Extracto
El pronóstico de los pacientes con cáncer colorrectal (CCR) es generalmente pobre, debido a la falta de herramientas simples, convenientes, y no invasivos para la detección de CRC en la primera etapa. El descubrimiento de microRNAs (miRNAs) y sus diferentes perfiles de expresión entre los diferentes tipos de enfermedades se ha abierto una nueva vía para el diagnóstico de tumores. Construimos un microARN suero perfil de expresión firma y probamos su especificidad y sensibilidad como un biomarcador para el diagnóstico del CCR. También se estudió su posible papel en el seguimiento de la progresión de la CRC. Hemos llevado a cabo una prueba de casos y controles en dos fases para identificar miRNAs suero como biomarcadores para el diagnóstico del CCR. El uso de reacciones en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa, hemos probado diez candidato miRNAs en un conjunto de entrenamiento (30 CRC vs 30 controles). Se utilizó el análisis puntuación de riesgo para evaluar el valor diagnóstico de los miARN suero sistema de perfilado. Otras muestras independientes, entre ellos 83 CRC y 59 controles, se utilizaron para validar el modelo de diagnóstico. En el conjunto de entrenamiento, seis miRNAs suero (miR-21, let-7 g, miR-31, miR-92a, miR-181b, y miR-203) tuvieron significativamente diferentes niveles de expresión entre los CRC y controles sanos. análisis de puntuación de riesgo demostrado que la firma de biomarcadores basados en seis miARN tenía una alta sensibilidad y especificidad para distinguir las muestras de CRC de los controles sin cáncer. Las áreas bajo la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) de los seis-miARN perfiles de firma fueron 0,900 y 0,923 para los dos conjuntos de muestras de suero, respectivamente. Sin embargo, para las mismas muestras de suero, las áreas bajo la curva ROC utilizados por el marcadores tumorales antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) sólo eran 0,649 y 0,598, respectivamente. Los niveles de expresión de los seis miRNAs en suero también se correlacionaron con la progresión del CRC. Por lo tanto, la firma identificado seis genes miARN se puede utilizar como un biomarcador no invasivo para el diagnóstico de CRC, con relativamente alta sensibilidad y especificidad
Visto:. Wang J, Huang Sk, Zhao H, Yang H, Zhong Jl , Gu Yy, et al. (2014) La identificación de una firma de microARN de circulación para la detección del cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (4): e87451. doi: 10.1371 /journal.pone.0087451
Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: 30 Octubre, 2013; Aceptado: December 28, 2013; Publicado: 7 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica clave de China (2007CB914700). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en el mundo. Es responsable de cerca de 50.000 muertes cada año y es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer [1], [2]. Se estima que, cada año, un millón y medio de nuevos casos de CCR serían diagnosticados en todo el mundo [2]. Un estudio registrada en Vigilancia de Epidemiología del Instituto Nacional del Cáncer y Resultados Finales (SEER), se llevó a cabo con 119,363 personas con diagnóstico de adenocarcinoma de colon entre 1991 y 2000. Este estudio encontró que las tasas de supervivencia a 5 años observados estaban relacionados con la etapa de la la enfermedad al momento del diagnóstico; para los pacientes diagnosticados en estadio I /IIa de la supervivencia fue mucho mejor que en los pacientes diagnosticados en etapas posteriores [3]. Aunque los programas de atención y detección cualificados desempeñan un papel importante en la supervivencia de los pacientes con CCR, la resección quirúrgica en la primera etapa es el tratamiento más eficaz y prolonga la supervivencia de los pacientes. Por desgracia, los CRC en etapa temprana son difíciles de detectar debido a un menor número de síntomas.
