Extracto
El carcinoma hepatocelular (HCC) es una enfermedad prevalente en todo el mundo, y la mayoría de las muertes relacionadas con el CHC se producen debido a la invasión local y metástasis a distancia. Las células madre del cáncer (CSC) son una pequeña subpoblación de células cancerosas que se han planteado la hipótesis de que es responsable de la enfermedad metastásica. Recientemente, nosotros y otros han identificado una población CSC a partir de líneas celulares de HCC humano y xenoinjertos de tumores caracterizados por su expresión de CD133. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos por los cuales CD133
+ cáncer de células madre similares a median la metástasis HCC no han sido suficientemente analizados. células de HCC aquí, hemos ordena con CD133 como un cáncer de células madre marcador (CSC) por magnético de células activadas por la clasificación (MACS) y demostraron que el CD133
+ células de HCC no sólo poseen una mayor capacidad migratoria e invasiva
In
vitro, sino también están dotados de una mayor capacidad metastásica
in vivo
y en muestras de HCC humanos cuando se compara con CD133
- células de HCC. La expresión de genes de la CD133
+ y CD133
- células de la línea HCC SMMC-7721 reveló que G receptor acoplado a proteína 87 (GPR87) es altamente expresado en CD133
+ células HCC. En este estudio, hemos explorado el papel de GPR87 en la regulación de la expresión de CD133. Hemos demostrado que la sobreexpresión de GPR87 hasta reguladas expresión de CD133, promovido propiedades migratorias e invasivas asociadas-CSC
in vitro
, y el aumento de la iniciación del tumor
in vivo
. A la inversa, el silenciamiento de la expresión de GPR87 redujo los niveles de expresión de CD133. Conclusión: GPR87 promueve el crecimiento y la metástasis de CD133
+ células madre, como el cáncer, y nuestros hallazgos puede revelar nuevas dianas para la prevención o el tratamiento de HCC
Visto:. Yan H, Li H, Zhu M, Zhao F, Zhang L, Chen T, et al. (2013) G receptor acoplado a proteína 87 (GPR87) Promueve el crecimiento y metástasis de CD133
+ Cáncer de células madre-como en el carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 8 (4): e61056. doi: 10.1371 /journal.pone.0061056
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 19 de diciembre de 2012; Aceptado: March 5, 2013; Publicado: 10 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica clave de China (973) (2009CB521803), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81272438), el Proyecto Nacional de clave de ciencia y tecnología especial de China (2013ZX10002-11), el Programa de Shanghai Tema Ciencia y Jefe (A) (09XD1403600) y Líder del Proyecto disciplina académica de la Comisión de Educación Municipal de Shanghai (J50208). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los cánceres humanos más comunes, y la mayoría de las muertes relacionadas con el CHC se producen debido a la invasión local y metástasis a distancia [1]. A pesar del progreso significativo, la mayoría de los enfoques terapéuticos no consiguen eliminar todas las células tumorales, y las células cancerosas residuales suelen dar lugar a la recurrencia del tumor y la metástasis. aumento de la evidencia ha mostrado que las células madre del cáncer (CSC) pueden ser responsables de la resistencia a la terapia convencional y enfermedad metastásica [2], [3], [4], [5]. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la metástasis no se entienden suficientemente.
CD133, una glicoproteína transmembrana 5-, es una importante proteína de superficie celular que ha sido identificado como un marcador de células madre de cáncer en varios tumores sólidos [6], [7], [8], incluyendo el cáncer de hígado [5], [9], [10]. Nuestro estudio previo identificó por primera vez y confirmó la existencia de una pequeña subpoblación de CD133
+ HCC células dentro de las líneas celulares de HCC que exhiben una mayor clonogenicidad
in vitro Opiniones y potente tumorigenicidad
in vivo
[11 ]. Otros grupos también han demostrado que
células CD133 + HCC poseen propiedades similares a las células madre del cáncer, incluyendo la auto-renovación, diferenciación,
in vivo
la iniciación del tumor y la resistencia a la quimioterapia [12], [13], [ ,,,0],14], [15]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de las células CD133
+ CHC en la metástasis tumoral.
