Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) pueden invadir y metastatizar por epitelio-mesenquimal transición (EMT). Sin embargo, la forma en que escapan a la vigilancia inmune está claro. B7H1 es co-estimuladora molécula negativo crucial, pero poca información acerca de si funciona en células madre cancerosas. Por lo tanto, se determinó la expresión de marcadores asociados EMT-B7H1 y en las células madre de cáncer colorrectal similar para investigar una posible forma immunoevasion de células madre cancerosas. Enriquecimos CD133
+ células de cáncer colorrectal que se manifestaron las propiedades de los CAC-como por ejemplo, los niveles más altos de otros marcadores de células madre Oct-4 y Sox-2, capacidad de formación de ámbito tumor y más tumorigénicas en ratones NOD /SCID. Estos CD133
+ células poseen perfil de expresión génica EMT incluyendo un mayor nivel de caracol, Twist, vimentina, fibronectina y el nivel inferior de la E-cadherina. Por otra parte, CD133
+ células, tanto en líneas celulares y de tejidos de cáncer colorrectal expresadas alto nivel de co-negativo estimular B7H1 molécula. Por otra parte, algunas células B7H1
+ cancerosas también mostró la característica de la EMT, que indica las células EMT podría escapar ataque inmune durante la metástasis. B7H1 expresión y fenotipos de la EMT en células madre cancerosas indica un posible camino immunoevasion
Visto:. Zhi Y, Z Mou, Chen J, Y Él, Dong H, X Fu, et al. (2015) Expresión B7H1 y la transición epitelio-mesenquimal transición fenotipos de cáncer colorrectal células madre similares. PLoS ONE 10 (8): e0135528. doi: 10.1371 /journal.pone.0135528
Editor: Giuseppe Pirozzi, Istituto Nazionale Tumori, ITALIA
Recibido: 8 de Marzo, 2015; Aceptado: July 22, 2015; Publicado: 18 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (a ZM, Nº 30872466), Programa Nacional sobre el Proyecto llave en Investigación básica (973 programas) de China (a ZM, No. 2010CB529404). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda en las mujeres [1], pero los avances de la terapia contra el cáncer se han hecho de forma limitada en los últimos 50 años. El fracaso de la terapia anti-cáncer se atribuye a una subpoblación de células de cáncer de llamadas células madre cancerosas (CSC), que son las células iniciadoras del cáncer putativo con las características de las células madre normales, tales como la auto-renovación, multipotencia y proliferación ilimitada potencial [ ,,,0],2]. Por otra parte, se cree que las CSC ser crucial para resistencia a las drogas [3]. Por lo tanto, se cree que los CAC son las "semillas" de la formación del cáncer y difícil de ser eliminados. Células madre cancerosas colorrectales también se han aislado y caracterizado basado en marcadores CSC como CD133 [4-9].
Los CCC desempeñan un papel crucial en la invasión del cáncer y la metástasis. Para entender cómo metástasis células de cáncer, el papel de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) ha sido ampliamente estudiado en la última década. EMT confiere características invasivas y metastásicas, resistencia a las terapias y los CAC fenotipos de células cancerosas en modelos experimentales [10-15]. Las células de cáncer sometidos a EMT regulan negativamente las proteínas asociadas con la adhesión celular, tales como E-cadherina, y regular al alza las proteínas expresadas en las células mesenquimales, como la vimentina, N-cadherina y fibronectina [13], y los factores de transcripción incluyendo
Caracol
,
torcedura
, y
Slug
así [16]. EMT también facilita la supervivencia de células de cáncer después del tratamiento con fármacos contra el cáncer, que se dirigen a receptores en las células epiteliales [12, 17]. Además, la inducción de la EMT en las células de cáncer con fármacos o la sobreexpresión de factores de transcripción EMT resultados en la adquisición de propiedades mesenquimales y en la expresión de marcadores de células madre [18-20]. Por otro lado, las células cancerosas tras el tratamiento con fármacos contra el cáncer, que han sido mostrados para enriquecer células madre cancerosas, manifestar los fenotipos y la expresión de genes como EMT [21]. Estos resultados indican la estrecha asociación entre los CAC y la adquisición de la EMT. Sin embargo, una mayoría de los patólogos son todavía refractario a la teoría EMT porque prueba definitiva de EMT ocurre en tumores humanos se carece hasta ahora.
