Extracto
La vía de señalización /β-catenina desempeña un papel importante en la progresión del cáncer de colon.
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ha sido identificado como un modulador de la señalización de Wnt a través de su interacción con Dishevelled (Dvl), un mediador central de las vías tanto Wnt canónicos y no canónicos. Sin embargo, las funciones de
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en la vía de señalización Wnt /β-catenina siguen sin estar claros. A continuación, presentamos evidencia de que
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es un regulador positivo importante en el cáncer de colon a través de la regulación de la estabilidad y sububicación de β-catenina. Hemos demostrado que
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promueve la proliferación de células cancerosas
in vitro
y el crecimiento tumoral
in vivo
y mejora el potencial migratorio e invasivo de las células de cáncer de colon. Además, la mayor expresión de
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no sólo aumenta las fracciones nucleares y citoplasmáticas de β-catenina, sino que también aumenta su fracción asociada a la membrana. La sobreexpresión de
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conduce al aumento de la acumulación de no fosforilado β-catenina en el citoplasma y en particular en los núcleos. Hemos demostrado que
DACT1
interactúa con GSK-3β y β-catenina.
DACT1
estabiliza ß-catenina a través de
DACT1
inducidos por los efectos sobre la GSK-3β e interactúa directamente con las proteínas β-catenina. El nivel de fosforilados GSK-3β en Ser9 se incrementó significativamente después de la elevada expresión de
DACT1
.
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media la localización subcelular de β-catenina a través de aumentar el nivel de fosforilados GSK-3β en Ser9 para inhibir la actividad de GSK-3β. Tomados en conjunto, nuestros estudio identifica
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como un regulador positivo importante en el cáncer de colon y sugiere una posible estrategia terapéutica para el control de la vía de β-catenina que dependen
Visto:. Yuan G, Wang C, Ma C, Chen N, Tian Q, Zhang T, et al. (2012) Función oncogénico de
DACT1 Hoteles en cáncer de colon a través de la regulación de β-catenina. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10.1371 /journal.pone.0034004
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2011; Aceptado: February 21, 2012; Publicado: 21 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de China, No. 30770440. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
las mutaciones y la expresión desregulada de los componentes de la antigua vía de señalización de Wnt están vinculados a la oncogénesis en múltiples sistemas, y han sido particularmente implicado en la iniciación de cáncer de colon [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Más del 90% de los cánceres colorrectales se originan a partir de mutaciones activas en la vía de Wnt [1]. Se han descrito mutaciones en la poliposis adenomatosa coli (
APC
) de genes en los casos de poliposis adenomatosa familiar (PAF), y esta mutación se produce también en una alta proporción de los cánceres colorrectales esporádicos [9], [10].
APC
mutaciones representan un evento temprano en la tumorigénesis colorrectal [11].
β-catenina (símbolo oficial CTNB1) se considera que es un actor central de la vía de señalización de Wnt. Aunque la activación de Wnt puede ocurrir a través de mutaciones que afectan a los sitios de fosforilación dentro del exón 3 de β-catenina en una minoría de los tumores de colon [12], [13], muchos otros componentes de la vía de señalización Wnt contribuir al cáncer colorrectal a través de dysregulating la actividad o la localización de β-catenina [14], [15].
El gen
DACT1 gratis (Dapper1 /Dpr1), ubicado en el cromosoma 14q22.3, codifica una proteína de 836 amino ácidos con un putativo leucina cremallera (LZ) de dominio en el extremo amino-terminal y un PDZ consenso de unión (PDZ-B) con motivos en el extremo carboxi-terminal que permite la
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proteína para interactuar con el Dishevelled (Dvl) dominio PDZ [ ,,,0],dieciséis]. Los análisis bioinformáticos han revelado que
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ARNm se expresa en el amnios, cerebro fetal, ojo, corazón, médula adulta cerebro, cáncer gástrico (características de células en anillo de sello), RER + tumor de colon, leucemia linfoblástica aguda, tumor de células germinales , tumores condrosarcoma, y paratiroides [17]. Además, basándose en la conservación evolutiva y funcional de las moléculas de señalización Wnt, así como la localización cromosómica humana de DACT1, la
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gen es también prevé que ser un cáncer asociado a gen potente [17].
