Extracto
En los cánceres humanos, la metilación del elemento nuclear a largo intercalados -1 retrotransposones (L1 LINE-1) o se reduce. Esto ocurre en el contexto de la hipometilación todo el genoma, y aunque es común, su papel es poco conocida. L1s están ampliamente distribuidos tanto dentro como fuera de los genes, y intragenic intergénica, respectivamente. Curiosamente, la inserción de secuencias de L1 de longitud completa activos en intrones de genes de acogida interrumpe la expresión génica. A continuación, se evaluó si intragenic hipometilación L1 influye en su expresión génica en el cáncer de acogida. En primer lugar, se extrajeron los datos de L1base (http://l1base.molgen.mpg.de), una base de datos que contiene las inserciones L1 supuestamente activos, y los personajes L1 intragenic y intergénicas comparación. Se encontró que las secuencias L1 intragenic se han conservado a través del tiempo evolutivo con respecto a la actividad transcripcional y sitios dinucleótido CpG de metilación del ADN de mamíferos. A continuación, se compararon regulados los niveles de ARNm de células a partir de dos experimentos diferentes disponibles de Gene Expression Omnibus (GEO), un repositorio de base de datos de alto rendimiento de datos de expresión génica, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) por chi-cuadrado. El odds ratio de reguladas por los genes entre el epitelio bronquial y cáncer de pulmón normales desmetilado fue alta (p & lt; 1E
-27; OR = 3,14; IC del 95% = 2,54-3,88), lo que sugiere genoma del cáncer amplia hipometilación de genes abajo de la regulación expresión. Análisis exhaustivo entre las localizaciones L1 y la expresión génica mostraron que la expresión de los genes que contienen L1 tuvo una probabilidad significativamente mayor de ser reprimidos en el cáncer y hypomethylated células normales. Por el contrario, muchos mRNAs derivados de genes que contienen L1 se encuentra elevado en Argonaute 2 (AGO2 o EIF2C2) -agotadas células. aumentar los niveles hypomethylated L1 L1 ARNm. Finalmente, se encontró que los objetivos AGO2 intrónica L1 pre-mRNA complejos y reprime los genes del cáncer. Estos resultados representan uno de los mecanismos de genoma del cáncer amplia hipometilación la expresión génica que altera. Hypomethylated intragenic L1 son un siRNA nuclear mediada por
cis-regulador
elemento que puede reprimir genes. Esta regulación epigenética de retrotransposones que probablemente influye en muchos aspectos de la biología genómica
Visto:. Aporntewan C, C Phokaew, Piriyapongsa J, Ngamphiw C, C Ittiwut, Tongsima S, et al. (2011) Hipometilación de Intragenic LINE-1 reprime la transcripción en células de cáncer a través AGO2. PLoS ONE 6 (3): e17934. doi: 10.1371 /journal.pone.0017934
Editor: Esteban Ballestar, Bellvitge Instituto de Investigación Biomédica (IDIBELL), España |
Recibido: 14 Septiembre, 2010; Aceptado: February 18, 2011; Publicado: 15 Marzo 2011
Derechos de Autor © 2011 Aporntewan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio está apoyado en parte por el Fondo Tailandia Investigación (TRF), el Centro Nacional de Ingeniería genética y Biotecnología (BIOTEC), la Agencia Nacional de Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología (NSTDA), Four Seasons hotel Bangkok y la Cruz Roja de Tailandia Sociedad cuarto cuidado del cáncer de la Caridad y la Universidad de Chulalongkorn. Chureerat Phokaew es apoyado por un Ph.D. Royal Golden Jubilee subvención (PHD /0190/2550), Embajada de Francia en Tailandia y la Universidad de Chulalongkorn. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en el cáncer, la metilación del ADN en el resto del genoma, especialmente en un retrotransposón nuclear a largo intercaladas elemento-1 (LINE-1 o L1), generalmente se agotan y este evento se produce en el contexto del genoma de ancho o hipometilación global de [1], [2], [3]. hipometilación global puede desempeñar varias funciones en la carcinogénesis de múltiples etapas. efecto más comúnmente reconocido es el de facilitar la inestabilidad cromosómica [4], probablemente mediado por la replicación del genoma hypomethylated asociado error de rotura del DNA de doble cadena independiente de reparación propensa [5], [6]. Recientemente, hay un informe que la hipometilación de un L1 activa promotor alternativa de MET oncogén [7]. Sin embargo, el papel de la metilación global de L1, en la expresión de genes del genoma de ancho, se estudió con menos frecuencia y por lo tanto no está bien caracterizado.