CSC poseen características biológicas intrínsecas para formar tumor y pueden invadir los tejidos a través de EMT. Pero no está claro que la forma en que eluden la vigilancia inmunológica para la supervivencia final en huéspedes inmunocompetentes. Immunoevasion puede ayudar a los CAC para sobrevivir y luego formar tumores [3]. Los informes anteriores han sugerido conexiones inherentes entre la inmunosupresión y EMT, como que las células T reguladoras EMT inducida Caracol inducida y deteriorados células dendríticas [22]. En su conjunto, la hipótesis immunoevasion es importante para los CAC que se someten a la EMT a través de región inflamación paraneoplásica sin aclaramiento inmunitario y luego implementar la invasión y la metástasis. Sin embargo, los datos son todavía escasos los mecanismos de immunoevasion en células madre cancerosas [3].
B7H1, un ligando de muerte celular programada 1 (PD-1), ha sido conocida como una molécula esencial co-estimuladoras y desempeña un papel importante en la inducción y mantenimiento de la tolerancia periférica [23]. B7H1 es upregulated en tipos considerables de las células del cáncer que ofrece señales negativas y conduce a la inmunosupresión a través de la interacción de PD-1-B7H1 entre las células cancerosas y las células T [24, 25], lo que resulta en las células T disfunción infiltrantes de tumor y Treg reclutamiento [26] . Estas características hacen que B7H1 se convierta en un objetivo prometedor para controlar el cáncer. Sin embargo, la expresión B7H1 de los CAC no se conoce bien en el cáncer colorrectal. De este modo, se detectó la expresión B7H1 en el cáncer colorrectal en este estudio y mostramos B7H1 de expresión y de EMT fenotipos de células madre, como el cáncer colorrectal, lo que podría haber mecanismos para los CAC a escapan de la vigilancia inmune e invaden los tejidos distantes.
Materiales y métodos
declaración de Ética
los tejidos de cáncer colorrectal humano se obtuvieron de la Southwest hospital bajo protocolos éticos aprobados por el Comité de Ética de la Tercera Universidad médica Militar, Chongqing, china. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Tercera Universidad Médica Militar. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
cáncer de los tejidos y la línea celular
Los tumores colorrectales humanos fueron evaluados y clasificados histopatológicamente por el tumor- -nodo de metástasis en el sistema (TNM) (Tabla 1). La células de la línea celular de colon HT29 (número de catálogo: TCHU 103, comprado el 29 de mayo de 2010 de la célula Banco de la Academia de Ciencias de China, Shanghai, China) se cultivaron en McCoy 5A (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.).
clasificación celular magnética
HT29 células fueron cosechadas en fase de crecimiento exponencial con 0,25% de tripsina ( contenían EDTA) a continuación, ordenados por CD133 kit de aislamiento de la célula (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células muertas se eliminaron por Dead kit de eliminación de la célula (Miltenyi Biotec) antes de la clasificación. El CD133
+ y CD133
- fracciones se recogieron por separado y se tiñeron con /2 (293C3) anticuerpo CD133 humano conjugado con PE (Miltenyi Biotec). ratón conjugado con PE IgG2b (Miltenyi Biotec) se utilizó como anticuerpo de control de isotipo. La pureza celular se evaluó mediante citometría de flujo (BD FACSCanto Ⅱ, San Jose, CA, EE.UU.).