G receptor acoplado a proteína 87 (GPR87), también conocido como GPR95, es una GPR superficie celular que se sobreexpresa en diversos tipos de cáncer y desempeña un papel esencial en la supervivencia de las células tumorales [16], [17]. Aunque gran parte de la evidencia sugiere que los GPR juegan un papel importante en la regulación de la morfología celular, la polaridad y la migración [18], [19], [20], hay pocos informes sobre la función de GPR87. Sólo dos informes han demostrado que las células de cáncer de GPR87 caída sensibilizados a la supresión del crecimiento inducida por el daño del ADN a través de la estabilización de p53 mejorada y la activación [16], [21].
En el presente estudio, hemos aislado un CD133
+ subpoblación CSC similar a partir de líneas celulares de HCC humanos y demostraron que el CD133
+ células de HCC muestran propiedades migratorias e invasivas
in vitro Opiniones y poseían el potencial metastásico
in vivo
. Por otra parte, hemos explorado el papel de GPR87 en la regulación de la expresión de CD133, que a su vez promueve el crecimiento y la metástasis de las células madre, como el cáncer en el CHC.
Materiales y Métodos
Cultivo Celular
las líneas celulares de HCC Hep3B, SNU475 y PLC /PRF /5 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, EE.UU.). La línea celular SMMC-7721 se obtuvo del Banco de Células del Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). La línea de MHCC-97L fue proporcionado por el Instituto de Cáncer de hígado de Zhongshan Hospital de la Universidad de Fudan (Shanghai, China). La línea celular HCC-LY5 se estableció en nuestro laboratorio por aislamiento a partir de una muestra de un paciente HCC que habían sometido a resección del cáncer de hígado en el Instituto de Cáncer de Hígado del Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan (Shanghai, China). Todas las líneas celulares se cultivaron en Dulbecco modificado de Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, EE.UU.) que contiene 10% FBS inactivado por calor (BioWest, Francia) suplementado con 100 UI /ml de penicilina G y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, EE.UU.), y las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2.
el aislamiento de la célula por célula-magnética activadas por la clasificación (MACS)
las células se marcaron con CD133 primaria /1 anticuerpo (IgG1 de ratón, Miltenyi Biotec, Alemania), y el CD133
+ y CD133
- células fueron posteriormente aislados magnéticamente utilizando el Kit de EasySep PE Selección (StemCell Technologies, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de las células clasificadas se evaluó mediante Western blot. Tinción con azul tripán se utilizó para evaluar la viabilidad de las células clasificadas, y mayor que 90% de viabilidad se consideró aceptable para los experimentos posteriores.
Lentivirus Producción y la transducción de la célula
La secuencia de GPR87 ORF se amplificó-PCR utilizando cebadores específicos (adelante: 5'-TCGACGCGTATGGGGTTCAACTTGACGCTTG-3 ', inversa: 5'-TTCCATATGGGCAAACATTACACGCAGACAA-3') y se clonó en el vector de expresión lentiviral pWPXL (Addgene, MA) reemplazando el fragmento de GFP. El clon de ADNc de CD133 (marcado con Myc-DDK clon ORF del Homo sapiens prominin 1 (PROM1), transcripción variante 1 como la transfección de ADN listo NM_006017.1) con secuencia de longitud completa ORF fue adquirido de Origene (OriGene Technologies, Inc. Rockville) , que fue clonado en el vector de expresión lentiviral pWPXL (Addgene, MA) mediante la sustitución del fragmento de GFP. Los vectores pLVTHM-shGPR87 y pLVTHM-SHNC se construyeron insertando oligos hibridados (GPR87: 5'-CCGGUGCUUUAUCUCAUUATT-3 'o 5' GGACCUUGGUACUUCAAGUTT-3 ', NC: 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3') en el vector lentiviral pLVTHM como se describe en el sitio web Addgene.
el embalaje viral se realizó en las células HEK 293T después de co-transfección del vector pWPXL-GPR87 o pLVTHM-shGPR87 con el plásmido de empaquetamiento psPAX2 y el plásmido de la cubierta pMD2.G (Addgene, MA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Canadá). Los virus se cosecharon 72 h después de la transfección, y se determinaron los títulos virales. Las células diana (1 × 10
5), incluyendo SMMC-7721, las células HCC-LY5, MHCC-97L, PLC /PRF /5 y Hep 3B, se infectaron con 1 × 10
6 unidades de lentivirus de transducción recombinantes en la presencia de 6 g /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, EE.UU.).
