW, por ejemplo, 20 contenedores por carril. Los datos de cada bin (correspondiente a fosfoproteínas de un rango MW particular, que se unen a la sonda SH2), entonces se pueden utilizar como la base para la clasificación de las muestras. Así, en lugar de un valor único para cada muestra y dominio SH2, al igual que en el ensayo de roseta, cuantitativa transferencia de extrema occidental proporciona al menos 20 puntos de datos diferentes, lo que aumenta en gran medida la posible discriminación entre muestras.
Las transferencias más occidentales de cáncer de pulmón líneas celulares se probaron con 36 SH2 o PTB dominios, así como anticuerpo anti-pTyr. datos de imágenes en bruto se pueden encontrar en Supl. Película S1, y los datos cuantitativos en Supl. Tabla S2. Cuando los resultados cuantitativos fueron sometidos a la agrupación jerárquica, las muestras agrupadas en 3 clases distintas, además de dos valores extremos (Fig. 2B). Uno de ellos (grupo 3) se compone en su totalidad de las células con EGFR en peso y es altamente enriquecido para las células con la activación de mutaciones K-RAS. Por el contrario, los grupos 1 y 2 están enriquecidas en células con mutaciones de EGFR; dentro de cada uno de estos grupos, las células con EGFR en peso y mutante son segregados. Por lo tanto cuantitativa transferencia de extrema occidental parece proporcionar información adicional sobre el estado de señalización de la tirosina quinasa que se puede utilizar para clasificar funcionalmente las células sobre la base del estado de activación de RTK. En general, los resultados de la agrupación de los ensayos de roseta y de largo occidentales son similares pero no idénticos, como veremos a continuación.
La unión de un conjunto de dominios SH2 se ve reforzada en las células que albergan mutaciones activadoras del EGFR
a continuación pregunta si la unión de las sondas de dominio SH2 individuales fue altamente asociada con la activación de las mutaciones de EGFR. A partir de los experimentos de unión de roseta se identificaron 7 sondas cuya unión se correlaciona de forma estadísticamente significativa con el estado de la mutación EGFR:. Grb2, SHCA (PTB), Grap2, Brk, Txk, CblB y CblA (Fig. 3A) (se refiere a Supl Tabla S3 para los dominios SH2 y las proteínas correspondientes). Nos entrada de estos dominios en PPI araña, una herramienta para interpretar los datos de la proteómica en el contexto de las redes conocidas de interacción proteína-proteína. Este análisis mostró que cinco de estas proteínas (SHCA, Grb2, CBLA, CblB, y BRK) se han notificado a unirse directamente a EGFR, mientras que Grap2 está potencialmente vinculado a EGFR a través de SHCA (Fig. 3B). El hecho de que los sitios de Grb2 y SHCA (y la estrecha Grb2 Grap2 relativa) de unión están estrechamente asociada con la mutación de EGFR es particularmente intrigante, como una mayor unión de estos dominios SH2 sería fuertemente predicho para conducir a la activación de la vía de señalización RAS a través de la contratación de el RAS activador de Sos [32], [33]
dominios SH2
(A) cuya unión se correlaciona significativamente con la mutación de EGFR (q & lt; 0,1).. diagrama de barras de la señal de SH2 de líneas celulares de EGFR de tipo salvaje y mutante se muestran como media con barras de error estándar. "Dominio SH2" se utiliza en las cifras para todas las sondas, incluyendo dominios PTB y anticuerpo anti-pTyr. (B) Mapa de interacción proteína-proteína para EGFR (círculo gris) y las proteínas con dominios SH2 cuya unión se correlaciona significativamente con la mutación de EGFR (círculos blancos). Las líneas indican informaron interacciones de unión directa. (C) bandas de dominio específico Far-Western correlacionaron significativamente con la mutación de EGFR. casillas de color indican los resultados de significación estadística en una prueba de Mann-Whitney para las diferencias (Q & lt; 0,1) entre las 22 líneas celulares se muestran en la Figura 2B. La flecha indica el bin correspondiente a miembros de la familia EGFR. Los números adyacentes a los contenedores indican MW aparente, por ejemplo, "291.0" = MW entre 256-291 kDa.