tumorigenos ensayos en ratones
LtSz-scid /scid (SCID NOD /) los ratones NOD /(adquirida de Pekín Laboratorio Centro de Investigación Animal, china) fueron criados y mantenidos en individual Sistema de introducción en jaulas ventiladas en las condiciones aprobadas por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional de la Tercera Universidad médica Militar. CD133
+ y CD133
- células fueron clasificados y contados antes de la inoculación. Las células cancerosas se suspendieron en una mezcla 1: 1 de medios de comunicación y matrigel (BD Biosciences, Bedford, Reino Unido) y se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de 4 ratones (alrededor de 8 a 10 semanas de edad). Cada flanco se inyectó 1 × 10
4 células. El crecimiento de los tumores se controló semanalmente y se midió el volumen por la longitud x anchura x anchura /2. Todos los ratones se sacrificaron después de 7 semanas del trasplante. Los xenoinjertos se retiraron, se fijaron con formalina al 10%, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE)
Esfera formación de ensayo
El CD133 ordenados
+ y CD133
. - Las células fueron cultivadas en medio libre de suero (-a NS medio basal, STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá) más el 10% NS-a suplementos de proliferación (humano) (STEMCELL Technologies), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20 ng /ml) (StemCell Technologies), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (10 ng /ml) (StemCell Technologies) y heparina (2 mg /ml) (Invitrogen). El medio de cultivo se reemplazó cada 3 días. Las imágenes de las esferas fueron capturados después de 20 días por el microscopio y los números contados bajo un aumento de 100x en los campos visuales aleatorios. Algunas esferas se tiñeron con /2 (293C3) CD133 anticuerpo conjugado con PE (Milteny Biotect). Algunas esferas tumorales fueron disociadas por la colagenasa Tipo Ⅳ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) y luego se cultivaron en un medio libre de suero como se menciona anteriormente, para determinar si las esferas podrían formar de nuevo.
La extracción de RNA, cDNA síntesis, y Q-PCR
CD133
+ y CD133
- se recogieron, respectivamente, las células HT29 y ha añadido Tripure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.) para extraer el ARN. 500 ng de ARN para cada muestra se transcribió inversamente en una mezcla de reacción de 20 l (TOYOBO Bio-Tecnología, Shanghai, China). El nivel de expresión de cada gen se determinó mediante PCR en tiempo real cuantitativa (Q-PCR). Nivel de producto se determinó mediante SYBR Green (Takara Biotecnología, Dalian, China). Q-PCR se realizó por el sistema de Mx3000P qPCR (Agilent Technologies) con el siguiente programa: desnaturalización inicial durante 2 minutos a 95 ° C seguido de 45 ciclos de PCR (95 ° C durante 10 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos). se añadió después de que un ciclo diseñado por el software Mx3000P (95 ° C durante 60 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 95ºC durante 30 segundos) para el análisis de la curva de fusión. Primer secuencias se enumeran en la Tabla 2. El gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control de limpieza de genes.
inmunofluorescencia tinción
Las secciones congeladas de tejidos de cáncer se tiñeron de acuerdo con la línea protocolo (http://www.ihcworld.com/_protocols/general_IHC/immunofl.htm). Se utilizaron anticuerpos contra CD133, B7H1, E-cadherina humana y vimentina para determinar la expresión de marcadores de EMT en células positivas CD133 positivas o B7H1. Del mismo modo, se utilizaron anticuerpos contra CD133 humano, B7H1 y EpCAM para detectar CD133 y B7H1 expresión en tejidos de cáncer. Los detalles de la selección anticuerpos se enumeran en la Tabla 3. Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Beyotime Instituto de Biotecnología, Shanghai, China. se utilizó diamidino-fenil-indol (DAPI) (Beyotime Biotechnology) para teñir núcleo. Los controles incluyeron: 1) En blanco: se utiliza tampón de dilución de anticuerpo (5% de albúmina de suero bovino en solución salina-tampón de fosfato, pH 7.2) solamente; 2) Control negativo: utilizar el tampón de dilución de anticuerpos más anticuerpos secundarios; 3) El control de isotipo de anticuerpos: IgG utilizado a partir de especies de anticuerpos diluidos por tampón de dilución de anticuerpos más anticuerpos secundarios. Los controles se utilizan para evitar la fluorescencia inespecífica.
