Extracto
Antecedentes
Cada año, aproximadamente 74.000 mujeres mueren de cáncer de endometrio, principalmente debido a la enfermedad recurrente o metastásica. La presencia de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), así como receptores de progesterona positividad (PR) se ha correlacionado con un mejor pronóstico. Este estudio describe dos mecanismos por los cuales la progesterona inhibe la diseminación metastásica del cáncer de endometrio: mediante la estimulación de la infiltración de células T y mediante la inhibición de la transición epitelio-mesenquimal transición celular (EMT)
Metodología y Principales conclusiones
las secciones en parafina de pacientes con (n = 9) o sin (n = 9) el cáncer de endometrio progresiva (enfermedad recurrente o metastásica) fueron evaluados para determinar la presencia de células CD4 + (ayudante), CD8 + (citotóxicos) y Foxp3 + (reguladores) linfocitos T y la expresión de PR. se observó enfermedad progresiva que se asocia con una pérdida significativa de los TIL y la pérdida de la expresión de PR. Las muestras congeladas de tumores, que se utiliza para el análisis de la expresión de todo el genoma, mostraron regulación significativa de los involucrados en la immunesurveillance, EMT y la metástasis. Para un número de genes, tales como CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 y WIF1, cuantitativo RT-PCR se realizó para verificar la altura o regulación a la baja en la enfermedad progresiva. Para corroborar el papel de la progesterona en la regulación de la invasión, Ishikawa (IK) líneas celulares de cáncer de endometrio transfectadas de forma estable con PRA (IKPRA), PRB (IKPRB) y PRA + PRB (IKPRAB) se cultivaron en presencia /ausencia de progesterona (MPA) y se utilizó para el análisis de todo el genoma de expresión, Boyden- y cicatrización de heridas ensayos de migración, y la IHC para los marcadores de EMT conocidos. líneas celulares IKPRB y IKPRAB mostraron MPA inhibición inducida de la migración y la pérdida de la vimentina marcador mesenquimal en la parte delantera invasiva del ensayo de curación de la herida. Por otra parte, la vía de análisis de los genes regulados significativamente MPA mostró regulación a la baja significativa de las vías importantes que intervienen en la EMT, inmunosupresión y metástasis:. IL6- tales como, el TGF-β y la señalización /β-catenina vía
Conclusión
Intact señalización progesterona en el cáncer de endometrio no progresiva parece ser un factor importante estimulante immunosurveilance y la inhibición de transición de un epitelial a un más mesenquimal, fenotipo más invasivo
Visto:. van der Horst PH, Wang y , Vandenput I, Kühne LC, Ewing PC, van IJcken WFJ, et al. (2012) progesterona inhibe la transición epitelio-mesenquimal transición en el cáncer endometrial. PLoS ONE 7 (1): e30840. doi: 10.1371 /journal.pone.0030840
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Junio, 2011; Aceptado 22 de diciembre de 2011; Publicado: 25 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 van der Horst et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo de LJB y MvdZ está apoyado por una beca de la Sociedad del cáncer Holandés (EMCR 2008 a 4056). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, en todo el mundo, más de 287.000 mujeres desarrollan cáncer de endometrio lo que es el cáncer ginecológico más frecuente en el mundo y el cuarto tumor maligno femenina más común en los países desarrollados [1]. Por lo general, se detecta el cáncer de endometrio en una etapa temprana y la cirugía es la piedra angular del tratamiento. Donde hay enfermedad recurrente o metastásica, sin embargo, la situación es diferente. radiación (neo) adyuvante y /o terapia sistémica en combinación con la cirugía suele estar indicada y, en general, la enfermedad progresiva tiene un mal pronóstico que representa 74.000 muertes en el mundo cada año [2], [3]. Los factores de pronóstico para el cáncer de endometrio recurrente y metastásico incluyen el estadio quirúrgico de la FIGO, grado de diferenciación, subtipo histológico y del miometrio y la invasión linfovascular [2], [4], [5], [6], [7].