Un análisis similar se realizó utilizando los datos de transferencia Western de largo. Se encontró que una serie de bandas específicas en transferencias de gran occidentales correlacionó significativamente con la mutación de EGFR (Fig. 3C). Aquí es interesante considerar bandas cuya unión tiende a aumentar en EGFR células mutantes (rojo) frente a aquellos cuya unión tiende a disminuir en EGFR células mutantes (verde). Observamos que para sondas predijo (sobre la base de la actividad de señalización conocida) para ser asociado con la estimulación de la vía de RAS (Grb2 y Shc), aumento de la unión en el intervalo de peso molecular que contiene miembros de la familia EGFR fosforilados (MW194, flecha) se ve para células mutantes de EGFR. Esto probablemente refleja una mayor unión de estos efectores a anormalmente activado EGFR, en comparación con el receptor en peso. Esto también es cierto para los dominios SH2 de otros efectores positivos conocidos de la señalización del EGFR, incluyendo Vav2, PI 3-quinasa (PI3K; P85B)., Y PLCγ plcg1)
A diferencia de la mutación de EGFR, encontramos ningún individuo dominios SH2 cuya unión fuertemente correlacionada con el estado de la mutación RAS por roseta o transferencia del lejano oeste. A pesar de esto, nos dimos cuenta de una aparente correlación interesante entre la agrupación en base a los perfiles globales SH2 y estado de la mutación K-RAS. Esto es particularmente claro en el caso de gran transferencia Western (Fig. 2B), en la que dos grupos principales consisten enteramente de células con en peso K-RAS, mientras que un tercer grupo principal (cluster 3) se compone casi en su totalidad de las células con EGFR en peso pero mutantes K-RAS. Nos quedamos sorprendidos inicialmente por la aparición de H1299 en el grupo#3, como K-RAS es en peso en estas células. Sin embargo, un examen más profundo de la secuencia de datos reveló que la relación N-RAS K-RAS está mutado en H1299 (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), pero no en cualquiera de la otra célula líneas utilizadas en este estudio. Por lo tanto una predicción basada en SH2 de perfiles, que las células H1299 son susceptibles de albergar RAS activadas, fue llevado a cabo, validando fuertemente la relevancia biológica de este enfoque. Este grupo de mutantes RAS (6 de 6 líneas de células que albergan mutaciones RAS) es altamente improbable que haya ocurrido por azar (p = 0,001, prueba de permutación, n = 100.000). Estos resultados indican que los patrones de fosforilación de la tirosina pueden las células basadas en el estado de mutación RAS sub-clasificar. La falta de correlación entre las sondas de dominio SH2 individuo y mutación RAS (a diferencia de correlación basado en el perfil global de fosforilación de la tirosina) puede reflejar el hecho de que las funciones de RAS aguas abajo de las tirosina quinasas. Actualmente estamos probando el modelo que la actividad constitutiva de Ras conduce a la activación de las vías de retroalimentación que en términos generales regulan negativamente la señalización de la tirosina quinasa.
un conjunto de sondas SH2 se correlaciona con la sensibilidad de las células de cáncer de pulmón a EGFR TKI
a continuación se determinó si el dominio SH2 unión correlacionada con la sensibilidad de líneas celulares de cáncer de pulmón a erlotinib, una pequeña molécula de inhibidor de la cinasa EGFR. Tales dominios podrían servir como base para biomarcadores predictivos para identificar tumores que probablemente respondan a la terapia de TKI. SH2 de perfiles de datos se examinaron para su posible correlación con la IC
50 para erlotinib para cada línea celular (IC
50 se ensayó para este estudio en las mismas condiciones de cultivo usadas para SH2 de perfiles). Se encontró que la unión de 13 sondas correspondientes a 12 proteínas correlacionados de una manera estadísticamente significativa con erlotinib IC
50 (Fig. 4A). Estos incluyen Grb2 (que se muestra en la Fig. 4B), SHCA, SHCA (PTB), p85B, CIS1, Arg, Eat2, plcg1, Ptk70 /MER, Fes, LNK Tem6, y Btk. El análisis de redes confirma los informes de interacción directa entre EGFR y Grb2, SHCA, p85B, CIS1, Arg, plcg1, Fes, y Btk (Fig. 4C). En general, los resultados son consistentes con un modelo en el que la sensibilidad a erlotinib se asocia con la señalización particularmente fuerte de EGFR activado para los efectores de núcleo conocidos, incluyendo las vías de MAPK (Grb2 y SHCA), PI3K /Akt (p85B), y PLCγ (plcg1).