Células
HT29 protocolo de tinción fue similar al cáncer de los tejidos, pero antes de que las células fueron sembradas en poli-L-lisina (Sigma-Aldrich) se desliza-cubierta con capa preliminar, culta en medio 5A de McCoy durante 24 horas y después se fijaron con solución de fijación y permeabilización (BD Biosciences).
Después de la tinción, los portaobjetos se mantienen en cámaras húmedos lejos de la luz a 4 ° C hasta que la captura de imágenes.
imágenes de captura y análisis de la expresión
Todas las imágenes fueron capturadas por confocal de barrido láser confocal microscopio de fluorescencia (Leica TCS-SP5, Alemania). Los controles se utilizan para ajustar la condición de captura adecuado para evitar la interferencia de la fluorescencia no específica. El mismo marcador en diferentes diapositivas se detectó en las mismas condiciones. tasas de expresión se midieron mediante el recuento de células positivas correspondientes en las imágenes de la captura. Cada diapositiva se midió más de 5 campos y contó al menos 1000 células.
El análisis estadístico
Las diferencias de volúmenes de xenoinjertos, números de la esfera y el nivel de expresión del ARNm entre CD133
+ y CD133
- células fueron analizadas por el estudiante de
t-test
. Un
p-valor
& lt; 0,05 se consideró una diferencia significativa. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (versión 13.0).
Resultados
CD133
+ células poseen la capacidad potencial de formación de tumor y la esfera más tumorigénico
A medida que los debates de CSC todavía existen marcadores [27, 28], se verificaron las características madre, como el cáncer de CD133 ordenada
+ células en primer lugar. CD133
+ y CD133
- se recogieron las células HT29 para determinar la tumorigenicidad de células. El porcentaje de CD133
+ células fue de aproximadamente 90% (figura 1A). Decenas de miles de CD133
+ y CD133
- se inyectaron por vía subcutánea en los diferentes costados de ratones NOD /SCID. A partir de 5 semanas después de la inyección, los tumores derivados de CD133
+ células comenzaron a ser significativamente mayor que los derivados de CD133
- células (Fig 1B y 1C). El CD133 xenoinjertos
+ de células mostró histología maligna como el cáncer de colon (Figura 1D), lo que sugiere que CD133
+ células son más tumorigénico. Además, la formación esfera es uno de los rasgos de células madre cancerosas [4], se determinó la formación de esfera de CD133
+ células y se encontró que CD133
+ células formaron significativamente más esferas tumorales que CD133
- células en suero medio de cultivo libre
in vitro gratis (figura 1E). Por otra parte, casi todas las células CD133
+ células tumorales derivadas esferas expresaron alto nivel de CD133 (figura 1F). Además, después de la disociación celular con colagenasa, las células podrían formar esferas tumorales de nuevo en medio libre de suero (Fig 1G), lo que indica la capacidad de auto-renovación de CD133
+ células. En general, estos resultados indican que CD133
+ células poseían propiedades CSC-como.
HT29 células fueron purificados con perlas magnéticas CD133. La pureza de CD133
+ células se determinó por citometría de flujo (A). 1 × 10
4 CD133
+ y CD133
- células fueron inyectadas por vía subcutánea en los diferentes costados de ratones NOD /SCID. Curva de crecimiento de tumores de xenoinjertos en ratones NOD /SCID muestra diferente capacidad de la tumorigénesis en dos subpoblaciones (B). La cinética de tamaño del tumor se monitorizó una vez a la semana (n = 4, media ± SD, **,
p & lt; 0,01
) .A representante de ratones se muestra a las 7 semanas después de la inoculación (C). Las secciones de xenoinjertos (D) de CD133
+ células (izquierda, 200 × magnificación) y CD133
- células (derecha, 200 aumentos) se analizaron con hematoxilina y eosina (barra = 100 micras). CD133
+ células muestran mucho más potente de la formación de esferas de CD133
- onas (E). Las demostraciones de histograma número de esferas derivadas de diferentes subpoblaciones (**,
p & lt; 0,01
). esferas tumorales expresan CD133 (F, arriba: luz neutra; parte inferior: Fluorescencia, rojo; bar = 100 micras). Después de la disociación, las células formaron esferas de nuevo (G, parte inferior) en medio de cultivo libre de suero como sus mayores generación (G, arriba) (barra = 100 micras).