En la actualidad, la endoscopia y pruebas de sangre oculta en heces (FOBT) se utilizan a menudo en clínicas para el diagnóstico de pacientes con CRC. Sin embargo, no sólo es la biopsia aleatoria de un procedimiento invasivo, pero puede ocurrir posibles errores de muestreo, lo que limita aún más su eficacia. Mientras tanto, aunque FOBT es simple, barato y no invasivo, presenta en particular pobre sensibilidad para la detección de la etapa inicial de CRC [4], [5]. El proteoma de sangre circulante también se ha aplicado para detectar biomarcadores para CRC tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA) y el antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9), pero su sensibilidad y especificidad, especialmente para el cáncer colorrectal etapa temprana, parece ser insuficiente [6]. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos métodos de diagnóstico y biomarcadores novedosos para las encuestas en masa de los primeros eventos de CRC.
microARN (miARN) es un largo no codificante ARN $ ~ $ 22-nt, que desempeña un papel negativo en la expresión génica [7], [8]. La expresión alterada de miRNAs se ha asociado con diversas enfermedades, especialmente el cáncer. MiRNAs se ha demostrado que diferenciar con éxito diversos tipos de cáncer y predecir los resultados en los dos tumores malignos sólidos y hematológicos [7]. Estudios recientes han demostrado que existen grandes cantidades de miRNAs en la circulación. Estos miRNAs circulantes son capaces de soportar condiciones fisiológicas desfavorables, tales como las variaciones extremas de pH, temperatura, y múltiples ciclos de congelación /descongelación [9], [10]. Por otra parte, algunos investigadores señalaron que los perfiles de miARN circulantes mostraron niveles de expresión consistentes a través de los individuos fisiológicamente sanos [11]. Debido a que el suero y plasma son relativamente fáciles de acceso, circulando miRNA es uno de los candidatos más prometedores para el diagnóstico de cáncer. Muchos estudios han demostrado que los patrones de expresión de miRNAs suero pueden identificar potencialmente varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, y cáncer de hígado [12], [13]. Por lo tanto, la identificación de un perfil de expresión de los genes miARN suero único para CRC será útil en el diagnóstico y el seguimiento del tratamiento de los tumores.
Para reforzar la eficacia diagnóstica de miRNAs de circulación, los nuevos métodos para elevar su valor diagnóstico de CCR son requeridos. Muchos investigadores encontraron que la combinación de varios miRNAs como un biomarcador podría mejorar la eficiencia de diagnóstico [14], [15]. Sin embargo, estos estudios se centraron principalmente en miRNAs hasta reguladas. En este estudio, que tuvo como objetivo combinar tanto miRNAs arriba y hacia abajo regulada, para construir un modelo de diagnóstico del CCR. Primer lugar, validado diez miRNAs reportados anteriormente a estar asociado con el CRC, a saber, el miR-21, miR-31, miR-203, miR-92a, miR-181b, miR-145, miR-143, miR-30c, miR-17, y let-7 g. Entonces, por análisis estadístico, se identificaron un perfil que combina seis miRNAs de suero, que puede servir como un nuevo biomarcador para el diagnóstico no invasivo CRC.
Materiales y Métodos
declaración Ética
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y voluntarios sanos antes del estudio, y se recogieron todas las muestras de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Ético de Investigación clínica del Instituto de cáncer y el hospital de la Academia china de Ciencias médicas.
diseño del estudio y los pacientes
para identificar un biomarcador sustituto de la CRC, un estudio de casos y controles de múltiples etapas fue diseñado para identificar un perfil de miARN suero de diagnóstico (véase la Figura 1). Un total de 113 pacientes con CRC primarias (estadios I-IV) y 89 sujetos control fueron reclutados para este estudio. Los 113 pacientes con cáncer fueron reclutados en el Instituto de Cáncer y el Hospital de la Academia China de Ciencias Médicas entre 2008 y 2010. Los pacientes con una historia previa de tumores malignos, CCR hereditario no asociado a poliposis, o poliposis adenomatosa familiar, fueron excluidos. Las muestras de suero se recogieron antes de cualquier resección del tumor tales como cirugía, quimioterapia y /o radioterapia. Cada paciente tenía un diagnóstico confirmado histológicamente, y se determinó el estadio del tumor basándose en los hallazgos de la cirugía, o en la biopsia y la tecnología de la imagen cuando el tumor no era adecuado para el tratamiento quirúrgico. controles sanos sin enfermedad maligna conocida o condición inflamatoria activa fueron emparejados a los pacientes en función de la edad, sexo y origen étnico. El sistema de clasificación TNM se utilizó para evaluar el estado del tumor de acuerdo con el sistema de estadificación tumor-nódulo-metástasis de la Sexta Edición de la Comisión Conjunta de Estados Unidos. Los datos demográficos y características clínicas de la cohorte de estudio se enumeran en la Tabla 1.