metilación del ADN es una característica fundamental molecular del genoma humano, y la alteración de esta regulación epigenética se asocia con cánceres de [2]. Los efectos de la metilación del promotor en la configuración de la cromatina y la transcripción de genes han sido bien documentados [8]. Por el contrario, los mecanismos, cómo la metilación del ADN dentro de un gen (gen cuerpo metilación) controla la expresión génica, son menos conocidos. cambios de metilación del gen cuerpo pueden tener varias consecuencias. secuencias metiladas únicos en intrones se encuentran frecuentemente en genes altamente expresados [9]. Por el contrario, la formación de heterocromatina por una densa metilación del ADN intragenic limita la eficiencia de la ARN polimerasa [10]. Sin embargo, estas evidencias implican que la metilación de secuencias repetitivas intragenic, incluyendo L1s, también puede ser importante para el mantenimiento de la función normal de loci genómico ligado.
L1s también se distribuyen ampliamente en el genoma [11]. inserción L1 tiene varias consecuencias funcionales potenciales [12]. Es notable que L1 no se distribuyen uniformemente [11] y muchos están excluidos de ciertas regiones del genoma que contienen los genes de limpieza [13]. A ingeniería genética en el estudio in vitro demostró que la inserción de secuencias de L1 activos en intrones de genes de acogida altera la expresión del gen [14]. A lo largo de la evolución, retrotransposition eventos producidos & gt; 500.000 copias de L1 en el genoma humano [15]. Sin embargo, no todos son L1 longitud completa y activa; la mayoría son truncados. Hay 80-100 L1 retrotransposition competente en el genoma humano, pero sólo se cree que seis de ellos a ser la base de todos los acontecimientos históricos retrotransposition [16]. Más de 10.000 L1s son más largos de 4,5 kb y contienen un 'UTR, dos marcos de lectura abierta y una 3' UTR 5 que cuenta con una señal de poliadenilación [17]. Más de 2.000 de estos L1 son intragenic, y que residen dentro de más de 1.000 genes.
Recientemente, se evaluaron los patrones de metilación de los 5 'UTR de secuencias L1 [1], [18] y se encontró que la metilación niveles varían en cada locus y en diferentes tipos de células en células de tipo salvaje. En cánceres humanos, la metilación de retrotransposones L1 se reduce de forma variable [1], [18], [19]. La pérdida de genoma amplio metilación L1 en las células cancerosas se produce como un proceso generalizado. Sin embargo, L1 metilación está influenciada por su ubicación en el genoma [18]. Por ejemplo, L1s en diferentes intrones de los mismos genes están generalmente modificado de una manera similar [18]. L1 hipometilación se correlaciona con ciertos fenotipos celulares. En el cáncer, L1 hipometilación se asocia directamente con carcinogénesis de múltiples cánceres agresivos y con peor pronóstico [1], [20], [21], [22], [23], [24]. Por otra parte, en las células normales de metilación de L1 puede ser alterado en asociación con ciertos fenotipos celulares, tales como de riesgo alto de cáncer, la diferenciación del tejido y la dieta [25], [26], [27], [28], [29], [30] , [31], [32], [33]. Curiosamente, intercalar patrones repetitivos hipometilación secuencia (IRS) son diferentes en las células con diferentes fenotipos. Por ejemplo, Alu hipometilación se encuentra comúnmente en las células del envejecimiento, pero no es L1 hipometilación [34]. Estas líneas de evidencia nos llevan a la hipótesis de que miles de genes pueden ser reguladas por intragenic hipometilación L1 en células cancerosas.