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se ha informado de que se downregulated en el carcinoma hepatocelular [18]. Un informe reciente ha identificado una correlación entre el
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expresión en el cáncer de pulmón y la mala grado histológico, tamaño grande del tumor, grado de invasión tumoral y la metástasis de los ganglios linfáticos [19]
.
Aunque algunos estudios han mostrado asociaciones entre
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expresión y el cáncer, la función de
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en la vía de señalización Wnt /β-catenina sigue siendo poco clara. Un posible mecanismo es que Dpr estabiliza GSK-3β y axina en el complejo APC, como se muestra por estudios de co-inmunoprecipitación [16]. Otra posibilidad es que Dpr compite con Fz para la unión al dominio PDZ de Dvl, bloqueando de este modo la transducción de señales a través de Dvl, y por lo tanto inhibe la estabilización mediada por Dvl de β-catenina [20]. Yau et al. informó de que Dpr1 humano se downregulated en el carcinoma hepatocelular, y esta regulación a la baja se correlaciona con la acumulación citoplásmica de β-catenina [18]. Sin embargo, en este informe, se ha encontrado que
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se sobreexpresa en el cáncer de colon, y que actúa para aumentar la proliferación celular, la migración y la invasión en líneas celulares de cáncer de colon. Hemos demostrado que
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interactúa con GSK-3β y β-catenina. Hemos demostrado además que
DACT1
estabiliza ß-catenina a través de
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inducidos por los efectos sobre la GSK-3β e interactúa directamente con β-catenina. También hemos demostrado
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inhibe la actividad de GSK-3β a través de aumentar el nivel de fosforilados GSK-3β en Ser9, lo que altera la localización subcelular de β-catenina. En particular, promueve los niveles de β-catenina en la membrana plasmática y en el núcleo.
Resultados
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se sobreexpresa en el carcinoma de colon humano
Para identificar la posible función de
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en el desarrollo y progresión del carcinoma de colon, hemos utilizado cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) para evaluar el nivel de la expresión génica. Se comparó la expresión en tejidos de cáncer de seis a los de seis pares de muestras de control normal de la mucosa del colon. Los resultados mostraron que el nivel de
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mRNA fue significativamente elevado en todas las seis muestras de cáncer de colon (Figura 1A). Los datos de expresión génica fueron confirmados por Western Blot, que se realizaron con el uso de lisados celulares solubles preparados a partir de especímenes quirúrgicos colectomía. Los resultados confirmaron que los altos niveles de proteína
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están presentes en el cáncer de colon (Figura 1B).
(A)
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niveles de ARNm se analizaron utilizando cuantitativa en tiempo real análisis RT-PCR. Las muestras de adenocarcinoma de colon (T, barras blancas) y la mucosa de apariencia normal de control (N, barras negras) se analizaron en seis casos de cáncer de colon. (B) Expresión de
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proteína en adenocarcinoma de colon humano (T) y normal de apariencia mucosa control (N) en seis casos, tal como se determina por análisis de inmunotransferencia Western. La expresión de GAPDH se utilizó como control de carga.