inmunohistoquímica (IHC) la tinción de tejidos humanos HCC
Doscientos treinta y seis muestras de tejido HCC humano se obtuvieron de pacientes que se sometieron a tratamiento quirúrgico en el Instituto del cáncer de Guangxi (Nanning, china), el Instituto de cáncer de hígado Qidong (Qidong, china) o el primer hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang (Hangzhou, china). Los 236 pacientes con CHC incluyó a 190 varones y 46 mujeres (edad media: 50,9 años, que van desde 21 a 83 años). Todos los procedimientos se realizaron bajo acuerdos de consenso y de acuerdo con el Comité de Revisión Ética de China. Todas las muestras de tejido se fijaron en 4% de formalina neutra tamponada con fosfato durante al menos 72 h y de manera rutinaria incluidos en parafina. Los microarrays de tejidos se construyeron como se describe anteriormente [22].
secciones embebidas en parafina de tejido de matriz se prepararon (5 micras de grosor), y los inmunoconjugados se detectaron por inmunofluorescencia de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente [11]. Para las diluciones de anticuerpos óptimas, se emplearon concentraciones recomendadas de los fabricantes. Los resultados se visualizaron y fotografiaron usando un microscopio Axioskop 2 (Carl Zeiss, Alemania) con un sistema CCD DP70 (Olympus, Japón).
En tiempo real de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
Total el ARN se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Canadá) y se transcribió inversamente usando el kit de RT reactivo PrimeScript ™ (Perfect Tiempo real) (Takara Biotecnología, Japón). La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) se llevó a cabo posteriormente como se describe anteriormente [22]. Los niveles de expresión se normalizaron en contra de las del gen de referencia interna gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Western Blot
La lisis celular, preparación de muestras, separación SDS-PAGE y electrotransferation de membranas de nitrocelulosa se realizaron usando protocolos estándar. La inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando el ratón anti-CD133 /1 IgG1 (Miltenyi Biotec) y se visualizó utilizando SuperSignal West Femto máxima sensibilidad Substrato (Pierce). β-actina se volvió a sondear como control de carga.
En Vivo
Análisis de crecimiento tumoral y metástasis
Todos los protocolos de experimentación con animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Médico de Shanghai Comisión de Cuidado de Animales experimentales de la Universidad de Shanghai Jiaotong (ID aprobación. SHCI-12-023). De seis a ocho semanas de edad congénitamente inmune deficiente en no obesos /severa Inmunodeficiencia combinada diabético (NOD /SCID) los ratones machos fueron divididos aleatoriamente en grupos y se mantuvieron en condiciones estándar según las directrices de la institución.
Para la inoculación ortotópico, una incisión transversal de 8 mm se hizo en la parte superior del abdomen bajo anestesia. Diez mil CD133
+ o CD133
- células clasificadas a partir de células SMMC-7721 se suspendieron en 50 l de DMEM libre de suero /Matrigel (01:01) y se inyecta en el lóbulo hepático izquierdo de los ratones usando una microjeringa. La formación de tumores se monitorizó a partir de 1 semana después de la inoculación. El
in vivo
señal de luciferasa se visualizó y midió utilizando un
in vivo sistema de imágenes en
(LB983 NC320, Berthold Technologies GmbH & amp;. Co KG, Alemania). Después de 12 semanas, todos los ratones fueron sacrificados, y se diseccionaron las masas tumorales y se inocularon muestras de tejido de hígado murino y microscópicamente examinado.