En la etapa de selección de biomarcadores, un panel de diez candidatos (miRNAs miR-21, let-7 g, miR 31, miR-92a, miR-181b, miR-203, miR-17, miR-30c, miR-143 y miR-145) fueron seleccionados para la investigación en muestras de suero basado en los comentarios anteriores sobre el cáncer colorrectal [13], [ ,,,0],dieciséis]. Para el conjunto de entrenamiento, se seleccionaron al azar 30 CRC y 30 controles sanos y llevamos a cabo reacciones en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para seleccionar candidatos miRNAs. Posteriormente, la validación se ha realizado mediante el CRC 83 y 59 muestras de donantes sanos (conjunto de validación) restante.
Suero, el aislamiento de ARN, y QRT-PCR ensayo
muestras de sangre venosa (≈5 ml ) se recogieron en tubos de recogida de suero, y se dejó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h antes de ser centrifugada a 820 g durante 10 min a 4 ° C. El suero resultante se transfirió a tubos nuevos, seguido de posterior centrifugación a 16.000 x
g
durante 10 min a 4 ° C, para eliminar por completo cualquier resto de células. ARN total fue aislado de 250 l de suero utilizando el reactivo Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) técnica de co-purificación. Para cada 250 l de suero, la separación de fases se realizó mediante la adición de 750 l de Trizol LS. Después, se añadieron 200 l de triclorometano para aumentar el proceso de separación de fases de ARN. El ARN total se precipitó con isopropanol y se lavó con 75% de etanol, después se añadieron 30 l de RNasa libre de agua para la solubilización. Cada 250 l de suero produjeron 30 l de solución de ARN total, que se almacenó a -80 ° C. Tres l de RNA total se polyadenylated por poli polimerasa (A) y transcripción inversa en ADNc usando el kit de transcripción Takara microRNA (Takara, Japón), siguiendo el protocolo del fabricante. Los productos de transcripción inversa se diluyeron a un quinto con agua libre de RNasa y se utilizan como plantillas para su posterior análisis PCR. PCR se realizó utilizando el kit SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara) en un sistema ABI 7300 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con el cebador universal proporcionada por el fabricante y el cebador directo miARN-específica. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 2. Cada reacción se realizó en un sistema de volumen de 20 l que contiene 2 l de ADNc, 0,4 l de cada cebador (10 mM), 0,4 l de colorante de referencia ROX (50 ×), agua destilada de 6,8 l estéril, y 2 × SYBR Premezcla Ex Taq II. El programa de PCR fue: desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 5 s a 95 ° C, y extensión durante 31 s a 60 ° C. Al final de los ciclos de PCR, se realizaron los análisis de fusión de la curva para validar la especificidad del producto de PCR esperado. Cada reacción se llevó a cabo por triplicado, y la dilución de cDNA se utilizó como molde para el control negativo.
endógena miR-16 se usó como el normalizador para la circulación de miRNA cuantificación. Los niveles relativos de expresión de los miRNAs se calcularon por el método comparativo ΔΔCT 2-
como se describe anteriormente [17], [18].
suero CA 19-9 y CEA análisis
La tumor marcadores CEA y CA-199 se analizaron con un analizador de inmunoensayo Elecsys (Roche, Basilea, Suiza). Los límites superiores normales para los marcadores tumorales fueron de 6,5 ng /ml para CEA y 39 U /ml de CA-199.
El análisis estadístico
La comparación de las características demográficas y clínicas entre los pacientes con CRC y los controles sanos se determinó mediante la prueba t de Student, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) o la prueba de chi-cuadrado.