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aumenta la proliferación celular
in vitro
tumorigénesis de colon y
in vivo
Para entender la función de
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en el cáncer de colon, hemos explorado el efecto de ectópico
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expresión en el crecimiento celular in vitro en líneas celulares con diferentes niveles endógenos de
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expresión. Después de la transfección con un
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construcción de expresión de ADNc, las células SW480 de cáncer de colon, que expresan muy bajos niveles endógenos de
DACT1
, demostró un aumento significativo en la proliferación celular (Figura 2A). Por el contrario, la proliferación celular disminuye cuando endógena de
DACT1
expresión fue silenciada por transfección estable con vectores de siRNA dirigidos contra
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en el HCT116, líneas celulares de cáncer de colon HT29 y LoVo, que tienen niveles mucho más altos endógenos de
DACT1 gratis (Figura 2B-D). Para confirmar estos resultados, endógena de
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expresión fue silenciada por transfección estable con otros vectores de siRNA (
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siRNA1) que dirigen las distintas regiones del
DACT1 Hoteles en las células HCT116 y se observaron los mismos resultados (Figura S1 a-B)
(a) izquierda:. sobreexpresión de
DACT1 Hoteles en células SW480 transfectadas de forma estable. ensayo de crecimiento en la proliferación curva de
DACT1 células transfectadas
SW480 (media ± SEM, n = 3, * p & lt; 0,05 frente a las células transfectadas con el vector vacío): derecha. (B, C, D) A la izquierda:
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expresión de tipo salvaje, Control de siRNA-transfectadas, y
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HCT116 siRNA-transfectadas, las células LoVo y HT29. ensayos de crecimiento de la curva en
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HCT116 siRNA-transfectadas, LoVo y células HT29 (media ± SEM, n = 3, * p & lt; 0,05 frente a las células de tipo salvaje): derecho. (E) El volumen medio del tumor evaluó semanalmente después de la inyección de los animales con el control de siRNA o
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células HCT116 siRNA-transfectadas (media ± SEM, n = 3, * p & lt; 0,05). (F) imágenes representativas ocho semanas después de la inyección de células de cáncer de colon de ratón con siRNA control o
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células HCT116 siRNA-transfectadas.
Para examinar los efectos del silenciamiento de
DACT1
en el crecimiento del tumor de colon en vivo, las células HCT116 que expresan de manera estable un control de siRNA o
se utiliza DACT1
siRNA. Las células (5 × 10
6) se inyectaron en el tejido subcutáneo del ratón desnudo (n = 8 animales por grupo). Los tumores se midieron semanalmente con un calibre vernier y se calcularon los volúmenes de acuerdo con la siguiente fórmula: π /6 x longitud x anchura
2 [21]. Todos los animales inyectados con las células HCT116 que expresan los tumores desarrollados ARNsi de control a los 14 días después de la inyección, mientras que sólo el 75% (6/8) de la
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animales siRNA desarrolló tumores. Cincuenta y seis días después de la inyección, los tumores de los animales de control fueron significativamente más grandes siRNA (Figura 2F). El volumen medio del tumor fue de 2,068.78 ± 561,57 mm
3 en ratones inyectados con las células HCT116 que expresan ARNsi de control, en comparación con el volumen medio del tumor en ratones inyectados con las células HCT116 que expresa
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siRNA (503,46 ± 178,90 mm
3) (Figura 2E). Estos datos demuestran el importante papel de
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en la promoción del crecimiento de células de cáncer de colon.
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mejora la migración y la falta de anclaje de las células de cáncer de colon
proliferación independiente de anclaje es una característica de la transformación oncogénica y se considera que es propicio para la proliferación de células cancerosas fuera de su sitio original. Con este conocimiento, se analizó la capacidad de los
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para impulsar el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de colon mediante ensayos de formación de colonias en agar blando. La sobreexpresión de
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mejorado la proliferación independiente de anclaje de las células SW480 (Figura 3A). Regulación a la baja de
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reduce el potencial de anclaje independiente de HCT116, LoVo y células HT29 (Figura 3B-D y S1C). Por otra parte, se observó que
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sobreexpresión impulsarse el potencial migratorio de las células SW480 por transwell ensayos (Figura 3E e I). Por el contrario, se redujo el potencial migratorio de las células cuando endógena de
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expresión fue silenciada por transfección estable con vectores de siRNA dirigidos contra
DACT1 Hoteles en HCT116, LoVo y células HT29 (Figura 3F-I). A raíz de estos resultados, se concluye que
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aumenta la independencia de anclaje en las células de cáncer de colon y su potencial migratorio
.