señal de dominio SH2 en las células no tratadas se comparó con IC ln
50 para erlotinib. (a) dominios correlacionó significativamente con ln IC
50. correlaciones negativas indican una mayor unión a SH2 en las células más sensibles (IC menor
50) al erlotinib. (B) Diagrama de dispersión de Grb2 SH2 de unión frente al dominio ln (IC
50) para erlotinib. (C) Mapa de interacción proteína-proteína para EGFR y proteínas con dominios SH2 cuya unión se correlaciona significativamente con la sensibilidad a erlotinib. Las líneas indican informaron interacciones de unión directa. (D) Mapa de calor que representa la correlación de cada bin-dominio específico a la sensibilidad a erlotinib. correlación de Pearson se calculó para cada intervalo específico de dominio a través de 22 líneas celulares y el ln (IC
50) para la línea celular correspondiente. Cada ubicación de mapa de calor representa coeficiente de correlación para que bin; verde indica que el aumento de la señal SH2 con la disminución del CI
50 valores (mayor sensibilidad); El color rojo indica el aumento de la señal SH2 con el aumento de IC
50 valores (ver barra de color). La flecha indica bin MW que contiene proteínas de la familia EGFR. (E) Lista de los contenedores de 46 dominios específicos con | coeficiente de correlación | & Gt;.
0,5
Blot bandas más occidentales también identificados que se correlacionaron con la sensibilidad a erlotinib (Figura 4D & amp;. E). Para un gran número de dominios SH2, aparente más elevada de unión a miembros de la familia EGFR (flecha en MW194 en la Fig. 4D) se asoció con la sensibilidad erlotinib, mientras CSK (que regula a la baja las quinasas de la familia Src) fue la única que aparente menor vinculante de su SH2 dominio de EGFR se asoció con sensibilidad erlotinib. Estos resultados fueron muy similares a los observados para EGFR mutación (Fig. 3C), lo que sugiere que el aumento de la unión de activadores de RAS y la disminución de la unión de CSK de EGFR se asocian tanto con la mutación de EGFR y la sensibilidad erlotinib. Si bien, en principio, nuestro análisis podría ser confundida por la correlación conocida entre la mutación de EGFR y la sensibilidad a erlotinib, incluimos en nuestro análisis de varias líneas que son resistentes a erlotinib a pesar de tener mutaciones activadoras del EGFR (H1975, H820, H2279 y H1650), así como líneas con EGFR en peso que son sensibles a erlotinib (H292, H358, H1648, H322 y). Es particularmente interesante que CSK es el único dominio SH2 cuya unión a la región de la mancha que contiene EGFR disminuye tanto en las células mutantes de EGFR y en células sensibles a erlotinib. CSK regula negativamente quinasas de la familia Src, una clase clave de las quinasas de tirosina nonreceptor [34]. Aunque CSK SH2 unión es relativamente débil y las diferencias entre las líneas celulares son modestos, hemos confirmado la significación estadística de la correlación en varios experimentos independientes (Suppl. Fig. S2).
activación de Met es capturado por SH2 perfiles
Una ventaja potencial de SH2 perfiles sería identificar tumores en los que varias tirosina quinasas hyperactivated actúan de forma conjunta para impulsar la señalización aguas abajo, por lo que investigó si SH2 perfiles pudo identificar líneas celulares en las que se reunió y EGFR son co-activados . La quinasa MET se amplifica en las células H820 y H1648 [20], [35], que se agrupan en estrecha colaboración tanto por Rosette y extremo occidental de perfiles SH2 (Fig. 2). En las transferencias del lejano oeste, pero también señalamos fuerte unión de múltiples dominios SH2 incluyendo p85a a la región de ~148 kDa en H820 y H1648. Se observó una banda similar en ~148 kDa para un número de otras líneas celulares, incluyendo HCC827, H4006, H358 y H441 (Fig. 5A). Al sospechar esta banda fue un marcador para la activación MET, hemos probado esta sondeando inmunotransferencias con un anticuerpo que reconoce específicamente phosphospecific MET activado (Suppl. Fig. S3 A). Este análisis, junto con la inmunoprecipitación y el inhibidor de estudios, demostró que la fosforilación de la banda de 148 kDa era fuertemente dependiente de la activación MET (su presencia correlacionada con MET activado y fue inhibida por MET-específica TKI), pero la banda no era el propio receptor MET (Suppl. Fig. S3B, C). Al mismo tiempo, hemos examinado indirectamente la actividad de miembros de la familia de EGFR mediante la cuantificación de la fosforilación de tirosina de la región ~194 kDa de inmunotransferencias, donde se encuentran miembros de la familia EGFR (Suppl. Fig. S3A). La inmunoprecipitación e inhibidor estudios mostraron que la mayor parte de la señal de unión SH2 en esta región de los borrones podría atribuirse a miembros de la familia EGFR (Suppl. Fig. S3B, C).