Para establecer un modelo animal-homing tumor, NOD /ratones SCID se lavaged primero con 20 mg /kg 2-acetaminofluorene (2-AAF) o 0,2% de DMSO durante una semana. A continuación, 2/3 del lóbulo hepático izquierdo fue resecado quirúrgicamente, y 10.000 CD133
+ o células CD133
- células que estaban recién aislado de la línea celular SMMC-7721 por MACS se inyectaron en el bazo. El bazo se resecó 5 minutos después de la inyección, y lavaged con 2-AAF o DMSO continuó hasta 9 semanas. Al final de la novena semana, todos los ratones fueron sacrificados, la formación de tumores de xenoinjerto y se observaron metástasis y los tejidos del hígado y de los pulmones se diseccionaron y se sometieron a examen microscópico [23], [24], [25].
análisis estadístico
El paquete de software estadístico de Ciencias Sociales (versión 18.0) (SPSS) se utilizó para el análisis estadístico. la prueba t de Student independiente o ANOVA se utilizó para comparar las variables continuas entre los grupos, mientras que no se aplicó el análisis de χ2 para la comparación de las variables dicotómicas.
P
los valores inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los asteriscos se utilizan para representar la significación estadística de los
P
valores en algunas figuras, por ejemplo, * P = 0.05, ** p≤0.01.
Resultados
CD133
+ células HCC pantalla de alta invasoras y potencial metastásico
in vitro
células madre cancerosas se sabe que presentan una mayor potencial migratorio e invasivo. Para investigar más a fondo el potencial metastásico de CD133
+ células HCC
in vitro
, nos lo solucionaron SMMC-7721, SNU475, PLC /PRF /5 y las células HCC-LY5 HCC primaria humanos basa en la expresión de CD133 por MACS . La expresión CD133 de las células clasificadas se confirmó por Western blot (Figura 1A), y se analizaron las características relacionadas con el CSC de las células aisladas. Curiosamente, aunque el CD133
+ y CD133
- ordenados células de las líneas celulares SMMC-7721 y HCC-LY5 no mostraron diferencias significativas en el crecimiento (Figura 1B), el CD133
+ células migraron e invadieron a en mayor medida que el CD133
- células en
in vitro
transwell ensayos de migración y la invasión de matrigel (Figura 1 C, D), indicando que CD133
+ células son altamente migratoria e invasiva. Para poner a prueba su potencial proliferativo, se compararon sus capacidades de formación de colonias por la proliferación y ensayos de formación de colonias en agar blando. Los resultados demostraron que el CD133
+ células fueron capaces de iniciar colonias más grandes y más numerosos que los correspondientes CD133
- células (Figura S1, S2), lo que indica que el CD133
+ células exhiben un mayor crecimiento
in vitro
. Junto a ello, también a prueba la capacidad de auto-renovación de las células CD133 según ensayo de formación de esferoides. En la primera generación, el CD133
+ células fueron capaces de generar más grandes y más esferoides que el CD133 correspondiente
- células
in vitro
. En la segunda generación, el CD133
+ células había mantenido su carácter primario (Figura S3). Los resultados demostraron que el CD133
+ células muestran la capacidad de auto-renovación activa
in vitro Hoteles en cultivos primarios y de paso.
(A) Aislamiento de CD133
+ células HCC ordenadas por MACS y la detección de la expresión de CD133 en SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 y PLC /PRF /5 células por Western blot. curvas (B) Crecimiento de la ordenada CD133
+ y CD133
- SMMC-7721 y las células HCC-LY5 se obtuvieron mediante el ensayo de CCK-8. ensayo de migración (C) Transwell de CD133
+ y CD133
- ordenados células de las líneas celulares de HCC-LY5 SMMC-7721 y. (D) ensayo Transwell Matrigel invasión de CD133
+ y CD133
-. Ordenados células de las líneas celulares SMMC-7721 y HCC-LY5
CD133
+ células HCC Manifiesto Características altamente metastásicas
en Vivo
Nuestro estudio anterior demostró que CD133
+ células HCC eran claramente tumorigénico en un modelo de xenoinjerto [11]. A fin de evaluar el potencial metastásico de CD133
+ células de HCC, establecimos un modelo de trasplante ortotópico de animales. Los resultados mostraron que 10.000 CD133 células
+ SMMC-7721 eran suficientes para inducir la formación de tumor en 5/5 (100%) y la metástasis intrahepática en 2/5 (40%) ratones NOD /SCID después de 3 meses, mientras que un equivalente número de CD133
- sólo las células inducidas formación de tumores en 3/5 (60%) los ratones, y no produjeron metástasis tumoral (Figura 2 a, B, C). Hematoxilina-eosina (HE) tinción reveló características histológicas similares en los trasplantes de tumor ortotópico (Figura 2D). Además, para evaluar aún más la
in vivo
capacidad de homing de las células tumorales, que se considera una característica metastásico de células madre cancerosas, un modelo animal de la vivienda de células tumorales se estableció en ratones NOD /SCID. Los resultados mostraron que los ratones NOD /SCID 9/9 inocularon con 10.000 CD133
+ HCC células tumores y metástasis desarrollados, mientras que un menor número de tumores se encuentran en los hígados de ratones NOD /SCID tratados con un número equivalente de CD133
- Células. Curiosamente, los tumores generados por el CD133
+ células crecieron y formaron masa tumoral en el sitio de lóbulo hepático resecado, que indica que el CD133
+ células HCC son altamente móviles y exhiben una capacidad de tumor-homing (Figura 2E , F), que se confirmó por examen histopatológico (Figura 2G, H). Los resultados presentados anteriormente firmemente indicaron que CD133
+ células poseían una alta capacidad de metástasis de tumores
in vivo
en el CHC.