(A) ensayo de agar blando en las células
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transfectadas SW480 después de 14 días de incubación. (B, C, D) ensayo de agar blando en HCT116 siRNA-transfectadas, las células LoVo y HT29 después de 14 días de incubación. (E) Se muestran imágenes representativas para la sobreexpresión de
DACT1 Hoteles en células SW480 transfectadas de forma estable. Las células se sembraron en una cámara transwell y se dejaron migrar a través de la cámara hacia el medio condicionado de células específicas de de 24 h. Las microfotografías de células que migran teñidas fueron tomadas bajo iluminación de campo claro (20 ×). (F, G, H) Se muestran imágenes representativas de
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HCT116 siRNA-transfectadas, células LoVo y HT29. Las células se sembraron en una cámara transwell y se dejaron migrar a través de la cámara hacia el medio condicionado de células específicas de de 24 h. Las microfotografías de células que migran teñidas fueron tomadas bajo iluminación de campo claro (20 ×). (I) La cuantificación de ensayo de migración. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. La migración se determinó contando las células en seis campos microscópicos al azar por pocillo (media ± SEM, * p & lt; 0,05 frente a las células del grupo de control).
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mejora la invasión de células de cáncer de colon
in vitro
o
in vivo
la característica más peligrosa de malignidad es el potencial invasivo y metastático de las células tumorales. Para probar si la invasión de células se vio afectada por
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, se investigaron los efectos de
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sobre la invasión celular a través de Matrigel. La sobreexpresión de
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mejorado la invasión de las células SW480 (Figura 4A y E). Regulación a la baja de
DACT1
reduce el potencial invasivo de HCT116, LoVo y células HT29 a través del Matrigel (Figura 4B-E). Para examinar los efectos de
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silenciamiento en la invasión de células de cáncer de colon in vivo, se infectaron células HCT116 que expresan un control de siRNA o
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siRNA. A continuación, se inyectaron 5 x 10
6 células en el tejido subcutáneo de cada ratón desnudo (n = 8 animales por grupo). Cincuenta y seis días más tarde, los tumores de seis de los ocho ratones desnudos control de siRNA-transfectadas habían invadido en la musculatura, mientras que sólo dos de los tumores en
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animales siRNA transfectadas habían invadido en la musculatura. Estos datos muestran además que
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afectó el potencial invasivo de las células de cáncer de colon in vitro e in vivo.
(A) Se muestran imágenes representativas para la sobreexpresión de
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transfectadas células SW480. Las células se sembraron en una cámara invasiva y se dejaron invadir la cámara hacia el medio condicionado de células específicas de de 24 h. Las microfotografías de células invasoras teñidas fueron tomadas bajo iluminación de campo claro (20 ×). (B, C, D) Imágenes representativas se muestran para
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HCT116 siRNA-transfectadas, LoVo y células HT29. Las células se sembraron en una cámara de invasión y se dejaron invadir la cámara hacia el medio condicionado de células específicas de de 24 h. Las microfotografías de las células invasoras teñidas fueron tomadas bajo iluminación de campo claro (20 ×). (E) Cuantificación de la ensayo de migración. Los resultados se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. La invasión se determinó contando las células en seis campos microscópicos al azar por pocillo (media ± SEM, * p & lt; 0,05 frente a las células del grupo de control) guía empresas
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regula el ciclo celular aunque en aumento. β-catenina niveles
Para dilucidar el mecanismo que causó aún más los resultados anteriores, hemos probado los niveles de proteína de la β-catenina y los genes diana de Wnt /β-catenina, ciclina D1 [8] y c-Myc [22]. Nuestro experimento mostró que la sobreexpresión de
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resultó en un aumento significativo en los niveles totales de β-catenina, ciclina D1 y c-Myc en células SW480 (Figura 5A). Por el contrario,
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siRNA, que medió en el silenciamiento de endógena de
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expresión, la disminución de los niveles totales de β-catenina, ciclina D1 y c-Myc niveles en HCT116, LoVo y células HT29 ( Figura 5B).