en varios tipos de cáncer, la presencia de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) se ha correlacionado con un mejor pronóstico, y mucha investigación se ha realizado sobre este tema [8], [9], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. La razón es que el cáncer bien diferenciado evoca una respuesta inflamatoria similar a una lesión aguda que, después de la infiltración secuencial de diferentes poblaciones de células dendríticas, eventualmente resulta en T-linfocitos de infiltración [16]. La infiltración de los TIL como factor pronóstico positivo fue descrita por primera vez en el melanoma cutáneo, donde la presencia de TIL fue predictivo para mejorar la supervivencia [8]. Galon et al. en 2006, mostró que la infiltración de linfocitos del sistema inmune adaptativo en el centro y el margen invasivo del cáncer colorrectal se correlacionó positivamente con la recurrencia reducida y mejora de la supervivencia [10]. En 2009 Kilic et al., Demostró que altos niveles de TIL en cáncer de pulmón de células no pequeñas correlacionados con la recurrencia reducida y una mayor supervivencia [12]. En el cáncer de ovario, la presencia de linfocitos T intratumorales también se correlacionó positivamente con una mejor supervivencia y la recurrencia de la enfermedad [15] retrasado. Además, TIL en cáncer de ovario también se asociaron con mayores niveles de INF-γ, IL2 y quimiocinas que indica la activación de células T y la atracción [15].
La presencia de TIL no se ha investigado ampliamente en el cáncer de endometrio . En el cáncer de endometrio, la infiltración de agentes citotóxicos (CD8 +) linfocitos T en el área de la lesión ha sido descrito como un factor pronóstico independiente y se correlaciona positivamente con la enfermedad de supervivencia de libre y en general [17], [18]. Además, una alta relación de linfocitos T citotóxicos /reguladora de los linfocitos T (CD8 /FOXP3) se ha descrito que se correlaciona con la supervivencia mejorada en el tipo I cáncer de endometrio [17].
Al lado de la afluencia de T -lymphocytes en la zona del tumor, la presencia de receptores de progesterona (PR) también se describe como un activo importante en el pronóstico y el tratamiento del cáncer de endometrio [19], [20], [21]. En la expresión en el cáncer de endometrio bien diferenciado PR generalmente se mantiene y el tratamiento con acetato de medroxiprogesterona (MPA), de aquellos pacientes con enfermedad bien diferenciada que optaron por preservar la fertilidad, suele tener éxito [22], [23]. La pérdida de relaciones públicas, sin embargo, es un factor pronóstico negativo y se asocia con la enfermedad progresiva en la que SM el tratamiento es por lo general sólo temporalmente con éxito en el 15-20% de los casos [24].
Recientemente, nuestro grupo ha estudiado la mecanismo por el que la progesterona puede inducir la diferenciación durante el ciclo menstrual normal y puede inhibir el crecimiento bien diferenciado cáncer de endometrio. Se observó que el tratamiento con progesterona en la inducción de la expresión de dos inhibidores importantes de la señalización /β-catenina Wnt: DKK1 y FoxO1 [25], [26]. En el cáncer de endometrio, se observa la activación de la señalización /β-catenina en el 30-40% de los carcinomas endometrioide bien diferenciado [27] y la progesterona inducida por la inhibición de la vía de señalización de Wnt es la hipótesis de ser un mecanismo importante para reducir la progresión del cáncer [25] .
en este estudio tuvo como objetivo investigar el papel de la progesterona como un inhibidor directo de las capacidades migratorias de las células de cáncer de endometrio y su papel en la inhibición de los linfocitos T asociado de enfermedad progresiva.