(A) por transferencia Far-Western de pulmón líneas celulares de cáncer probaron con dominios SH2 p85A. Nota banda prominente de ~145 kDa en H820 (flecha). (B, C) La agrupación jerárquica de la familia relacionado con la activación de EGFR y MET. La agrupación jerárquica basada en los datos de roseta (B) o de datos de gran occidentales (C), como se muestra anteriormente en la Fig. 2. Los colores indican las líneas celulares que co-cluster por tanto roseta y análisis de gran occidental (grupos 1, 2, 2b, y 3). la activación de Met = inmunoreactividad con anticuerpos phosphospecific MET. pTyr MW 194 = inmunorreactividad con anti-pTyr en 194 bin kDa, que es una lectura de la activación de la familia EGFR (ver. Suppl. Fig S3). Puntos de corte para la activación de Met: positivo, & gt; 50% en el valor más alto inmunotransferencia con anti-MET pY1334 /1335; intermedio, 25-50%; negativo, & lt; 25%. Corte para pTyr MW194: positivo, & gt; 25% en el valor más alto inmunotransferencia con anti-pTyr; intermedio, 10-25%; negativo,. & lt; 10%
A continuación, relacionamos MET y estado de activación del EGFR con SH2 de perfiles de resultados. Sorprendentemente, sin agrupación de los datos tanto del lejano oeste roseta y reveló que la mayoría de las líneas celulares con fuerte grupo de activación MET en un grupo distinto, apretado (Figura 5B & amp;. C). Tanto por la roseta y de perfiles basados-occidental el momento, la mayoría de las líneas celulares con una fuerte activación MET forman un solo grupo (grupo 1) que está claramente separada de las otras líneas celulares. Todas estas líneas celulares también tienen una fuerte fosforilación de la tirosina de las proteínas co-migrar con EGFR, lo que sugiere co-activación de MET y la señalización de EGFR en este grupo. La información sobre la activación del EGFR y MET también nos permitió comparar de manera más amplia agrupación de resultados basados en los datos de roseta y de largo occidentales. Esta comparación reveló que cuatro grupos distintos eran comunes a ambos métodos (Fig. 5B, C), que abarca 15 fuera de las líneas celulares 22 (7 líneas se agrupan de manera diferente cuando se comparan los dos métodos). El grupo 1 se compone de líneas celulares con una fuerte activación de los receptores EGFR y la señalización de MET. Cluster 3 consta de líneas celulares con RAS mutante y baja EGFR y la actividad MET, todos los cuales son resistentes erlotinib. El Grupo 2 se puede dividir en dos subgrupos basados en el estado de mutación del EGFR. Desde una perspectiva clínica de estos dos grupos son los más interesantes: uno consiste de líneas con EGFR mutantes que son resistentes a erlotinib (grupo 2B), y el otro incluye varias líneas con EGFR peso que son sensibles a erlotinib
A continuación vamos. probado si la unión de las sondas de dominio SH2 estaba asociada con la activación de MET. Por análisis de roseta, se encontró que la unión de 46 dominios SH2 se asoció significativamente con la fosforilación MET (Fig. 6A). Del mismo modo, el análisis de gran Western mostró un gran número de bandas asociadas con el estado de fosforilación de MET (Fig. 6B). El número de dominios SH2 y los marcadores que se correlacionan con la activación de Met es mayor que las asociadas con la mutación de EGFR, lo que sugiere la actividad de MET tiene un efecto más profundo en los patrones de pTyr generales que EGFR mutación.
(A) dominios SH2 correlacionados con fosforilación de Met (p & lt; 0,01, q & lt; 0,1). diagrama de barras de la señal SH2 para alta y baja fosforilación MET. La media y se muestran los errores estándar. Para este análisis "Bajo" incluye ambas categorías intermedia y baja /negativa (Fig. 5). (B) las bandas más occidentales de dominio específico se correlacionaba con la fosforilación de Met. casillas de color indican la significación estadística en la prueba de Mann-Whitney para las diferencias (q & lt; 0,1). Se expusieron las células H1648 (C) para controlar (DMSO), 1,000 nM erlotinib (E), 1.000 nM PHA665752 (P), o una combinación de (E + P) durante 3 h y se analizaron por inmunotransferencia. Los lisados de células H820 tratadas sirvieron como control para p-MET. Anti-β-actina se utilizó para confirmar la igualdad de carga. (D) La viabilidad celular H1648 de las células expuestas a 60 nM erlotinib (E), 300 nM PHA665752 (P), o una combinación de (E + P).