CD133
+ células HT29 expresar tanto frenar las moléculas de células asociada y asociados con las EMT
los CCC son las células iniciadoras del cáncer putativo con las características de las células madre normales que expresan marcadores de pluripotencia, como Sox-2 y octubre-4 [29-31] . Para determinar si las células CD133
+ HT29 también expresan los factores asociados a las células madre, el nivel transcripcional de Oct-4 y Sox-2 expresión se midió. Como era de esperar, dos marcadores de células madre Oct-4 y Sox-2 se expresaron significativamente mayor en CD133
+ subpoblación (
p Hotel & lt; 0,05) que CD133
- células (Figura 2A), que es consistente con oct-4 y Sox-2 sobreexpresión en tumores poco diferenciados [32].
niveles relativos de expresión de mRNA de marcadores de células madre oct-4 y Sox-2 (a), EMT asociado factores de transcripción y la torcedura caracol (B), y EMT Marcadores de e-cadherina, fibronectina y vimentina (C) se determinaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa y se normalizó a la expresión de GAPDH. *,
p & lt; 0,05
; **,
p. & Lt; 0,01
estudio anterior mostró que la EMT participa en la conversión de los tumores en fase inicial en tumores malignos invasivos [33]. Curiosamente, las evidencias de acumulación indican que la inducción de EMT fenotipos por diferentes factores también induce CSC-como las células [15]. Sin embargo, no está claro si los fenotipos de células madre cancerosas pantalla EMT. Para abordar esta cuestión, se detectó expresión de moléculas asociadas-EMT en células HT29, incluyendo factores de transcripción Snail y Twist, proteína epitelial E-cadherina, marcadores mesenquimales vimentina y fibronectina. CD133
+ células expresan niveles significativamente más altos de caracol, Twist, vimentina y fibronectina de CD133
- células (
p & lt; 0,05
) (Figura 2B y 2C). Por el contrario, la expresión de E-cadherina en CD133
+ células fue significativamente más baja (
p Restaurant & lt; 0,05) (Fig. 2C), lo que indica CD133
+ células se manifiestan características asociadas-EMT
CD133
+ células en los tejidos de los pacientes muestran fenotipos EMT
a pesar de la EMT fue ampliamente estudiado
in vitro
, la cuestión clave sobre la EMT fue que la evidencia directa de este fenómeno sucediendo en humanos tejidos de cáncer era deficiente. Para abordar esta cuestión, la expresión de CD133 y moléculas EMT-fenotípicas se analizó en tejidos de cáncer colorrectal humano. CD133 se expresa de forma dispersa al lado del nido adenocarcinoma (Fig 3), pero no en el tejido paraneoplásico (S1 Fig). Curiosamente, se encontró que algunos CD133 vimentina
+ células expresado (Fig 3B), pero no de E-cadherina en 13/20 detectó tejidos de cáncer colorrectal humano (Fig 3A). Mediante la tinción de estas tres moléculas en la misma sección, se confirmó una porción de CD133
+ células en diferentes muestras (20% -40% en total CD133
+ células) mostraron este fenotipo (Figura 3C). Se indicó que la evidencia directa de que algunos CD133
+ células madre, como el cáncer tenían fenotipos EMT en los tejidos de cáncer humano.