Materiales Métodos y
materiales de pacientes
endometrial carcinoma primario de tejido de mujeres con (n = 9) y sin (n = 9) un episodio conocido de recurrencia o metástasis, se obtuvo de los pacientes tratados entre 1997 y 2006 en el hospital Universitario Gasthuisberg, Universidad Católica de Lovaina, Bélgica. A partir de este momento, la enfermedad no recurrente se conoce como la enfermedad no progresiva y la enfermedad metastásica /recurrentes como enfermedad progresiva. clasificación histopatológica, puesta en escena y la tipificación se determinaron de acuerdo con las directrices de la OMS y la FIGO [28], [29] y de todos los tumores fueron revisados por un patólogo con experiencia en gynaecopathology (PCE). Se incluyeron pacientes con un tipo endometrioide y un estadio I FIGO carcinoma de endometrio. Se excluyeron los pacientes tratados con esteroides hormonales radio- o quimioterapia antes de la cirugía, que utilizan o con una segunda neoplasia maligna. la historia clínica completa se obtuvo de todos los pacientes y el seguimiento fue revisado hasta la fecha. Las muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para RNA-aislamiento o fijaron en formalina y embebidos en parafina para inmunohistoquímica (IHC). Para el análisis de microarrays, a partir de 4 no progresiva y 4 pacientes progresivos, encajan a presión se utilizaron muestras congeladas de tumores. Estos fueron escogidos porque contenían & gt; 80% del tejido del tumor y la buena calidad del ARN podrían ser aislados de ellos. Por RT-PCR, se utilizaron 6 no progresiva y 6 de resorte progresivo congeladas muestras de tejido de pacientes. Para IHC 9 no progresiva y progresiva 9 de parafina embebido muestras de tejido de pacientes estaban disponibles. Tejidos y recopilación de datos clínicos para el estudio de la investigación actual fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario Gasthuisberg y los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la recogida de tejidos y recopilación de datos clínicos para todos los propósitos de investigación.
Cultivo celular
Para todos los experimentos de líneas celulares, líneas celulares de cáncer de endometrio Ishikawa establemente transfectadas con ARP (IKPRA-1), el PRB (IKPRB-1) o PRA y PRB (IKPRAB-36) (descritos anteriormente por Smit-Koopman et al. [30]) se cultivaron y se mantuvieron en medio de cultivo regular (DMEM /F12 Glutamax, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en presencia de 5% suero de ternera fetal (Invitrogen) suplementado con penicilina y estreptomicina (Invitrogen). Neomicina (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, EE.UU.) e higromicina (Invitrogen) 1:200 se utilizan para mantener la selección. Para todos los ensayos, las células se cultivaron en medio de cultivo DMEM /F12 suplementado con Glutamax penicilina y estreptomicina (Invitrogen), que contiene 5% de carbón despojado FCS (Invitrogen) con la adición de la higromicina y neomicina.
Inmunohistoquímica
estudios de inmunohistoquímica para CD4 (Sanbio BV, Uden, Países Bajos), CD8 (Dako, Glostrup, Dinamarca), FOXP3 (Natutech, Frankfurt am Main, Alemania) y PRA + PRB (receptor de progesterona Ab-8, Neomarkers, Fremont, CA, EE.UU.) se realizaron en 4 micras secciones de parafina en Starfrost-slides (Knittel, Braunschweig, Alemania). Antes de la incubación con el anticuerpo primario, los portaobjetos se desparafinaron en xileno y se rehidratan a 70% de etanol. Para CD4 + y CD8 + de linfocitos T tinción, los portaobjetos se microondas a 850 vatios en Tris /EDTA pH 9,0 durante 15 min. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con 30% H
2O
2 en PBS durante 5 min. Los anticuerpos primarios se aplicaron en respectivamente 1:160 (CD4) y 1:200 (CD8) en Tris /HCl pH 8,0 y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Después de lavar con Tris /HCl pH 8,0, las secciones se incubaron durante 30 min. a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario biotinilado (Dako, 1:400). Después de lavar con Tris /HCl, se utilizó el sustrato diaminobenzidina (Dako) para la visualización de la reactividad de antígeno-anticuerpo.
Para FOXP3, los portaobjetos se bloquearon (desactivación peroxidasa) durante 20 min a temperatura ambiente (RT) en 30 % H
2O
2 en metanol y se hierve (recuperación de antígeno) en un pH-tampón de citrato 6,0 por 15 min. El anticuerpo primario se aplicó en 1:25 y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron durante 30 min. con un anticuerpo secundario de conejo anti-rata (DAKO, 1:150) y se incubaron durante 30 min. con AB-complejo (Dako). Se utilizó la diaminobencidina sustrato (Dako) para la visualización de la reactividad de antígeno-anticuerpo.