(A) Representante
in vivo
bioluminiscencia de imágenes de metástasis tumorales en ratones NOD /SCID después del trasplante ortotópico con el CD133 aislado
+ o CD133
- células SMMC-7721 (imagen que se muestra es representativa del grupo ortotópica trasplantados con 10.000 células) (n = 5 cada grupo ). (B) Los ejemplos representativos de NOD /SCID trasplantados con ortotópica CD133
+ o CD133
- células aisladas de la línea celular HCC SMMC-7721. (C) El número de ratones que manifiestan tumorigenicidad y metástasis hepáticas de CD133
+ células SMMC-7721 en los ensayos de trasplante ortotópico se muestran en la tabla. (D) SE tinción de los tumores recogidos confirmó un fenotipo HCC primaria. (E) Representante
in vivo
imágenes de bioluminiscencia de la metástasis tumoral en el ratones NOD /SCID en un modelo animal-homing tumor trasplantado con CD133
+ o CD133
- células aisladas de la SMMC-7721 línea celular (n = 9 cada grupo). (F) Los ejemplos representativos de la formación de tumores de hígado y metástasis en modelo animal 2-AAF /PHx trasplantados con CD133
+ o CD133
- células aisladas de la línea celular HCC SMMC-7721. (G) SE tinción de secciones de tejido hepático, una masa tumoral de CD133
+ células de HCC en 2-AAF modelo animal /PHx se mostró. (H) El número de ratones que manifiestan metástasis hepáticas de CD133
+ o CD133
-. SMMC células-7721 en el modelo animal del tumor-homing se muestran en la barra de gragh
+ HCC células de presentación de expresiones de genes únicos perfiles
Para estudiar el mecanismo molecular que subyace a la metástasis en el carcinoma hepatocelular humano, se compararon los perfiles de expresión génica global de la CD133
+ células de HCC y su CD133
- homólogos aislados de células SMMC-7721 utilizando el 2,0 array Affymetrix GeneChip ® Genoma humano U133 Plus. Se identificaron 454 genes expresados diferencialmente comunes que muestran un cambio veces mayor que 1,5. De estos 454 genes, 312 fueron reguladas y 142 se redujeron reguladas. Los genes identificados fueron sometidos además a análisis bioinformático. Las funciones de los genes expresados diferencialmente se asociaron con la adhesión celular, la migración, citoesqueleto, el movimiento quimiotáctico y la metástasis (Tabla S1, S2). Entre los genes que son expresados diferencialmente entre el CD133
+ y CD133
- poblaciones, GPR87 fue encontrado para ser de hasta reguladas por aproximadamente 8 veces en el CD133 células
+ en comparación con el CD133
- células. Para aclarar el papel de GPR87 en el crecimiento tumoral y la metástasis de CD133
+ células de HCC, lo primero que examinó la expresión de GPR87 en líneas celulares de HCC ordenados y HCC células humanas primarias por QRT-PCR y Western blot. Se encontró que los niveles de expresión de GPR87 en el CD133
+ líneas celulares de HCC fueron mayores que en sus CD133