La expresión de CD133 (rojo), E-cadherina (verde) (A) o CD133 (rojo) y vimentina (verde) (B) o CD133 (rojo), e-cadherina (verde) y vimentina (azul) (C) se determinaron mediante tinción de inmunofluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI (A, B: azul; C: gris). Se muestra un representante de cáncer de colon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Barra = 20 micras) guía empresas
Co-expresión de CD133 B7H1 y en la línea celular HT29 y tejidos de cáncer colorrectal
Para investigar el mecanismo de cómo células madre cancerosas escapan a la vigilancia inmunológica, se determinó la expresión de B7H1 en la línea celular HT29 y tejidos de cáncer colorrectal. Hemos encontrado que la co-expresión de B7H1 y CD133 era ubicua en células HT29 (Fig 4A). A fin de determinar la expresión de B7H1 en tejidos del paciente, se recogieron tejidos de cáncer colorrectal. EpCAM, un marcador epitelial luminal, se utiliza para distinguir los nidos de cáncer y región del estroma [34]. Se encontró que B7H1 se expresa principalmente en las células cancerosas en más de la mitad (11/20) de los tejidos de cáncer colorrectal (Tabla 4). Más interesante, aproximadamente el 50% de las células cancerosas que expresan CD133 expresado B7H1 (Fig 4B y 4C, Tabla 4). Por otra parte, B7H1 y CD133 fueron siempre co-expresan en EpCAM
+ células (Figura 4B y 4C). Indica CD133
+ células madre cancerosas pueden escapar de la vigilancia inmunológica mediante la expresión de la molécula inhibidora B7H1.
La expresión de CD133 (rojo) y B7H1 (verde) en las células HT29 (A) (Bar = 20 micras), y expresión de EpCAM (azul), CD133 (rojo) y B7H1 (verde) en los tejidos de cáncer colorrectal (B) (Bar = 50 mM) se determinó por tinción de inmunofluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI (gris). El área de rectángulo en la imagen se amplía (C) y muestra una típica co-expresión de CD133 y B7H1 (indicado con flechas). Se muestra un representante rectal adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0.
B7H1 células que expresan muestran fenotipos EMT en los tejidos colorrectales
Hemos encontrado que B7H1 se expresó en CD133
+ células y podría desempeñar un papel en immunoevasion de las células madre, como el cáncer. Sería interesante saber si la expresión B7H1 se relaciona con la EMT. Para hacer frente a esto directamente, B7H1 expresión fenotípica en las células EMT se determinó en 11 muestras de cáncer colorrectal humano en el que CD133 fue co-expresada con B7H1. Al igual que en estudios anteriores [35], B7H1 se expresa en las células cancerosas, especialmente en el borde de cáncer (Figura 5). En estos casos, especialmente donde parecía incipiente tumor, se encontró que el 20% -40% de las células cancerosas B7H1expressing-regulado por la E-cadherina (Figura 5A). Por otra parte, el 10% -25% de B7H1
+ células cancerosas expresan vimentina, un marcador mesenquimal (figura 5B), que indican existe fenotipo EMT en cierta B7H1
+ células. Tomados en conjunto, se sugiere que la sobreexpresión de B7H1 podría ser uno de los mecanismos immunoevasive no sólo para CD133
+ células madre cancerosas, sino también para las células cancerosas EMT fenotípicas transitorios.
La expresión de B7H1 (verde) y E- cadherina (rojo) (A) o B7H1 (verde) y vimentina (rojo) (B) se determinaron mediante la tinción de inmunofluorescencia. Una de las células que expresan B7H1 se indica con una flecha. Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Se muestra un representante de cáncer de colon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Barra = 20 micras) guía empresas
Discusión
Los CCC son considerados como las "semillas" de los cánceres y pueden ser enriquecidas por células de clasificación basado en algunos marcadores de superficie específicos. Aunque los marcadores de células madre cancerosas son todavía discutible, las células cancerosas que expresan ciertas moléculas específicas muestran CSC-como las propiedades de [9]. CD133 es uno de los marcadores de células madre hematopoyéticas y considerado como un marcador de células madre cancerosas en el cáncer colorrectal [5-7, 27, 28, 36]. En este estudio, CD133
+ células tenían CSC-como características, mostrando la capacidad de la esfera de conformación y la tumorigenicidad, que expresan mayores niveles de marcadores de células madre oct-4 y Sox-2 que se sobreexpresa tumores mal diferenciados [29, 31] . Por otra parte, estas células manifiestan EMT perfil de expresión génica, que había sido considerado como una peculiaridad importante ligarse a CSC [15].