Para la tinción PRA + PRB, la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó durante 5 min a RT en un 10% H
2O
2 en solución de metanol y los portaobjetos fueron calentados (recuperación de antígeno) en un horno microondas a 850 vatios en 10 nM de tampón de ácido cítrico pH 6.0 (DAKO) durante 15 min. Después de enfriar a temperatura ambiente diapositivas se lavaron con PBS y se bloquearon durante 30 minutos con 0,3% de BSA /PBS. El anticuerpo primario se aplicó en 1:50 y se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo de cabra anti-ratón secundario biotinilado (Dako, 1:400). Después del segundo lavado los portaobjetos se incubaron durante 30 min con AB-complejo (Dako, 1:1:50). El sustrato diaminobenzidina (Dako) se utilizó para la visualización de la reactividad. Todas las diapositivas se counterstained con hematoxilina durante 30 s, a continuación, deshidratadas y montadas.
Para la tinción de vimentina, un ensayo de cicatrización de heridas se llevó a cabo en las diapositivas 2 pocillos de cámara (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , EE.UU.), en presencia y ausencia de 1 nM de acetato de medroxiprogesterona (MPA), y terminado después de 48 hr. Las células se lavaron tres veces con PBS, se fijaron con formaldehído al 4% /PBS durante 15 minutos y se permeabilizaron con 0,3% Triton100 /PBS durante 5 minutos. Después del lavado, la actividad de peroxidasa endógena se bloqueó con 10% H
2O
2 en metanol durante 5 minutos. Los portaobjetos se lavaron y luego bloqueada durante 30 minutos con 0,3% de BSA /PBS. El anticuerpo anti-vimentina (Invitrogen) se aplicó a 1:50 y los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón-GFP fluorescente (Invitrogen) en 1:500. Después del lavado, los portaobjetos se incubaron durante 5 minutos con DAPI Solución de ácido nucleico de tinción (Invitrogen) para la tinción nuclear. Después de la terminación de la reacción con dH
2O, los portaobjetos se montaron y las imágenes fluorescentes fueron tomadas con la Axioplan 2 de imágenes de microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss AG, Jena, Alemania).
TIL Counting
Después de la tinción, los portaobjetos fueron escaneadas con el escáner de diapositivas NDP (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japón) y CD4, CD8 y linfocitos positivos para el tumor infiltrante FOXP3 (TIL) se contaron utilizando el software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD , ESTADOS UNIDOS). Se determinó el número de TIL en el interior del tumor (intratumoral), en el borde del tumor (Edge tumor) y en la frontera del miometrio /endometrial (EM). El borde completa del tumor y la frontera endometrial /miometrio se evaluaron para la presencia de TIL. El recuento intratumoral se realizó contando el TIL en 10 áreas diferentes recogidos al azar (1.170 m × 932 m) elegidos por un investigador independiente, la erradicación de ese modo el sesgo del observador.
WST1 ensayo
Para el WST1 ensayo de proliferación, IKPRA-1, IKPRB-1 y IKPRAB-36 líneas celulares se cultivaron en ausencia o presencia de MPA en una placa de 96 pocillos (Corning Costar, Cambridge, MA, EE.UU.). En el tiempo 0, las células se incubaron con reactivo de proliferación celular WST1 (Roche, Basilea, Suiza) durante 3 horas a 37 ° C y la absorbancia se midió con el lector de microplacas (BioRad, modelo 550, Hercules, CA, EE.UU.). Después de la medición de línea de base de las líneas de células se cultivaron en presencia y ausencia de 1 nM MPA durante 96 horas y a las 96 horas, se repitió el ensayo de WST1.
ensayos de migración
Para la curación de heridas ensayo, IKPRA-1, IKPRB-1 y IKPRAB-36 líneas de células se cultivaron en una placa de 6 pocillos (Corning Costar). Después de la inducción de la herida, las células se incubaron con 1 nM MPA durante 96 horas. La cicatrización de heridas se verificó cada 24 h por la fotografía, y se analiza mediante la medición de cierre de la herida.
Para el ensayo de Boydon modificado, las células fueron sembradas en el pocillo superior de una cámara de Boydon modificado (Transwell, 8 micras poros, 24 mm se inserta, 6 de la placa así, Corning Costar) a 2,5 × 10
5 células por pocillo en presencia o ausencia de 1 nM MPA. Además, como control, las células se cultivaron en una cámara de Boyden en presencia o ausencia de 1 nM MPA en combinación con 100 nM de la anti-progestagin Org31489 (Organon, Oss, Países Bajos). Después de 96 horas, las células que habían migrado a través del filtro en el pozo inferior o a la parte inferior de la pieza de inserción se tripsinizaron y se contaron bajo el microscopio.