(A) transferencias de Western representativas de las células transfectadas con el vector y
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transfectadas SW480 vacías. La sobreexpresión de
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da como resultado la regulación por incremento de β-catenina y el factor de genes diana de células T (TCF), ciclina D1 y c-Myc. GAPDH se utilizó como control de carga. (B) Las transferencias Western representativos de HCT116 y LoVo y células HT29 que expresan ARNsi de control o
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siRNA. El silenciamiento de
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expresión en HCT116 y LoVo y células HT29 disminución de los niveles de β-catenina total de ciclina D1 y c-Myc. GAPDH se utilizó como control de carga. (C) El efecto de
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sobreexpresión en el perfil del ciclo celular de las células SW480. Tres días después de la privación de suero, las células se analizaron para su perfil del ciclo celular mediante FACS. El porcentaje de células en el G1, G2 y S fases se muestran. (D, E, F) El efecto de
DACT1
siRNA transfección en el perfil del ciclo celular de las células HCT116, LoVo y HT29. Tres días después de la privación de suero, las células se analizaron para su perfil del ciclo celular mediante FACS. El porcentaje de células en el G1, G2 fases se muestran y S.
Teniendo en cuenta que la ciclina D1 y c-Myc se relacionan con la regulación del ciclo celular, se analizó el efecto de
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sobreexpresión y el silenciamiento en la regulación del ciclo celular en células de cáncer de colon. En estos experimentos, todas las células se sincronizaron en las fases G0 /G1 por privación de suero. Cell ciclo de perfiles por FACS indicó que la sobreexpresión de
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en las células SW480 se asoció con un aumento en la proporción de células en las fases G0 /G1 (Figura 5C). Consistentemente, el silenciamiento de
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expresión con siRNA resultó en un aumento del número de células en el S + G2 /M fases en la HCT116, las líneas celulares LoVo y HT29 (Figura 5D-F). Estos resultados sugieren que el S + G2 /M acumulación de células después de
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silenciamiento está asociada específicamente con la pérdida de proteínas
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. En conjunto, estos resultados indican que
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promueve la proliferación de células de cáncer de colon, facilitando la transición de G1 a la fase S del ciclo celular.
Además de ciclina D1, CDK4 es otra clave factor que facilita la transición G1 /S. Hemos observado que la sobreexpresión de
DACT1
en las células SW480 aumento de la expresión de CDK4, mientras que los niveles de CDK4 se redujeron significativamente en HCT116, las células LoVo y HT29 que expresaban
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siRNA (Figura S2). En conjunto, estos resultados muestran claramente que
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estimula la proliferación celular y el crecimiento tumoral mediante la promoción de la entrada de las células en el ciclo celular a través de aumento de los niveles de β-catenina.
DACT 1
aumenta el potencial migratorio e invasivo de las células de cáncer de colon a través de cambiar la localización subcelular de β-catenina
Para revelar los medios por los cuales
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aumenta /expresión de genes regulados por TCF β-catenina, se observó la ubicación precisa de β-catenina bajo un microscopio de barrido láser confocal (LSCM) por inmunofluorescencia. Los resultados mostraron que la mayor expresión de
DACT1 no sólo
aumentó las fracciones nucleares y citoplasmáticas de β-catenina, pero también aumentó su fracción asociada a la membrana. El cambio en el nivel de la fracción asociada a la membrana β-catenina fue el hallazgo más significativo (Figura 6A-D y S1D)
(A) Las microfotografías de vector vacío y
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. - sobreexpresan las células SW480 inmunoteñidas con un anticuerpo anti-β-catenina (rojo). (B, C, D) Las microfotografías de control de siRNA y
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siRNA en HCT116, las células LoVo y HT29 immunostained con un anticuerpo anti-β-catenina (rojo). (E) Las transferencias representativas de los niveles de β-catenina en membrana (Mem), nuclear (Nuc), y las fracciones citoplásmica (cito) y los lisados totales (Lys) en las células SW480. La laminina B (expresión nuclear) y GAPDH (expresión citoplásmica) se utilizaron como los controles de carga. "+" Representa la sobreexpresión