A continuación, se extrajeron los datos de L1base (http://l1base.molgen.mpg.de) [ ,,,0],17], una base de datos que contiene las inserciones L1 supuestamente activos, para comparar caracteres L1 intragenic y intergénicas. A continuación, se compararon los niveles de mRNA de las células normales hypomethylated y bibliotecas de expresión serie de cáncer, disponible de Gene Expression Omnibus (GEO), un repositorio de base de datos de alto rendimiento de datos de expresión génica, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gEO) [35], [36]. Por último, el análisis exhaustivo entre las localizaciones L1 y la expresión de genes del genoma de ancho se realizaron para evaluar los mecanismos de regulación de genes de L1 intragenic en el cáncer.
Resultados
Intragenic y L1 secuencias intergénicas muestran características estructurales distintas
Las variantes de secuencia de cada uno de largo L1 se clasifican según su período evolutivo y la actividad retrotransposition [17]. Aquí, analizamos si L1s se distinguen dependiendo de ubicaciones si las secuencias son dentro de los genes, intragenic, o entre genes, intergénicas (Fig. 1A). Varias características, descritas en L1base [17] incluyendo la localización cromosómica, subfamilia, la secuencia y las islas CpG, de 9.355 intergénica L1 y 2.546 intragenic L1 se encuentra en 1.454 genes fueron evaluados por 218 pruebas de chi-cuadrado y 18 pruebas t (cuadro justificante S1 y S2). Ejemplos de una prueba de chi-cuadrado y un t-test se demostraron (fig. 1B y 1C). El análisis estadístico reveló que hay numerosas características estructurales de intragenic L1s que son distintos de L1s intergénicas (Fig. 1 y el cuadro justificante S2). 100 pruebas de chi-cuadrado analizaron las variaciones de las secuencias que determinan la L1 y la actividad transcripcional retrotranspositional y la presencia de islas CpG y 57 de las pruebas eran significativamente diferentes a los valores de p & lt; 0,001 (Fig. 1D y apoyando el cuadro S2). Estas pruebas mostraron que las de prevalencia de secuencias conservadas de L1 intragenic fueron siempre mayores que L1 intergénicas mientras que todas las secuencias mutadas fueron más comunes en L1 intergénicas (Fig. 1D y el cuadro justificante S2). Además, se observaron las islas CpG más frecuentes en intragenic L1 (Fig. 1D y Apoyando el cuadro S2). Este hallazgo fue apoyado por medio de la comparación de 18 características de t-test (Fig. 1C, 1E y Apoyando el cuadro S2). Intergénica L1 contiene más nucleótidos A y T, el marco de lectura, las lagunas y los codones de parada. Por el contrario, L1 intragenic contienen mayores contenidos G-C y la puntuación de integridad (Fig. 1E y el apoyo a la Tabla S2). En conclusión, las secuencias L1 intragenic se han conservado a través del tiempo evolutivo con respecto a la actividad transcripcional y sitios dinucleótido CpG de metilación del ADN de mamíferos. Estos hallazgos implican funciones fisiológicas de metilación L1 intragenic.