Western blotting
IKPRA-1, IKPRB- 1, IKPRAB-36 y IKLV-8 líneas de células se cultivaron en ausencia o presencia de 1 nM MPA durante 96 horas y posteriormente se lisaron a 0 ° C en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) durante 5 minutos . A continuación, se rasparon las células, se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos y se retiró el sobrenadante. La concentración de proteína se calculó utilizando el kit de ensayo de proteínas (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) y de cada muestra de 4,5 g de proteína en 30 l tampón de lisis + BSA se cargó en un gel de SDS-PAGE al 10%. La transferencia Western se realizó de acuerdo a procedimientos estándar. El papel secante fue bloqueado durante 30 minutos a TA con tampón de bloqueo (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE, EE.UU.) y después se incubó durante la noche a 4 ° C utilizando anticuerpo policlonal de conejo anti-hFOXO1 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EE.UU.) en tampón de bloqueo (LI-COR Biotecnología). A continuación, la membrana de transferencia se incubó con el secundario de cabra anti-conejo IgG (IRDye 800CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology) durante 30 minutos a RT y se lavan. Como control de carga, la membrana se incubó durante 30 minutos con el anticuerpo anti-β-actina monoclonal (1:1000, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.), se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos con la cabra secundario anti-IgG de ratón (IRDye 680CW, 1:5000, LI-COR Biotechnology). Las bandas de proteínas específicas se detectaron utilizando el sistema de digitalización Odyssey (LI-COR Biotecnología).
ARN aislamiento, análisis de la expresión génica y en tiempo real RT-PCR cuantitativa
Muestras de tejido del paciente se seccionaron (5 micras, criostato) y cada 10
ª sección ¿estaba manchada y revisado por el patólogo (PCE) para evaluar la carga tumoral. Sólo las secciones que contienen & gt; 80% tumor se lisaron en Trizol (Invitrogen) y se trató con ultrasonidos durante 1 min. La línea celular que expresa Ishikawa PRA y PRB (IKPRAB-36) se cultivó durante 48 h en ausencia o presencia de 1 nM MPA (n = 3), se colocó en hielo y se lisaron en Trizol (Invitrogen).
la separación de fases se llevó a cabo con 0,2 ml de cloroformo y centrifugación durante 15 min. El sobrenadante se transfirió y se añadió isopropanol para la precipitación del ARN. El ARN precipitado se lavó con 75% de etanol. Todo el ARN se limpió con el kit de limpieza Rneasy MinElute (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Cantidad y calidad del ARN se evaluó mediante el uso de la Nanodrop (Nanodrop, Wilmington, DE, EE.UU.) y Bio-analizador (Aligent, Santa Clara, CA, EE.UU.).
ARN aislado de los pacientes y la línea celular de material fue etiquetada de acuerdo con los protocolos de etiquetado Affymetrix y se aplicó ARN marcado para todo el genoma arrays de expresión (Affymetrix GeneChips U133plus2 que contienen 54,614 conjuntos de la sonda, lo que representa aproximadamente 47.000 transcripciones (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.)). El uso de RMA (Robust Multi-array Análisis [31]), la normalización de los datos en bruto se realizó para ser capaz de producir las listas de genes y, finalmente, calcular genes regulados significativamente utilizando SAM (Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE.UU. [32]). Las listas de genes regulados SAM (1,25 veces o más;-valores delta se asemejan a p & lt; 0,05) fueron cargados en la vía Ingenio asistencia de software para evaluar la participación de diferentes vías biológicas (Ingenuity, Redwood City, CA, USA). Para las materias primas paciente listas de genes regulados (1,25 veces o más) se cargaron en Ingenio
Todos los datos de micromatrices es compatible con MIAME datos en bruto y se ha depositado en la base de datos MIAME compatible con GEO en la serie:. GSE29437 (que consiste en GSE29435: línea celular de datos, y GSE29436: datos del paciente)
Los genes para cuantitativa en tiempo real RT-PCR se identificaron por análisis de micromatrices y análisis de la vía.. El ARN se transcribió en ADNc con el uso de la de un ciclo kit de síntesis de ADNc de Affymetrix (Affymetrix). Para los genes identificados, los cebadores fueron ordenados y probados (una lista de cebadores se incluye en la Tabla S1). La limpieza de genes β-actina se utilizó como gen de referencia. RT-PCR se realizó y se analizaron utilizando el sistema CFX RT-PCR (Bio-Rad, Veenendaal, Países Bajos).