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. "-" Es el vector vacío. (F) Las transferencias representativas de los niveles de β-catenina en membrana (Mem), nuclear (Nuc), y las fracciones citoplásmica (cito) y los lisados totales (Lys) en las células HCT116. La laminina B (expresión nuclear) y GAPDH (expresión citoplásmica) se utilizaron como los controles de carga. "+" Representa el control de siRNA. "-". Es
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siRNA
Para confirmar estos resultados interesantes, los extractos de Control /
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-overexpressing células SW480 y de control /
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células HCT116 -silenced fueron separados en la membrana, citoplasma, y las fracciones nucleares. Entonces, la abundancia relativa de β-catenina en estas fracciones se analizó mediante transferencia Western (Figura 6E y F). Los informes anteriores han demostrado un papel importante para β-catenina en la adhesión celular como parte de un complejo de proteínas que incluye la E-cadherina [23]. El patrón de expresión de E-cadherina en las células de cáncer de colon no fue modificado por
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silenciamiento o sobreexpresión (Figura S3). Estos datos sugieren que el aumento de los niveles de
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afectan los niveles de β-catenina y β-catenina de transcripción /TCF-dependiente de la activación de la vía de señalización Wnt. También sugieren la posibilidad de que
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aumenta el potencial migratorio e invasivo de las células de cáncer de colon a través de la estabilización de β-catenina mediada por la unión de los adherentes.
Correlación entre los
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y la expresión de β-catenina asociada a la membrana
e in vitro
in vivo
a partir de los resultados de los experimentos anteriores, se encontró que los
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WAS altamente expresado en cánceres de colon humano y que promueve el potencial de crecimiento celular, la migración y la invasión de células de cáncer de colon a través de sus efectos sobre la señalización de β-catenina. Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que
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y los niveles de expresión de membrana asociada a β-catenina se correlacionaron positivamente en líneas celulares de cáncer de colon y cánceres primarios de colon. Como se muestra en la Figura 7A y B, los niveles de
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y β-catenina en líneas celulares de cáncer de colon se correlacionaron. Se observó a los más altos niveles de β-catenina en la membrana celular en las células HCT116 con altos niveles de endógena de
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. Los niveles intermedios de β-catenina en la membrana celular y
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proteínas se encuentran en las células HT29. Tanto asociada a la membrana β-catenina y
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se expresaron en forma mínima en las células SW480.
(A) semicuantitativo RT-PCR análisis de
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expresión en HCT116, HT29 y células SW480. GAPDH se utilizó como control. (B) Análisis de inmunofluorescencia de
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y expresión β-catenina en las células HT29, HCT116 y SW480. Aumento original, 40 aumentos. (C, D) HE tinción de muestras de mucosa de colon humano normal (N) y los tejidos adenocarcinoma (T) por un anticuerpo anti-β-catenina. Aumento original, 40 aumentos. (E, F) de inmunofluorescencia (IF) de tinción de muestras de mucosa de colon humano normal (N) y los tejidos adenocarcinoma (T) por un anticuerpo anti-β-catenina. Aumento original, 40 aumentos. (G, H) de inmunohistoquímica (IHC) tinción de muestras de mucosa de colon humano normal (N) y los tejidos adenocarcinoma (T) por un anticuerpo anti-β-catenina. Aumento original, 40 aumentos.
Para estudiar la relación entre los
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y expresión β-catenina asociada a la membrana en el cáncer de colon aún más, los análisis de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia se realizaron de β-catenina en tejidos normales y de adenocarcinoma de colon humano (los seis casos mencionados anteriormente). Se observó tinción focal de membrana asociada a β-catenina en los seis tumores (100%; la Figura 7C-H). Estos resultados se correlacionan bien con los resultados anteriores con respecto a la ß-catenina expresión en líneas celulares de cáncer de colon. Estos resultados confirman que los niveles elevados de membrana asociada a β-catenina pueden depender de la elevada expresión de
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.