El hecho de que la línea celular H1648 muy próximas con la línea celular H820, que previamente se ha encontrado que tienen una mutación de EGFR activación junto con el trato de economía de amplificación [20], sugieren que las células H1648 pueden ser similares a H820 en que la señalización aguas abajo es impulsada por los receptores EGFR y MET. Para probar esto, se exponen las células H1648 a los inhibidores de EGFR (erlotinib), MET (PHA665752) [36], o la combinación y examinamos Akt aguas abajo y la activación de ERK (Fig. 6C). Hemos observado reducciones modestas en fosforilados Akt y ERK en respuesta a cualquiera inhibidor solo, pero fuerte inhibición sobre dual EGFR y la inhibición MET. Los efectos sobre la viabilidad celular reflejan las respuestas de señalización, como la combinación de los dos agentes se tradujo en una mayor inhibición del crecimiento celular (Fig. 6D). Por lo tanto los patrones globales pTyr, ensayada por SH2 perfilado, predicen la activación de Met y pueden predecir la respuesta al MET TKI en estas líneas celulares.
La perturbación de los perfiles globales pTyr por ITC
A continuación utiliza perfiles de dominio SH2 para investigar cambios en la fosforilación de la tirosina mundial en las células expuestas a TKIs. Nuestra expectativa era que los cambios en los patrones de unión de SH2 podrían estar correlacionadas con las respuestas biológicas a los inhibidores, y que las sondas para la que la unión disminuyó fuertemente en células inhibidas-TKI era probable para representar vías clave para la acción TKI. líneas celulares de cáncer de cuatro pulmón (H292, H441, H358 y HCC827) se expusieron brevemente a erlotinib, un inhibidor de EGFR, o dasatinib, un inhibidor de la quinasa de la familia SRC que inhibe la tirosina múltiple y serina /treonina quinasas [37], [38], [39]. Estas líneas celulares difieren mucho en sus respuestas a estos TKI. En HCC827 células con la activación de la mutación de EGFR, ambos inhibidores inducen apoptosis; en H358 y H292 con EGFR en peso, ambos agentes inducen la detención del ciclo celular; y H441 células con EGFR en peso son resistentes a ambos agentes ([9] y datos no mostrados). Roseta y perfiles SH2 extremo occidental se realizó para las cuatro líneas celulares, tanto en los grupos tratados y no tratados.
Los datos de unión Rosette (log
2 veces los cambios en los grupos de tratamiento versus no tratados) se visualizaron en parcelas cascada clasificación de los cambios en SH2 de unión (Fig. 7A, Suppl. Fig. S4A). En HCC827, erlotinib causó el colapso completo de la señalización pTyr, ya que la unión se observan grandes disminuciones en SH2 para casi todas las sondas. Las reducciones más significativas en la unión se produjeron para la Grb2, Grap2, Vav2, y los dominios SH2 Vav1. En términos generales se observaron cambios similares en el tratamiento dasatinib, lo que sugiere una superposición de mecanismo, sin embargo, se pliegan los cambios fueron menos para la mayoría de las sondas, de acuerdo con sus menos potentes efectos sobre la fosforilación de EGFR [9]. Al igual que en HCC827, la unión de casi todas las sondas de dominio SH2 se redujo notablemente en células H358 tratadas con ITC, y había incluso una mayor similitud entre las respuestas al erlotinib y dasatinib. En H441, que es resistente a TKI, erlotinib y dasatinib evocan patrones generales similares de cambio como H358. Sin embargo, la disminución en la unión de SH2 fue mitigado en H441 en comparación con H358 y HCC827, y la unión de un mayor número de dominios SH2 aumento en la presencia de ambos inhibidores en comparación con las células no tratadas. Por último, H292 mostró los mínimos cambios dramáticos en el dominio SH2 de unión, y el patrón general de respuesta al tratamiento con ITC en esta línea celular fue muy diferente de los otros tres. Además, los perfiles de erlotinib y dasatinib eran más diferentes en comparación con las otras líneas celulares ensayadas. Las mismas muestras también se analizaron por transferencia de Western usando lejano un conjunto limitado de sondas SH2 (Suppl. Fig. S4B). Higo.