se realizó un análisis de riesgos puntuación para evaluar la asociación entre las muestras y el CRC miARN niveles de expresión. La puntuación de riesgo de cada miARN en el conjunto de capacitación se denota como
s
. Para miRNAs hasta reguladas, la puntuación de riesgo se establece como 1 si el nivel de expresión fue mayor en las muestras de CRC que el intervalo superior de referencia del 95% para el correspondiente nivel de miRNA en los controles, y para los miRNAs reguladas por, puntuación de riesgo era establecer como -1 si el nivel de expresión fue menor en las muestras de CRC que el intervalo de referencia del 95% menor en los controles; de lo contrario, la puntuación fue establecido como 0. Para la correlación de cada miARN con el riesgo de CCR, a cada paciente se le asignó una función de puntuación de riesgo (RSF) sobre la base de una combinación lineal de los niveles de expresión de los miRNAs. Utilizando la información de seis miRNAs, el RSF para la muestra
i
es el siguiente: En la ecuación anterior,
sij
es la puntuación de riesgo de miARN
j
en la muestra
i
, y W
j
es el peso de la puntuación de riesgo de miARN
j
. Para determinar los Ws, seis modelos de regresión logística univariante fueron equipados con el estado de la enfermedad con cada una de las puntuaciones de riesgo. El coeficiente de regresión de cada puntuación de riesgo se utilizó como el peso para indicar la contribución de cada uno de los genes miARN a la RSF. La tabla de frecuencias y las curvas ROC (ROC) se utilizaron para evaluar los efectos de la elaboración de perfiles de diagnóstico y encontrar un punto de corte apropiado. Validación del procedimiento y de los puntos de corte se lleva a cabo en el conjunto de validación.
Se ha realizado una muestras independientes t-test para comparar las concentraciones séricas miARN entre el cáncer y muestras sanas. Debido a la magnitud y el alcance de los niveles de expresión de los genes miARN que se observaron, los datos de resultados fueron log-transformados para el análisis (log
2). Todas las pruebas fueron de 2 caras y un nivel de significación de p-valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) y los gráficos se han generado con GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Los datos se presentan como la media. Para el análisis de conglomerados, la agrupación jerárquica se realizó utilizando Cluster 3.0 (Berkeley, CA, EE.UU.) con el método de vinculación completa.
Resultados
Descripción de los pacientes
Todo el 113 pacientes incluidos en este estudio tenían un diagnóstico clínico y patológico de la CRC. Como se muestra en la Tabla 1, no hubo diferencia significativa en la distribución de la edad, el género y otras enfermedades, tales como la disfunción cardíaca o enfermedad neurológica, entre los pacientes con CRC y los controles sanos en los conjuntos de entrenamiento y validación. Los niveles elevados de CEA (& gt; 6,5 ng /ml) y CA19-9 (& gt; 39 U /ml) se encontraron en 40 y 26 pacientes, respectivamente
Evaluación de miARN expresión en pacientes con CRC y controles sanos. por tiempo real QRT-PCR análisis
Una prueba de casos y controles en dos fases fue diseñado para identificar miRNAs suero como biomarcadores candidatos para el diagnóstico del CCR. Se seleccionaron diez candidato miRNAs reportados en estudios previos, y utilizamos los ensayos de QRT-PCR para confirmar su expresión en los 30 casos de CCR y 30 controles sanos emparejados por edad y el género en el conjunto de entrenamiento. MiR-16 expresión se utilizó para normalizar los datos de QRT-PCR. No se observó ninguna diferencia significativa en los niveles de miR-17, miR-145, miR-143, miR-30c entre la CRC y las muestras de control (datos no mostrados). Sin embargo, los niveles de expresión de seis de los miRNAs fueron significativamente diferentes entre las muestras de CRC y de control; dos miRNAs, miR-21 y let-7 g, fueron hasta reguladas, y cuatro miRNAs, miR-31, miR-92a, miR-181b, y miR-203, se redujeron reguladas (Tabla 3). Las concentraciones de los seis miRNAs expresados diferencialmente fueron examinados por QRT-PCR en los 83 pacientes con CCR y 59 controles emparejados en el conjunto de validación. Las alteraciones en los patrones de expresión de genes miARN observadas en el conjunto de validación fueron consistentes con los encontrados en el conjunto de entrenamiento. La expresión diferencial de los seis miRNAs en los 113 casos de CCR en comparación con los 89 controles se muestra en la figura 2. Por lo tanto, este proceso de ensayo y análisis de dos fases genera un perfil de seis miRNAs suero que sirvieron como un biomarcador potencial para la CRC. Los seis biomarcadores candidatos fueron sometidos a más pruebas y análisis.