A) L1s se dividieron en dos clases, L1s intragenic y intergénicas que están representados por flechas azules y rojas, respectivamente. B) Se analizaron las diferencias en las características estructurales entre los grupos L1 mediante la prueba de chi-cuadrado, para las características categóricas y C) homoscedastic
t-test para
características no categóricos. D) 100 p-valores de chi-cuadrado pruebas de tres clases de L1 a las secuencias, las secuencias conservadas, las secuencias mutadas y la presencia de islas CpG, que se encuentran sobre representados o insuficientemente representados en L1 intragenic fueron exhibidos, intragenic L1 & gt; intergénica L1 y intergénica L1 & gt; L1 intragenic, respectivamente. E) 18 valores de p de pruebas t de caracteres L1 que están excesivamente representados e insuficientemente representados en L1 intragenic se muestra en azul, intra & gt; entre otras, y de color rojo, entre & gt; intra, respectivamente
Intragenic. L1 reprimir genes en células de cáncer de
L1 se hypomethylated en muchos tipos de cáncer [1]. Para investigar si los genes del hospedador intragenic L1s en el control L1 hypomethylated células cancerosas, se comparó la expresión de genes en el cáncer entre los genes que poseen intragenic L1 y el resto. Los genes que poseen L1 fueron determinados por L1base [17] y los datos de microarrays de expresión son datos a disposición del público desde el GEO [35], [36]. Cada gen se clasificó por 2 pruebas t de Student, arriba y abajo de las regulaciones. Si la media del grupo de cáncer fue estadísticamente mayor o menor que el grupo normal, el gen se clasificó como positiva o negativamente regulados, respectivamente. Si la prueba t no fue estadísticamente significativa, el gen se clasificó como no hacia arriba o hacia abajo no reguladas, respectivamente. La distribución de genes que poseen L1s que mostraron aumento de la expresión en el cáncer se comparó con el resto del conjunto de genes por medio de pruebas de chi-cuadrado (Fig. 2A). El mismo análisis se realizó para los genes con expresión disminuida en cáncer (Fig. 2B). Figura 2A y 2B demuestran ejemplos de pruebas de chi-cuadrado de la expresión génica en el cáncer gástrico. No se han encontrado genes que poseen L1 intragenic menos propensos a ser de hasta reguladas (odds ratio (OR) = 0,61, p = 3.04E-06) (Fig. 2A). Además, la expresión de genes que contienen L1s eran más comúnmente disminuyó (OR = 1,64, p = 2.66E-13) (Fig. 2B). Intragenic L1 puede controlar cientos de genes. Entre 1.340 genes que contienen L1, 1.242 genes no son regulados y 304 genes se redujeron reguladas (Fig. 2A y 2B). El análisis de un número de matrices de expresión mostró resultados similares. Hemos probado carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas, células de cáncer cervical, células adrenocarcinoma de pulmón, cáncer de hígado, células de cáncer de mama, cáncer de mama ductal y lobular, vejiga situ carcinoma, cáncer gástrico inestable de microsatélites, la metástasis del cáncer de próstata. Hemos encontrado que los genes regulados hacia abajo en las células cervicales cáncer, células adrenocarcinoma pulmón, células de cáncer de mama, cáncer de mama ductal y lobular, vejiga situ carcinoma, cáncer gástrico inestable microsatélites son más propensas a contener L1s. Por otra parte, los genes con altos niveles de expresión en carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas, las células de cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, células de cáncer de mama, de vejiga carcinoma in situ, cáncer gástrico inestable microsatélites, la metástasis del cáncer de próstata son menos propensos a poseer L1 (cuadro justificante S3 y figura . 2C). Por lo tanto, L1 intragenic puede reprimir genes del huésped en estos tipos de cáncer. Aunque la inserción in vitro de secuencias de L1 activos en intrones de genes de acogida interrumpe la expresión de genes [14], la mayoría de los niveles de mRNA de los genes que contienen L1 no estaban ausentes (Apoyando la Fig. S1). Por otra parte, una comparación de los genes en el cáncer, como se describe en el apoyo tabla S3.1-S3.9, mostró que la probabilidad de que contengan genes L1 ser comúnmente regulados hacia abajo en experimentos independientes es mayor que genes sin L1 (valor de p = 7.99E-08, media L1 = 1,6642, significa que no hay L1 = 1,4861) (Apoyo a la Fig. S2). Estos análisis apoyan importancia biológica de intragenic L1 en la regulación de genes en el cáncer.