- homólogos (Figura 3 A, C). A continuación, prueba la capacidad de las diferentes líneas celulares de HCC y células primarias humanas para expresar GPR87. se detectó GPR87 en las líneas celulares de HCC y células de HCC primaria humanos por análisis de transferencia de Western, aunque en diferentes cantidades (Figura 3B). Para entender mejor la función de GPR87 en HCC metástasis, establecimos primero dos líneas celulares estables que expresan GPR87 ectópica, SMMC-7721-lenti-GPR87 y HCC-LY5-lenti-GPR87, usando un vector de lentivirus. A continuación, examinó la expresión de CD133 y las propiedades relacionadas con el CSC en estas líneas celulares estables. Se encontró que la sobreexpresión de GPR87 en SMMC-7721 y las células HCC-LY5 resultó en un aumento en el ARNm y los niveles de proteína de CD133 (Figura 3D, E). Para entender mejor la correlación entre CD133 y la expresión de GPR87 en tejidos HCC, se realizó la tinción inmunohistoquímica. se detectó CD133 y GPR87 expresión en las muestras de tumor, la expresión de CD133 se correlacionó con la expresión de GPR87 en tejidos HCC (R = 0,168, P & lt; 0,05) (Figura 3F; Tabla S3).
(A) los niveles de expresión de ARNm de GPR87 y CD133 se determinaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en el CD133
+ y CD133
- poblaciones ordenados desde el SMMC-7721, las líneas celulares MHCC-97L-HCC y LY5. (B) transferencia de Western de GPR87 en las líneas celulares de HCC y células humanas primarias. (C) Western blot de GPR87 en el CD133
+ y CD133
- poblaciones ordenados desde el SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 y PLC /RFP /5 células. (D) Los niveles de expresión de la proteína GPR87 y CD133 se determinaron mediante análisis de transferencia Western en las células y HCC-LY5-lenti-GPR87 lenti-GPR87-SMMC-7721. (E) La expresión de mRNA relativa de GPR87 y CD133 se determinaron mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en el SMMC-7721-lenti-GPR87 y las células HCC-LY5-lenti-GPR87. (F) La tabla muestra la correlación entre CD133 y la expresión de GPR87 en tejidos HCC.
La sobreexpresión de GPR87 arriba-regula la expresión de CD133 y relacionadas con el CSC Propiedades
Para determinar el efecto de GPR87 sobre la proliferación celular, se analizó el papel de GPR87 en la formación de colonias. Como se representa en la figura 4A, la sobreexpresión de GPR87 en SMMC-7721 y las células HCC-LY5 aumentó la capacidad de formación de colonias en comparación con las células correspondientes vacíos por vectores infectados (P & lt; 0,05). Para examinar si la sobreexpresión de GPR87 también podría promover el crecimiento tumoral y la metástasis
in vivo
, que forma ortotópica inocularon 2 x 10 celdas
6 SMMC-7721-lenti-GPR87 o Lenti de control SMMC-7721 en el lóbulo hepático izquierdo de ratones NOD /SCID con una microjeringa. El examen macroscópico reveló que 6/6 ratones ortotópicamente inoculados con células SMMC-7721-lenti-GPR87 tumores desarrollados después de 6 semanas, mientras que el desarrollo de tumores sólo se detectó en 3/6 ratones tratados con un número equivalente de células-lenti-de control SMMC-7721 (Figura 4B). Además, el tamaño medio de tumor en los ratones inoculados con células SMMC-7721-lenti-GPR87 fue 1,6 veces mayor que en los ratones inoculados con células-lenti-pWPXL SMMC-7721.