Nuestros resultados de los rasgos CSC-como de CD133
+ células fueron consistentes con estudios anteriores [5-7]. Por el contrario, hay algunos otros resultados mostraron que las células negativas CD133 poseían propiedades CSC-como lugar [27, 28]. Por ejemplo, una línea celular negativa CD133 (nank) se estableció a partir xenoinjertos que derivan a partir de muestras quirúrgicas recientes de humano primario de colon y sus ovario tejidos de cáncer metastásico trasplantadas en ratones NOD /SCID [28]. nank células poseían características de los CAC-al igual que como la formación de la esfera y la tumorigenicidad en ratones NOD /SCID. En comparación con nuestro estudio, se puede encontrar que el origen de las células cancerosas eran bastante diferentes, lo que podría interferir la consistencia de los resultados. Además, las células nank diferían de su cáncer original, así, como la que CD133 y CD44 se expresaron en cáncer original, sino más bien débilmente en nank. Por lo tanto, parece que esta diferencia implica el complejo de cáncer en lugar de los errores de los métodos de investigación. Aunque no es lo suficientemente riguroso para usar solos CD133 para identificar células madre cancerosas, se confirmó que las CSC fueron enriquecidos en CD133
+ subpoblación y lo hizo mostrar características similares a células madre cancerosas. Es interesante y valioso para explorar los rasgos de esta subpoblación.
CD133
+ células de cáncer colorrectal en ambos tejidos de líneas celulares de cáncer y manifiesta las características hizo especiales y más fácil de invadir y metastatizar. En este estudio, se encontró que las células CD133
+ HT29 mostraron fenotipos EMT y co-expresada B7H1, lo que indica células madre cancerosas pueden expresar B7H1 para evadir la vigilancia inmune cuando invaden a través de la EMT. De manera similar a las células HT29, nivel de expresión CD133 en tejidos de cáncer colorrectal fue variable en diferentes células. Estudios anteriores demostraron que CD133 se expresa en las células cancerosas, pero no hemocitos [4, 5] y la mayoría de las células de carcinoma expresó una membrana glicoproteína EpCAM [34], que se considera como uno de los marcadores de CSC en varios tipos de carcinoma de [37] encontró que .We CD133 se expresa en EpCAM
+ células (Fig 4), indicando las células que expresan CD133 son células de cáncer colorrectal. A pesar de la EMT se indica como la característica de los CAC, si existe relación alguna entre ellos siguen sin estar claros. En estudios anteriores, los CAC-como las células podrían ser generados por la activación EMT inducida en líneas celulares o modelo de ratón [19, 38]. Por lo tanto, pensamos que fenómeno similar puede existir en el cáncer colorrectal. En el presente experimento, se utilizó el microscopio confocal para detectar diferentes marcadores de expresión en el cáncer, lo que podría observar la expresión de varias proteínas en cada célula de forma simultánea. Como era de esperar, encontramos que CD133
+ células en tejidos de cáncer colorrectal humano tenían fenotipos EMT, la regulación negativa de E-cadherina y la regulación positiva de la vimentina. Este fenómeno ocurrió en una porción de las células CD133 positivas, lo que podría ser refiere a la razón por la que la EMT fue un curso dinámico y difícil de atrapar el interruptor. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican la conexión directa entre los CSC y EMT en tejidos de cáncer colorrectal.