A) y B) son chi-cuadrado 2 × 2 tablas, los valores de p y odds ratios, proporciones que compararon los genes de cáncer gástrico que poseen entre un máximo L1 - ( "Up") o hacia abajo ( "abajo") y no reguladas por incremento o no reguladas por los grupos, respectivamente. C) Los porcentajes de L1 que contiene ARNm que están arriba o hacia abajo-regulada en varios tipos de cáncer. D) mRNA EphA3 y IVS15 niveles de metilación en las células WSU-HN-L1-EphA3 IVS5 y y tratados-dC Aza WSU-HN17s. E) Dos chi-cuadrado de 2 × 2 tablas, los valores de p y odds ratios, la comparación de proporciones de HBECs-tratadas-dC Aza o hMSC que poseen los genes L1 entre las reguladas ( "abajo") y los grupos que no están reguladas abajo, respectivamente. F)% de los ARNm de los genes que contienen L1s en HBECs y hMSCs-tratadas-dC Aza. "Arriba" y "abajo" indican un aumento y disminución de la expresión, respectivamente. registros de IGE, muestras GSM y tipo de
t-test
y 2 × 2 tablas de chi-cuadrado pruebas se proporcionan en el cuadro justificante S3.
Para demostrar el patrón de relación entre L1 los niveles de metilación y la expresión génica, que mide los niveles de metilación intragenic L1 y nivel de ARNm del gen huésped. Anteriormente, se evaluaron los niveles de metilación de 17 intragenic loci L1 y encontraron que los niveles de metilación L1 de L1-EphA3-IVS5 y L1-EphA3-IVS15 están fuertemente correlacionados en las células cancerosas, lo que sugiere locus mecanismo específico [18]. La medición de los niveles de intragenic metilación L1-EphA3 mRNA y EphA3 en cáncer de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) líneas celulares (WSU-HNS) reveló que los niveles más bajos de intragenic L1-EphA3-IVS5 y L1-EphA3-IVS15 metilación correlacionados con EphA3 menor los niveles de mRNA (Pearson r = 0,7961 y 0,7638, respectivamente; Fig. 2D). EphA3 mRNA en células WSU-HN17 también fue significativamente menor cuando L1-EphA3 se hypomethylated (emparejado
t-test
; p & lt; 0,001; Fig. 2D). Por lo tanto, el nivel de mRNA puede estar directamente correlacionada con la metilación L1 intragenic.
Pérdida de metilación en células normales reprime genes que albergan L1s
Un análisis de la expresión génica en las células epiteliales bronquiales humanas (HBECs ) y las células madre mesenquimales humanas (hMSC) después del genoma amplia desmetilación por 5-aza-2'- desoxicitidina (aza-dC) de tratamiento demostró una mayor prevalencia de intragenic en L1 reguladas por los genes (OR = 1,52, p = 0,0017 y OR = 1,62, p = 0,0069, respectivamente) (Fig. 2E, 2F y cuadro justificante S3), de manera interesante, un patrón similar al encontrado en el cáncer (Fig. 2C). Además, exploramos si genoma amplia hipometilación regula los genes en el cáncer. Se realizó una prueba de chi-cuadrado para determinar la importancia de solapamiento entre reguladas por los genes en HBECs desmetilado y en el cáncer de pulmón. Genes que se redujeron reguladas en el tratamiento aza-DC en HBECs se encontró que tenían preferentemente menores niveles de mRNA en las células cancerosas del pulmón (p = 2.67E-28; OR = 3,14; IC del 95% = 2,54 a 3,88; Figura 3A y 3B y Apoyando Tabla S4). Esto apoya la hipótesis de que la hipometilación abajo regula los genes en el cáncer.