Los niveles de expresión de suero de los seis seleccionados miRNAs se midieron en 113 casos de CCR y 89 sujetos control sanos (tanto en el conjunto de entrenamiento y el conjunto de validación) usando un ensayo de qRT-PCR basada en SYBR. Cada reacción se llevó a cabo por triplicado.
Separación de los casos de CCR y controles sanos mediante análisis de puntuación de riesgo
Para evaluar el valor diagnóstico de una firma miARN expresión que comprende los seis miRNAs identificados, se realizó un análisis de calificación de riesgo para distinguir entre las muestras de suero de CRC y las muestras de suero de los controles sanos. En primer lugar, la puntuación de riesgo para cada uno de los miRNAs en el conjunto de entrenamiento se calculó utilizando la fórmula de calificación de riesgo. En el valor predictivo de corte óptimo de 9,595 para la función de puntuación de riesgo, cuando la sensibilidad y especificidad estaban en su punto máximo, las muestras de suero se dividieron en un grupo de bajo riesgo y un grupo de alto riesgo que representa los donantes sanos y los casos de CCR, respectivamente . A continuación, se utilizó el valor de corte para el análisis de las 142 muestras en el conjunto de validación. Como se muestra en la Tabla 4, el valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de la firma de seis miARN en el conjunto de entrenamiento fueron 0,96 y 0,85, respectivamente, y en el conjunto de validación de los valores predictivos positivos y negativos fueron de 0,95 y 0,92, respectivamente. También se construyeron curvas ROC para estimar la sensibilidad y especificidad de los marcadores biológicos basados en miARN. Las áreas bajo la curva (AUCs) fueron 0,900 y 0,923 para el conjunto de entrenamiento y el conjunto de validación, respectivamente (Figura 3A y 3B). Utilizando las mismas muestras de suero, se compararon los valores de AUC para la firma de seis miARN con las AUC para el CEA y CA 19-9 marcadores tumorales, que se utilizan actualmente en las clínicas para la detección de CRC. Los valores de AUC para la firma de seis miARN fueron marcadamente superiores a las AUC para CEA (0.649) y CA 19-9 (0,598) (Figura 3C y 3D). Estos resultados indican que la firma de seis miARN es un biomarcador más preciso que el CEA y CA 19-9 para el diagnóstico CRC
.
(A) análisis de la curva ROC para el perfil de la firma de seis miARN en el conjunto de entrenamiento produjeron un valor AUC de (IC del 95%: 0,812 hasta 0,988) 0,900 con una sensibilidad del 83,3% y 96,7% de especificidad (valor de corte = 9,595). (B) Análisis de la curva ROC para el perfil de la firma de seis miARN en el conjunto de validación arrojó un valor de AUC de 0,923 (IC del 95%: 0,869 a 0,976) con una sensibilidad del 96,4% y una especificidad del 88,1% (valor de corte = 9,595) . (C) El antígeno carcinoembrionario (CEA) dio un valor de AUC (IC del 95%) 0.649: 0,574-0,724) con una sensibilidad del 35,4% y el 94,4% de especificidad y el antígeno D) de hidratos de carbono (19-9 (CA 19-9) produjo un valor de AUC de 0,598 (IC del 95%: 0,521-0,676). con una sensibilidad del 23% y una especificidad del 96,6%, para las mismas muestras de suero
Asociación con factores demográficos y clínicos
para determinar el papel de los seis marcadores tumorales basados en miARN en la Convención de desarrollo, los casos de CCR más fueron estratificados en función de su clasificación TNM. En este análisis, las muestras de CRC conjunto de entrenamiento y el conjunto de validación se combinaron y los niveles de expresión de los seis miRNAs se correlacionaron con el estadio tumoral de los pacientes con CCR. Se encontró que los valores de puntuación de riesgo fueron diferentes entre los casos de CCR en estadios tumorales diferentes (ver Figura S1 A). La puntuación de riesgo media de los casos de CCR en etapas posteriores (IIb, III, y IV) fue significativamente mayor que la puntuación en las fases anteriores (I y IIa). No se encontró asociación significativa entre los seis miRNAs y el género, la edad, el estado ganglionar, y la profundidad del tumor invasivo (ver Figura S1 B-E).