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interactúa con β-catenina y los componentes la destrucción del complejo β-catenina para estabilizar β-catenina
estábamos interesados en aclarar el mecanismo por el que niveles elevados de
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dio lugar a una mayor expresión β-catenina. En ausencia de ligandos Wnt, los niveles citoplasmáticos de β-catenina se regulan por el complejo de destrucción que contiene axina, APC, y la glucógeno sintasa quinasa-3β (GSK-3β), donde β-catenina es fosforilada por GSK-3β en la serina múltiple y treonina en su extremo N-terminal. Fosforilados β-catenina es entonces ubiquitinated, lo que lleva a su rápida degradación proteasomal [4], [24], [25], [26], [27], [28]. Para determinar si
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aumenta los niveles de β-catenina, influyendo en la estabilidad de β-catenina, las células HCT116 (con o sin
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silenciamiento) se incubaron con 10 mg /ml de cicloheximida (CHX) para evitar la síntesis de nuevos β-catenina. Luego, los niveles de β-catenina se midieron mediante inmunotransferencia de tipo Western para reflejar el tipo de β-catenina degradación de proteínas. El silenciamiento de
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expresión aumentó significativamente la tasa de degradación β-catenina, que resulta en una evidente reducción de los niveles de permanecer β-catenina (Figura 8A). Este efecto de
DACT1
en la estabilidad de β-catenina se confirmó mediante un ensayo de inmunofluorescencia. Se encontró que el β-catenina se degrada más rápidamente en las células HCT116 que expresan
DACT1
siRNA que en las células HCT116 que expresan el control
DACT1
siRNA (Figura 8B).
(A se llevaron a cabo ensayos de Western blot) en las células HCT116 para determinar la estabilidad de β-catenina. Se llevaron a cabo (B) los ensayos de inmunofluorescencia en células HCT116 para determinar la estabilidad de β-catenina. (C) Cell lisados de células SW480 transfectadas con GFP-
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se sometieron a inmunoprecipitación (IP) con anticuerpos anti-axina, anti-GSK-3ß, o anti-β-catenina. Los inmunocomplejos se resolvieron por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de Western blot con un anticuerpo anti-GFP. Blotting con un anticuerpo anti-GAPDH mostraron igualdad de la carga. (D) subcelular co-localización de endógena de
DACT1 Opiniones y β-catenina,
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y GSK-3β en las células HT29. (E) Los lisados celulares de células HT29 se sometieron a inmunoprecipitación (IP) con un anti-
DACT1
anticuerpo. Los inmunocomplejos se resolvieron por SDS-PAGE y se sometieron a análisis Western blot con anti-GSK-3β, o anticuerpos anti-β-catenina. Blot con un anticuerpo anti-GAPDH mostraron la igualdad de carga.
Para determinar el mecanismo por el cual
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influencias β-catenina estabilidad, hemos examinado si o no
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interactúa con los componentes del complejo multiproteico que regula la estabilidad de β-catenina. Nuestro análisis de co-inmunoprecipitación reveló colocalización de
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y GSK-3β,
DACT1 Opiniones y axina en las células SW480 transfectadas de forma estable con un GFP-etiquetados
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construir (Figura 8C ). Por otra parte,
DACT1
hizo interactuar con β-catenina en las células SW480 que sobreexpresa
DACT1 gratis (Figura 8C). A continuación, examinó la colocalización de
DACT1
con GSK-3β, y
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con β-catenina en las células HT29 tipo salvaje (sin APC o β-catenina mutaciones) (Figura 8D-E) . Estos resultados consistentes indican que
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interfiere con la fosforilación de GSK-3β-dependiente de la β-catenina por el complejo de la destrucción, y
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afecta a la estabilidad de β-catenina mediante la interacción con β-catenina.