Estadísticas
Para los análisis estadísticos de los CD4 +, CD8 + y células FOXP3 + recuentos, modifican los datos de ensayo Boyden cámara, datos de ensayo WST1 y los datos de RT-PCR, se utilizó el programa SPSS 15.0 (IBM, Armonk, Nueva York, EE.UU.). Para los datos distribuidos normales una prueba t para datos asimétricos y se realizó una prueba U de Mann-Whitney para evaluar los valores de p. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Para calcular el valor de p de las vías reguladas, vía Ingenio ayudar software utiliza la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Características de los pacientes (Tabla 1)
Los pacientes con (n = 9) y sin (n = 9) se incluyeron cáncer endometrial progresiva. Todos los pacientes incluidos se sometieron abdominal- primaria total o histerectomía vaginal asistida por laparoscopia y salpingo-ooforectomía bilateral combinada con extirpación de ganglios linfáticos. Ninguna de las mujeres recibieron quimioterapia y sólo una mujer en el grupo de progresión de la enfermedad se le dio la radioterapia después de la cirugía. subtipos histopatológicos fueron endometrioide (n = 17) y endometrioide mixta /mucinoid (n = 1). grados del tumor eran 1 (n = 7), 2 (n = 4) y 3 (n = 7) y estadio de FIGO eran Ia (n = 11) y Ib (n = 7). En el grupo de progresión de la enfermedad en los 9 pacientes tuvieron uno o más episodios de recurrencia local y 4 pacientes desarrollaron una o múltiples metástasis a distancia. Las recurrencias fueron vaginales, pélvica o peritoneal (retro), y sitios de metástasis fueron los pulmones (n = 3), el hígado (n = 1), el bazo (n = 1) y el cerebro (n = 1). El seguimiento clínico hasta la fecha estaba disponible para todos los pacientes. En el grupo no progresivo 8 pacientes están actualmente libres de la enfermedad y 1 paciente falleció en el seguimiento. En el grupo de pacientes con enfermedad progresiva 3 están libres de la enfermedad y 6 pacientes murieron a causa de su enfermedad relacionada con el cáncer de endometrio. Características de los pacientes se detallan en la Tabla 1.
estado del receptor de progesterona y la detección de las células CD4 + T cooperadoras, citotóxicas CD8 + células T y + células T reguladoras FOXP3 en la enfermedad no progresiva y progresiva
La presencia de linfocitos infiltrantes de tumor se ha correlacionado con la supervivencia prolongada en el cáncer de endometrio [17], [18]. Además, la pérdida de expresión del receptor de progesterona (PR) en el cáncer de endometrio se ha encontrado que es un factor de riesgo para enfermedad progresiva [33]. Con el fin de corroborar la relación entre intacta la señalización PR y la presencia de linfocitos infiltrantes en la enfermedad no progresiva, tinción inmunohistoquímica y, cuando se realizaron, mediciones cuantitativas.
Como se ejemplifica en la figura. 1A, en la enfermedad progresiva tinción inmunohistoquímica para CD4 +, CD8 + y FOXP3 + linfocitos T parece reducido en comparación con la tinción en la enfermedad no progresiva. La cuantificación del número de células CD4 +, CD8 + y FOXP3 + T-linfocitos en la enfermedad progresiva de hecho confirmó un menor número de células positivas situadas en la frontera de endometrio-miometrio (fig. 1B, EM), en el borde del tumor (fig. 1B, Edge tumor) y dentro del tumor (Fig. 1B, intratumoral). Si los recuentos de células reducidas fueron significativamente diferentes entre los tejidos de cáncer de endometrio no progresivas y progresivas se indica en la figura (figura 1B).