in vitro
transwell ensayos de migración e invasión de matrigel En mostró que SMMC-7721-lenti-GPR87 y las células HCC-LY5-lenti-GPR87 migraron e invadieron a un mayor grado que las células por vectores infectados vacíos (P & lt; 0,05 ) (Figura 4 C, D). Estos hallazgos indican que GPR87 puede regular por incremento la expresión de CD133 y promover la metástasis
in vitro y el crecimiento
in vivo
. Aunque los niveles de proteína CD133 en tejidos HCC sin metástasis intrahepática no se correlacionaron con la expresión de GPR87 (R = 0,120, P & gt; 0,05) (Tabla S4, S5), los niveles de proteína CD133 en tejidos HCC con metástasis intrahepática correlacionados positivamente con la expresión de GPR87 (R = 0,267, P & lt; 0,05) (Figura 4E, F;. Tabla 1), lo que sugiere que CD133 puede ser de hasta reguladas por la expresión de GPR87 en HCC metastásico
(a) los ejemplos representativos de los ensayos de proliferación examinar el efecto de GPR87 sobreexpresión en SMMC-7721 y las células HCC-LY5. (B) Las características generales de la NOD portador de un tumor /ratones SCID trasplantados con ortotópica 2 × 10
6 células pWPXL SMMC-7721-lenti- SMMC-7721-lenti-GPR87 y después de 6 semanas (n = 6 cada grupo ). ensayo (C) Transwell migración en SMMC-7721 y las células que sobreexpresan LY5 HCC-GPR87. (D) ensayo de invasión Transwell Matrigel en SMMC-7721 y las células que sobreexpresan LY5 HCC-GPR87. tinción (E) inmunohistoquímico de GPR87 y CD133 en tejidos HCC con metástasis intrahepática. (F) La tabla muestra la correlación entre CD133 y la expresión de GPR87 en HCC tejidos con metástasis intrahepática.
El silenciamiento de GPR87 Inhibe CD133 Expresión y propiedades relacionadas con la CSC
Para investigar el papel funcional de GPR87 en CD133
+ células de HCC, que inhibió la expresión de GPR87 en PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 y células Huh-7 utilizando siRNA transfección. Análisis de citometría de flujo reveló que el silenciamiento de GPR87 reduce los niveles de CD133
+ células de expresión del 31,4% al 24,1% y el 26,7% en el PLC /PRF /5 células, desde el 51,3% hasta el 13,4% y el 18,5% en las células Hep 3B, desde el 2,2% hasta el 1,5% y el 1,0% en SNU475 células, pero ningún cambio se detectó en las células Huh-7 (Figura 5).
In vitro
, el silenciamiento de GPR87 en las células PLC /PRF /5 y Hep3B resultó en una disminución en el ARNm y la expresión de proteína de CD133 (figura S4). Por otra parte, GPR87 shRNA resultó en la reducción del crecimiento celular (P & lt; 0,05) (Figura S5). También hemos probado la capacidad de las células para invadir, migrar capacidad tras GPR87 caída.
in vitro
transwell ensayos de migración e invasión de matrigel En mostró que hubo una disminución en /PRF 5-shGPR87 células PLC /que las células infectadas por vectores vacíos (P & lt; 0,05) (Figura S6). Estos datos sugieren que GPR87 juega un papel importante en la regulación de la expresión de CD133.
análisis de citometría de flujo de los niveles de expresión de CD133 en células tratadas con ARNsi GPR87, incluyendo el PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 y Huh- 7 líneas celulares.
GPR87 intermediario en la expresión de CD133 en líneas celulares de HCC
a medida que los experimentos mostrados anteriormente, que habían demostrado que desmontables de GPR87 podría inhibir la expresión de CD133 y
in vitro
difusión, mientras que la sobreexpresión de GPR87 podría promover la expresión de CD133 y aumentar la metástasis tumoral en HCC. Para explorar más a fondo la correlación de la expresión de GPR87 y CD133, establecimos CD133 sobreexpresan líneas celulares estables, SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 y MHCC-97L-lenti-CD133, utilizando un vector de lentivirus, a continuación, examinamos expresión de GPR87. Los resultados mostraron claramente que la sobreexpresión de CD133 no fueron capaces de hasta de regular la expresión de GPR87 por QRT-PCR (Figura 6 A, B) y Western Blot (Figura 6C).
(A) mRNA expresión relativa de CD133 en SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 y MHCC-97L-lenti-CD133 células. (B) la expresión de mRNA relativa de GPR87 en SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 y CD133-células MHCC-97L-Lenti. (C) Western blot de GPR87 y CD133 en SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 y células MHCC-97L-lenti-CD133.