A) 2 × 2 tablas, los valores de p y odds ratios y B) odds ratio para los ARNm que están insuficientemente expresada ( "Down") en el cáncer de pulmón y Aza-dC-células tratadas HBEC en comparación con células tratadas con no-Aza-dC HBEC para (a y B) todos los genes, (B) los genes con L1s (L1) y genes sin L1s (No L1). B) El medio, líneas superior e inferior de cada caja de dos colores son el odds ratio y superior e inferior 95% intervalo de confianza (IC), respectivamente. C) 2 × 2 tablas, los valores de p y odds ratios y D) los porcentajes de los ARNm que no están suficientemente expresadas ( "abajo") tanto en las células tratadas-aza-DC y células de cáncer en comparación con los genes que no están regulados a la baja en aza-DC células tratadas o cáncer, para genes con y sin L1s (L1 y L1 No). Los correspondientes 2 × 2 tablas de contingencia para A) y B) y C) y D) se proporcionan en el cuadro justificante S4 y S5, respectivamente.
Curiosamente, la hipometilación abajo regula ambos grupos de genes , con L1 (p & lt; 2.59E-04; OR = 3,24; IC del 95% = 1,73-6,05; Apoyando Tabla S4) y sin L1 (p & lt; 2.34E-24; OR = 3,09; IC del 95% = 2,46 a 3,87; apoyando Tabla S4). Por lo tanto, es posible que, además de L1 hay otros elementos de ADN metilado del cuerpo gen que la expresión génica regulada. Esta hipótesis está apoyada por un informe reciente que, en el cuerpo de genes, secuencias metiladas únicos son más prevalencia en los genes altamente expresados [9]. Para diferenciar aún más el papel de la L1, se compararon entre los genes con y sin L1. Se encontró que el caso de la baja regulación de los genes en tanto aza-DC tratada HBECs y cáncer de pulmón es más frecuente en los genes que contienen L1 que en los genes sin L1. (OR = 2,08, p = 0,009; Fig. 3C y 3D y soporte de cuadro S5). Por lo tanto, la hipometilación disminuye la expresión de muchos genes en el cáncer, y acto L1s intragenic como un
cis
elemento-regulador metilación mediada.
Muchos genes frecuencia downregulated en pantalla cáncer hypermethylated promotores [8] . Sin embargo, hemos encontrado ninguna conexión entre la hipermetilación del promotor en el cáncer y la presencia de intragenic L1. Los genes con el promotor hypermethylated han demostrado ser hasta reguladas cuando se desmetilados células. La expresión de los genes con L1 no fue mayor frecuencia cuando se desmetilados células cancerosas (cuadro justificante S6.1 y S6.2).
L1 hipometilación aumenta los niveles de ARN L1
Medición de la metilación y el ARN niveles mostraron una correlación inversa entre el genoma amplia metilación L1 y L1 ARN (Pearson r = -0,6955; Fig. 4A). Este hallazgo apoya la hipótesis de que la hipometilación L1 L1 aumenta la transcripción del RNA [37]. Se han propuesto los genes Intronic para formar complejos de ARN aberrante con genes del huésped y por lo tanto inactivar genes de acogida transcripción [38]. L1s son elementos retrotransposable que todavía pueden poseer actividad transcripcional en un número significativo de loci [29]. Por otra parte, algunos L1 se transcriben más allá de sus sitios de adición de poli A y en consecuencia producen ARNs quiméricos que incluyen tanto L1 y secuencias intrónicas únicos [39]. Hemos examinado y encontrado L1-EphA3 ARN de intrón 15 del gen EphA3 y observó una asociación inversa significativa entre L1-EphA3 ARN y la metilación L1-EphA3 (Pearson r = -0,8686; Fig. 4B). Por lo tanto, L1 hipometilación conduce al aumento de la transcripción de L1 y en consecuencia produce más intrónica ARN L1.
A) Genoma amplia metilación L1 y L1 niveles de ARN en las células WSU-HN. B) los niveles de metilación L1-L1-EphA3 y EphA3 ARN.