agrupación no supervisada análisis
Para analizar la expresión diferencial de los miRNAs entre la CDN y las muestras de suero de control, se realizó un proceso de agrupamiento no supervisado que era ciego a las anotaciones clínicas. El dendrograma mostró una clara separación de las muestras de CRC a partir de las muestras de control basadas en el perfil de firma de seis miARN (ver Figura S2). En el conjunto de entrenamiento, ninguno de los 30 muestras de CRC y sólo cuatro de 30 muestras de control fueron clasificados de forma incorrecta (Figura S2A). En el conjunto de validación, los 83 casos de CCR y 59 controles fueron clasificados en dos categorías principales; Sólo en un caso el CRC y tres controles fueron mal clasificados (Figura S2 B)
Discusión
Muchos estudios han encontrado que la expresión de los genes miARN es aberrante en el desarrollo de CCR.; Sin embargo, la mayoría de estos estudios se centraron en la expresión de miRNAs en los tejidos tumorales y las células. Aunque miRNAs de tejidos pueden proporcionar un diagnóstico preciso de varios tipos de cáncer, la dificultad en la recogida de muestras de tejido limita su aplicación para la detección de biomarcadores de cáncer. La adquisición de muestras de tejidos es un procedimiento invasivo y depende de secciones quirúrgicas después de la clasificación clínica inicial. La búsqueda de herramientas no invasivas para el diagnóstico del cáncer ha sido durante mucho tiempo un objetivo de muchos investigadores, y gran parte del interés ha estado en la circulación de ácidos nucleicos en el plasma y suero. En comparación con el ADN y ARNm, miRNAs circulantes muestran una notable estabilidad después de una incubación prolongada a temperatura ambiente y /o múltiples procesos de congelación-descongelación. Sin embargo, el mecanismo de protección de miRNAs circulantes es aún desconocido. Algunos investigadores informaron que los miRNAs circulantes eran en forma de Argonaute 2 (Ago2) -miRNA complejos que podrían evitar la digestión RNasa [19]. MiRNAs en plasma se pueden secretar a partir de células y el proceso de liberación puede ser un mecanismo selectivo que se correlaciona con la malignidad [20]. Hay muchas ventajas en el uso miRNAs circulantes para la detección de CRC. La recogida de muestras es fácil y económico, y de manera importante, es un procedimiento relativamente no invasivo que se puede aplicar fácilmente en la detección y el seguimiento de pacientes con cáncer. Además, los perfiles de miRNAs son principalmente consistentes entre individuos sanos y son muy estables en la sangre.
Las primeras búsquedas de herramientas no invasivas para el diagnóstico de los cánceres se centraron principalmente en única o sólo unos pocos miRNAs específicos de tumores [9] , [21] - [23]. Por ejemplo, Liu et al. [21] estudiaron los perfiles de miARN en el suero de los pacientes de cáncer gástrico, pacientes de cáncer colorrectal, y los individuos sanos. Curiosamente, se encontró que circula miR-378 estaba relacionada con el cáncer gástrico, pero no se asoció con otros cánceres gastrointestinales. Se informó de que miR-378 niveles de expresión podrían distinguir pacientes con cáncer gástrico de los controles sanos, con una sensibilidad del 87,5% y 70,73% de especificidad [21]. Suero de miR-1246 solo se obtuvo un área bajo la curva ROC de 0,754, con una sensibilidad del 71,3% y el 73,9% de especificidad para distinguir los pacientes con cáncer de esófago de controles sanos [23]. Aunque este tipo de enfoque es simple y disponible, la especificidad de los biomarcadores basado en un solo miRNA específico de tumor es generalmente pobre. La iniciación y el desarrollo de los cánceres implican muchos eventos diversos y complejos moleculares, que afectarán a la proliferación, los ciclos celulares, y apoptosis. Por lo tanto, una combinación de múltiples miRNAs de suero debe ser más fiable para la detección de tumores de los biomarcadores basados en hidratos de carbono a base de proteínas o individuales convencionales. En este estudio, hemos identificado dos miRNAs hasta reguladas en suero (miR-21, let-7 g), y cuatro miRNAs-regulado (miR-31, miR-181b, miR-92a, miR-203). A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio para describir una firma basada en miARN suero que fue construido mediante la combinación de miRNAs exceso o en defecto