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afecta al subcelular localizada β-catenina a través de la inhibición de la actividad de GSK-3β
β-catenina se sabe que se acumulan en el núcleo [29] y sus niveles están especularon aumentando al lamelipodia membrana, la membrana uniones adherentes y ondulaciones de la membrana [30], [31] en respuesta a la señalización de Wnt o la inhibición mediada por el fármaco de la actividad de GSK-3β. Por otra parte, sobre la base de nuestros resultados, especuló que
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inhibe la GSK-3β. Algunos de los factores que inhiben la GSK-3β a través de la fosforilación de Ser9 se ha informado [32], [33]. Hemos observado los niveles de expresión de proteínas de GSK-3β con Ser9 fosforilada en células HCT116 (con o sin
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silenciamiento). Los resultados mostraron que los niveles de fosforilados GSK-3β en Ser9 se incrementaron significativamente en las células HCT116 que expresan ARNsi de control (Figura 9A y B). Para confirmar que
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regulado el patrón de localización de β-catenina a través de la inhibición de la GSK-3β, probamos el efecto de la inhibición de la GSK-3β en las células HCT116 que expresa bien el ARNsi de control o el
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siRNA. Se ha observado una mejora clara y significativa en las células que muestran la tinción de β-catenina asociada a la membrana después de que se trataron con LIC1 40 mM durante 1 h (Figura 9C y D). Además, la prueba de la expresión de β-catenina se activa en las células SW480. Los resultados revelaron la mayor acumulación de no fosforilado β-catenina en el citoplasma y en particular en los núcleos de las células SW480 que sobreexpresa
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(Figura 9E y F). Todos estos resultados apoyan la conclusión de que
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afecta a la localización subcelular de β-catenina a través de la inhibición de la actividad de GSK-3β.
(A) Las microfotografías de control de siRNA y
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siRNA que expresan las células HCT116 immunostained con un anticuerpo anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) anticuerpo (rojo). El silenciamiento de
DACT1 Hoteles en células HCT116 disminuye los niveles de fosfato GSK-3β (Ser9). (B) Las transferencias Western representativos de células HCT116 que expresan ARNsi de control y
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siRNA. El silenciamiento de
DACT1 Hoteles en células HCT116 disminuye los niveles de fosfato GSK-3β (Ser9). GAPDH se utilizó como control de carga. (C) células HCT116 que expresan ARNsi de control y
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siRNA fueron tratados durante 1 h con fármacos inhibidores de GSK-3ß (LiCl 40 mM). Las células se tiñeron y se analizaron mediante microscopía para detectar la expresión de β-catenina. LiCl tratamiento de las células HCT116 aumenta los niveles de β-catenina en la membrana plasmática. (D) Las transferencias Western representativos de células HCT116 tratados con LiCl, que expresan bien el control de siRNA o
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siRNA. LiCl tratamiento de las células HCT116 aumenta los niveles de β-catenina en la membrana plasmática. KDEL se utilizó como control de carga. 1: las células HCT116 que expresan ARNsi de control que habían sido tratados con LiCl 40 mM durante 1 h. 2: las células HCT116 que expresan ARNsi de control que no habían sido tratados con LiCl. 3: células HCT116 que expresan
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siRNA que fueron tratados por LiCl 40 mM durante 1 h; 4: células HCT116 que expresan
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siRNA que no habían sido tratados con LiCl. (E) Las microfotografías de control de siRNA y
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siRNA que expresan las células HCT116 immunostained con un anticuerpo anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) anticuerpo (rojo). El silenciamiento de
DACT1 Hoteles en células HCT116 disminuye los niveles de fosfato GSK-3β (Ser9). (F) Las transferencias Western representativos de células HCT116 que expresan ARNsi de control y
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siRNA. El silenciamiento de
DACT1 Hoteles en células HCT116 disminuye los niveles de fosfato GSK-3β (Ser9). GAPDH se utilizó como control de carga.
Discusión
El aumento de expresión de
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ha oncogénico funciones en el cáncer de colon
Nuestros estudios han demostrado que
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se sobreexpresa en los adenocarcinomas de colon humano. Este resultado es consistente con la observación anterior de que
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se reguló en los tumores de mama invasivo [34].