LINE-1 Intragenic elementos reprimir la transcripción en células de cáncer a través AGO2
retrotransposón ARN o transcripciones que forman estructuras de ARN de doble cadena de montaje desencadenar RISC [40]. Después de la unión ARN pequeños de interferencia (siRNA), RISC reconoce y degrada moléculas de ARN complementarias [41]. L1s poseen hasta tres promotores internos, en el 5 'y 3' y en la dirección antisentido 5 '[42], [43], [44]. Los promotores sentido y antisentido en el 5 'UTR producen transcripciones bidireccionales que se procesan posteriormente en siRNAs para evitar retrotransposition [40]. Por lo tanto, la hipótesis de que L1 ARN y intrónica pre-mRNA de los genes que contienen L1s, debido a la complementariedad de las dos secuencias, forman dsRNA que pueden ser el blanco de RISC, por consiguiente agotamiento de la cantidad de ARNm derivado de genes que contienen L1s. El complejo RISC se compone de Dicer, Argonauta y siRNA. Un complejo similar con AGO2 actúa para silenciar la transcripción de genes en el núcleo [45], [46].
Si intragenic ARN L1 reduce ARNm del gen huésped a través de AGO2, AGO2 la privación de proteínas dará lugar a aumentar los niveles de mRNA de los genes de alojamiento L1. Análisis de microarrays mRNA de AGO2 las reguladas células, AGO2sh [47], demostraron que la expresión limitada de AGO2 en una línea celular de riñón embrionario humano (HEK293T) dio como resultado un patrón de expresión de gen que contiene L1s que era opuesta a la observada durante L1 hipometilación; es decir, eran más propensos a ser de hasta reguladas (OR = 1,44, p = 0,0004; Fig. 5A y 5B y el cuadro justificante S3). El shRNAs de DICER1, AGO1, AGO3 y AGO4 no upregulate genes con L1 (cuadro justificante S6.3-S6.7). Esto sugirió que AGO2 limita preferentemente la concentración de mRNAs derivados de los genes que contienen L1s. Se evaluó además un experimento mRNA microarray hibridado por AGO2 precipitó ARN [48] y se encontró que AGO2 puede no degradar directamente mRNAs que se derivan de genes que contienen L1s. Aunque RISC se une y degrada el ARNm, ARNm derivados de genes que contienen L1 eran menos propensos a estar obligado por AGO2 (OR = 0,64, p = 0,009; Fig. 5A y 5B y Apoyando el cuadro S3), que inicialmente era sorprendente teniendo en cuenta los resultados de la AGO2sh experimentos (Fig. 5A y 5B y complementario del cuadro S3).
a) 2 × 2 tablas, los valores de p y odds ratios y B) que contienen porcentajes de L1-genes que presentan un aumento de los niveles de mRNA en AGO2sh-tratados células ( "Up") o están obligados por AGO2 en AGO2IP ( "Bound"), respectivamente. C) 2 × 2 tablas, valores de p y odds ratios y D) odds ratio (IC del 95%) comparando HEK293T ARNm entre los genes regulados y no regulados hasta los genes sobre AGO2sh y obligado por las proteínas AGO2 para todos los genes (D), genes con L1s (L1) y genes sin L1s (No L1), (C y D). D) El medio, líneas superior e inferior de cada caja de dos colores son los odds ratios e IC 95% superior e inferior, respectivamente. E) Los niveles de AGO2, ARNm EphA3 y L1RNA en células WSU-HN17 AGO2si. Los datos representan la media ± SEM. registros de IGE, muestras de GSM, el tipo de
t-test para
A) y B) se indican en el cuadro justificante S3. 2 × 2 tablas de contingencia para C) y D) se dan en el cuadro justificante S4. F) Dos escenarios de unión que se refleja en diferentes resultados de la matriz de ARNm utilizando AGO2-IP y AGO2sh como sondas AGO2-objetivo. Resultado negativo se esperaba a partir de mRNA de microarrays de expresión usando AGO2-IP ARN como sondas, ( "array + ARNm AGO2-IP"), cuando fueron atacados intrones del pre-ARNm. Sin embargo, resultado positivo se esperaba de microarrays de expresión de ARNm utilizando ARNm de AGO2sh como sondas, ( "array AGO2sh + ARNm"), sin tener en cuenta objetivos AGO2 pre-ARNm o mRNA.
Al comparar ARNm AGO2 unida