células madre cancerosas tienen características biológicas intrínsecas para formar tumor y puede propagarse a través de EMT. Sería interesante determinar cómo evadir la vigilancia inmune para supervivencia final especialmente en huéspedes inmunocompetentes. B7H1 es una molécula coestimuladora negativo fundamental que lleva a immunoevasion en los cánceres. B7H1 expresión de CD133
+ células cancerosas indica que B7H1 puede desempeñar un papel en los CAC. Recientemente ensayos clínicos mostraron que el bloqueo de PD-1-B7H1 vía da lugar a un buen pronóstico relativo en la terapia contra el cáncer y la expresión B7H1 en tejidos de cáncer se asocia con el resultado del tratamiento [39]. Sobre la base de lo que hemos encontrado aquí, este notable resultado podría estar relacionado con el control de células madre cancerosas al dirigirse vía PD-1-B7H1. B7H1 se considera un objetivo mejor que otra molécula co-estimulante negativo, CTLA-4, porque la distribución de B7H1 /PD-1 eje está dentro del microambiente del tumor de forma más selectiva [40, 41]. Nuestros resultados sugieren que la orientación B7H1 podría perjudicar a la "principal culpable" del cáncer, las células madre del cáncer, en el cáncer colorrectal. Por otra parte, algunos B7H1
+ manifestada fenotipo similar a la EMT, dando a entender la posible relación de immunoevasion y EMT. En el modelo de ratones transgénicos, se ha demostrado que la regulación positiva de B7-H1 en células epiteliales de la piel promovidos EMT y acelera la carcinogénesis [42], lo que era coherente con nuestra conclusión de que las células cancerosas que expresan B7H1 tenían fenotipos EMT en tejidos de cáncer colorrectal.
en conjunto, nuestros resultados mostraron expresión B7H1 y fenotipos de la EMT en CD133
+ células, lo que indica los posibles mecanismos para los CAC para escapar de la vigilancia inmune e invaden los tejidos distantes. Aunque algunos estudios duda acerca de CD133 para el marcador células madre cancerosas ", nuestros resultados sugieren que en CD133
+ subpoblación incluyó una sección de las células posee características que ayudan a las células invaden y metástasis, especialmente en los que se manifiestan y fenotipos EMT expresan B7H1. Tal una pequeña sección de células cancerosas tienen potente tumorigenicidad y podría invadir y metastatizar sin ataque inmune, que puede cerrar a las células madre cancerosas teóricos en aspectos funcionales. Sin embargo, todavía no se sabe si la expresión de EMT y B7H1 de células madre cancerosas son dos eventos independientes o estén regulados por la misma vía de señalización al mismo tiempo. Se demostró que la señal de mTOR y el factor de -1α inducible por hipoxia, que era un factor importante para inducir la EMT, la expresión de CD133 regulada en las células del cáncer [43], lo que indica que CD133 de expresión y de EMT fenotipos estaban relacionadas con la hipoxia y pueden ser reguladas por mTOR señal. Por otra parte, B7H1 estaba regulado por PTEN a través de la vía PI3K /Akt /mTOR en el cáncer de páncreas [44]. Estos estudios sugieren que la señalización de mTOR podría estar implicada en la relación entre la EMT y la evasión inmune en células madre cancerosas. A partir de entonces, estamos tratando de averiguar la importante vía de que se trate con EMT y immunevasion en células madre cancerosas en estudios posteriores, que puede ser un objetivo crucial en la terapia del cáncer.
Apoyo a la Información
S1 Fig. CD133 se expresa en el tejido apenas paraneplastic.
Inmunofluorescencia de la sección de congelados de la muestra de cáncer de colon muestra que hay una región de relativa normal al lado de nidos de cáncer, donde CD133 (rojo) es bastante más débil (izquierda) que en nido cáncer (derecha) . DAPI (gris) se utilizó para la tinción nuclear. Se muestra un representante de cáncer de colon adenocarcinoma moderadamente diferenciado, T3N0M0. (Barra = 50 micras)
doi: 10.1371 /journal.pone.0135528.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Chen Yongwen de comentarios interesantes, Prof. Lieping Chen para el anticuerpo B7H1 y Wei Wang Liting Sol y excelente para la asistencia técnica para la colección de imágenes de escaneo láser confocal microscopio de fluorescencia.