A:. Visión general de la tinción inmunohistoquímica para CD4, CD8 y FOXP3 en endometrial primaria especímenes de cáncer en la enfermedad no progresiva (n = 9) en comparación con enfermedad progresiva (n = 9) (ampliación 0,4x, incrustaciones de 10x). espectáculos de enfermedades no progresivas pronunciadas tinción, mientras que espectáculos de patología progresiva reducen las manchas. La barra de escala representa 10 mm. B: Cuantificación de CD4, CD8 y el recuento de células FOXP3 en el borde del tumor (Edge tumor), en el tumor (intratumoral) y en la frontera endometrial-miometrial (frontera EM). * Indica un valor de p & lt; 0,05 (Mann-Whitney U-test). C y D: Representante no progresiva (C) y (D) tejidos del paciente progresistas se tiñeron para CD4, CD8 y PRA + PRB y muestran una correlación positiva entre la presencia de TIL y la expresión de PR. La ampliación es de 5x y la barra de escala representa 1 mm. Los pacientes fueron 6 y 11 ambos incluidos en el análisis de micromatrices. Además paciente 11 sólo tenía la enfermedad recurrente, mientras que el paciente 12 tenían enfermedad recurrente o metastásica.
Por otra parte, la revisión de secciones consecutivas en la enfermedad no progresiva para la expresión de los receptores de progesterona (PR) reveló que la presencia de las células CD4 + y CD8 + T-linfocitos se correlacionó positivamente con la presencia de manchas de PR (Fig. 1C y 1D).
análisis de la expresión de todo el genoma de tejido endometrial carcinoma primario
Para investigar si la correlación entre PR de señalización y la presencia de linfocitos infiltrantes tumorales podrían indicar una relación causal, un análisis de la expresión de ARNm de todo el genoma en muestras snap-congelados primarios de carcinoma de endometrio a partir de 4 pacientes sin y 4 pacientes con se realizó enfermedad progresiva. A nivel de genes individuales se observó que un número notable de quimioquinas y citoquinas son regulados diferencialmente entre la no-progresiva y progresiva de la enfermedad (Tabla S2). Por ejemplo, el quimiocinas CCL21 (-1.5x), CXCL9 (-2.9x), CXCL10 (-2.1x) y CXCL14 (tres conjuntos de datos actual: -33.0x; -20.5x; -6.4x, respectivamente) fueron todos abajo regulada en la enfermedad progresiva, mientras que las citoquinas IL8 (2.0x 5.7x;; 9.5x) y IL32 (1,9x) fueron reguladas en la progresión de la enfermedad (Tabla S2). la activación Por otra parte, el trabajo anterior de nuestro grupo ha indicado de señalización /β catenina Wnt en la progresión de la enfermedad [25] y de acuerdo con esto un número de Wnt /β-catenina genes inhibitory- y de destino se perdieron de una enfermedad progresiva (DKK1, y DKK4 WIF1) (Tabla S2).
Curiosamente, varios de los genes mencionados anteriormente, que se redujeron reguladas en la progresión de la enfermedad, han sido descritos en la literatura para ser hasta reguladas por la progesterona (CXCL14 [34], DKK1 [25], MMP7 [35] y SFRP4 [36]). Esto está de acuerdo con la conclusión de que la expresión de PR (al nivel de proteína y la expresión de mRNA (Fig. 1C y 1D y el cuadro S2) es el regulado en la enfermedad progresiva.
Tras la revisión de las vías reguladas entre la no-progresiva y progresiva la enfermedad, se encontró regulación de una serie de vías de señalización implicadas en la carcinogénesis y la enfermedad invasiva y que participan en la vigilancia inmunológica ser regulados de manera significativa: señalización de la integrina, mecanismos moleculares del cáncer, Antigen Presentación Camino, para no microcítico de pulmón de Señalización, IGF-1 de señalización, papel de factor tisular en cáncer, la extravasación de leucocitos de señalización, ERK /MAPK señalización, colorrectal metástasis del cáncer de señalización (que incluye catenina de señalización Wnt /β), FGF señalización, FAK señalización, etc (la lista completa de las vías reguladas y sus p-valores consecutivos se puede acceder desde el cuadro S3).
para un número de genes (CXCL14, DKK1, DKK4, PEG10 y WIF1) un tiempo real RT-PCR cuantitativa se realizó con el fin de verificar la regulación (Fig. 2).