Discusión
el cáncer es una enfermedad sistémica, y representa la metástasis por más de 90% de letalidad en pacientes con cáncer [26]. En HCC, la metástasis es uno de los factores pronósticos más valiosos y afecta significativamente los resultados del paciente [27]. Recientemente, las células madre del cáncer (CSC) se han identificado como una subpoblación de células cancerosas que son responsables de la tumorigénesis, la resistencia terapéutica, la recurrencia y metástasis [28], [29], [30], [31]. Sin embargo, el mecanismo molecular de la metástasis CSC sigue siendo poco clara. explorar más a fondo este mecanismo no sólo puede proporcionar una nueva visión de HCC, sino también identificar una diana molecular útil para tratar eficazmente HCC.
Recientemente, nosotros y otros han identificado una población de CSC en el carcinoma hepatocelular que se caracteriza por la expresión de CD133. Sin embargo, las características metastásicas detalladas de células de HCC que expresan CD133 no están claros. En este estudio, mostramos que el CD133
+ HCC células poseen alto potencial metastásico invasivo y
in vitro
. A diferencia de sus CD133
- contrapartes, las células CD133 10,000
+ SMMC-7721 eran suficientes para inducir la formación de tumores y metástasis intrahepática ortotópico en ratones NOD /SCID después de 3 meses. Además, hemos demostrado que 10.000 CD133
+ células fueron suficientes para inducir metástasis experimental de la inoculación spleenic en un modelo animal-homing del tumor, lo que indica que CD133
+ células tienen la capacidad de tumor-homing
in vivo
.
Recientemente, el aumento de la expresión de CD133 se ha observado en las células madre de cáncer de una variedad de cánceres humanos y de ratón. Nuevas pruebas ha demostrado que la expresión CD133 puede ser regulado por varios factores, incluyendo el factor de crecimiento transformante beta 1 [32], BMP4 [33], microRNA-150 [2] y el interferón-alfa [4]. Sin embargo, ningún ligando natural para CD133 todavía no se identificó, y se sabe poco acerca de su función. En el presente estudio, se compararon los perfiles de expresión génica global de CD133
+ HCC células madre cancerosas y su CD133
- homólogos aislados de células SMMC-7721 usando GeneChip análisis y encontró que la expresión de GPR87 en CD133
+ líneas celulares de HCC se incrementó en comparación a la de sus CD133
- homólogos. Este hallazgo indica que puede haber una relación entre el GPR87 y CD133 en el proceso de metástasis en HCC. Sin embargo, no hay evidencia ha confirmado la correlación entre GPR87 y CD133. Aquí, hemos demostrado por primera vez que el silenciamiento de GPR87 disminuyó los niveles de expresión de CD133. La sobreexpresión de GPR87 mejora de forma significativa la migración y la invasión de células de HCC, aumentó su capacidad de formación de colonias
in vitro
y promovió la formación de tumores y el crecimiento
in vivo
. Estos resultados sugieren que el GPR87 tiene un papel crítico en la modulación de la expresión de CD133 y contribuye al crecimiento y la metástasis de las células de HCC.
La metástasis del mecanismo molecular que subyace en el CHC células madre cancerosas requiere más estudio. Nuestro trabajo futuro se centrará en dilucidar el mecanismo subyacente a la regulación de GPR87 mediada por CD133 en células madre cancerosas HCC y definir dianas terapéuticas moleculares en células madre cancerosas HCC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
ensayo de formación de colonias de CD133
+/- HCC células en cultivo 2D. Los ejemplos representativos de los ensayos de proliferación de CD133
+ y CD133
- células aisladas a partir de células SMMC-7721 y HCC-LY5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s001 gratis (TIF)
Figura S2.
ensayo de formación de colonias de CD133
+/- células de HCC en agar blando. Los ejemplos representativos de los ensayos de proliferación de CD133
+ y CD133
- células aisladas a partir de células SMMC-7721 y HCC-LY5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
ensayo de formación de esferoides de CD133
+/- células de HCC
in vitro
. Los ejemplos representativos de los ensayos de formación de esferoides de CD133
+ y CD133
- células aisladas a partir de células SMMC-7721 y HCC-LY5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061056.s003 gratis (TIF)
figura S4.