CXCL14, DKK1, DKK4, WIF1 y PEG10 fueron seleccionados a partir de los resultados de microarreglos y verificados con el tiempo real de RT-PCR. La significación se calcula utilizando una prueba U de Mann-Whitney. Un valor de p de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
efecto de la progesterona sobre la migración de las líneas celulares de cáncer de endometrio Ishikawa
Con el fin de corroborar el posible papel de la progesterona en la regulación de la invasión, las líneas celulares de carcinoma endometrial Ishikawa transfectadas de forma estable con PRA, PRB, o PRA y PRB [30] fueron cultivadas en la presencia o ausencia de MPA durante períodos variables de tiempo y se utilizan en dos experimentos diferentes que miden la migración celular. Para comprobar la proliferación celular durante los diferentes experimentos se realizó un ensayo de proliferación WST1 que mostraron que dentro del plazo indicado no hay diferencias significativas en la proliferación podría ser detectado entre las células incubadas con o sin AMP.
En la Figura 3, diferente de células Ishikawa líneas se sometieron a un ensayo de cicatrización de heridas en la presencia o ausencia de MPA (1 nM) durante un máximo de 96 h. Se observó que, en los (IKPRAB-36) líneas de células Ishikawa de forma estable que expresa PRB (IKPRB-1) y PRA + PRB expresan, MPA inhibe el cierre de la herida infligida manualmente (Fig. 3A-D). Además, cuando teñidas el borde de la herida para la vimentina marcador mesenquimal, se observó que, en presencia de la expresión de vimentina MPA se redujo claramente (Fig. 3E). Al lado de este detalle en la expresión de vimentina, los niveles generales de vimentina se redujeron en líneas IKPRB-1 y IKPRAB-36 células se incubaron con 1 nM MPA. También se observó que en el (1-IKPRA) línea celular estable que expresa PRA Ishikawa, ni la curación de heridas, ni la expresión de vimentina se vio afectada por AMP (Fig. 3A y 3E).
IKPRA-1 (A), células IKPRB-1 (B) y IKPRAB-36 (C) se cultivaron en ausencia (balas blanco) o presencia (balas negras) de 1 nM MPA y se utiliza para un ensayo de cicatrización de heridas (n = 3) y el cierre de la herida se midió como un porcentaje de cierre total (100% significa que la herida está abierta, 0% significa que la herida se ha cerrado). D muestra imágenes representativas del proceso de cicatrización de heridas en rojo con la herida. E muestra SI para los núcleos (DAPI) y la expresión de vimentina en el frente invasivo de la herida infligida manualmente. En esta figura, la herida fue siempre situado en el lado derecho.
En la Figura 4, se utilizó otro enfoque para estudiar la capacidad migratoria de diferentes líneas de células de Ishikawa en la presencia o ausencia de progesterona. Se observó que para IKPRB-1, así como células IKPRAB-36, la migración en una cámara de Boyden modificada se inhibió en presencia de progesterona. Por otra parte, para la línea celular IKPRA-1 no se observó tal regulación diferencial de la migración bajo la influencia del MPA.
IKPRA-1, IKPRB-1 y IKPRAB-36 células se cultivaron en ausencia (puntos negros ) o presencia (puntos blancos) de 1 nM MPA en una cámara de Boyden modificada. Después de 96 horas, se contaron las células que habían migrado a través de los poros de la cavidad superior. La figura representa tres experimentos independientes realizados por triplicado. * Indica un valor de p & lt; 0,05 (Mann-Whitney U-test) guía empresas
análisis de la expresión de todo el genoma de Ishikawa línea celular de cáncer de endometrio
Para más documento de progesterona. inducida por la inhibición de la migración celular y para investigar la implicación de la señalización de la progesterona en la infiltración de linfocitos T, IKPRAB-36 células se cultivaron durante 48 h en presencia o ausencia de 1 nM MPA y se utiliza para el análisis de expresión de todo el genoma. Se observó que 1616 genes fueron significativamente reguladas por la progesterona en la línea celular IKPRAB-36 (1029 hasta reguladas, 587 el regulado, Tabla S4).
El uso de análisis de vías ingenio de los genes regulados significativamente, lo siguiente se observaron las vías de ser regulados por la progesterona (la lista completa de las vías reguladas y sus p-valores consecutivos se puede acceder desde el cuadro S5): IGF-1 de señalización, señalización neurregulina, señalización TNFR1, señalización P13K en los linfocitos B, VDR /RXR