expresado, los cuales juegan un papel importante en la proliferación tumoral, la migración y la invasión. La firma de seis miARN podría detectar muestras de suero de CRC con una sensibilidad y especificidad del 93% y 91%, respectivamente (véase el cuadro S2), significativamente más alto que cualquier biomarcador de un solo factor, como CA19-9 o CEA. Nuestros resultados muestran que, para las mismas muestras de suero, la sensibilidad de la detección de CRC por CA19-9 y CEA eran 35% y 23%, respectivamente. Claramente, la combinación de la firma de seis miARN puede separar con éxito los pacientes con CRC de los controles, y podría servir como un biomarcador para el diagnóstico preciso CRC. En particular, este biomarcador mostró un perfil de expresión diferente entre los controles normales y pacientes con CRC sólo con estadio I /II de cáncer (Tabla S1). CRC pacientes con estadio I /II pueden someterse a una resección completa del tumor, y tendrán un mejor pronóstico. Nuestros datos sugieren fuertemente que la aplicación de la firma de seis miARN como un biomarcador para la definición de CRC-etapa temprana puede ser una manera eficaz para cambiar los resultados y mejorar el pronóstico. Hemos encontrado que la expresión de los genes miARN se correlaciona con el estadio del tumor, y el suero miRNA firma puede ser utilizado para detectar la fase de progresión de la CRC. No se encontraron diferencias en los casos de CCR fueron estratificados por factores demográficos y clínicos, como el género, la edad, el estado ganglionar, y la profundidad del tumor invasivo; Sin embargo, nuestros resultados mostraron que una alta puntuación de riesgo se asoció con las etapas clínicas avanzadas de esta enfermedad (Figura S1). Actualmente, el sistema de estadificación TNM es la principal herramienta utilizada por los médicos para estimar la carga tumoral y el predecir el pronóstico y la supervivencia. Proponemos que la firma de seis miARN en muestras de suero podría convertirse en un parámetro predictivo importante en la elección de la mejor combinación de modalidades de tratamiento, como la cirugía, la radioterapia y /o quimioterapia. Sin embargo, nuestros datos son en parte contradictorias con los resultados de algunos estudios previos; por ejemplo, se registraron los niveles de expresión de miR-181b, miR-92a, miR-31 y miR-203 a ser elevados en muestras de tejido de CRC en comparación con los controles. Esta diferencia puede atribuirse a diferentes niveles de expresión de los genes miARN entre el tejido y plasma. Muchos estudios han demostrado que la expresión de los genes miARN en muestras de tejido cambió en la dirección opuesta a su expresión en las muestras de suero [21], [24]. Esto puede ser causado por el mecanismo de selección celular de miARN de liberación [20]; por ejemplo, las células cancerosas pueden retener selectivamente algunos miRNAs, resultando en una disminución de miRNAs en el suero. Más interesante aún, también se encontró que la expresión de estos cuatro miRNAs reguladas por ser las reguladas en algunos otros tipos de cáncer. Por ejemplo, miR-31, que se encuentra en el cromosoma 9p21.3, fue significativamente menor en el cáncer de vejiga [25], cáncer de mama [26], cáncer gástrico [27], carcinoma de próstata [28], y el CRC con metástasis cerebral [ ,,,0],29]. Muchos investigadores han encontrado que el miR-31 puede inhibir la metástasis del cáncer de mama [26], [30], y la desregulación de miR-31 se ha asociado con la progresión del cáncer y la metástasis. La alta expresión de miR-92a se ha asociado con el desarrollo y progresión de muchos tipos de cáncer [31]; sin embargo, Shigoka et al. [32] encontró que miR-92a fue altamente expresado en tejido de carcinoma hepatocelular, fue menor en el plasma de estos pacientes, pero fue elevada en su plasma después del tratamiento quirúrgico. Nilsson et al. [33] mostró que los niveles bajos miR-92a en los tumores se asociaron con la etapa del tumor y que su baja regulación aumento de la migración celular. MiR-181b se ha demostrado que actúa como un gen supresor de tumores, y se había reducido regulado en los gliomas humanos [34], [35].
En resumen, este es el primer estudio que reporta el valor clínico de diagnóstico de una firma de biomarcadores basados en seis miARN en el suero que contiene tanto hacia arriba y hacia abajo miRNAs regulada. Nuestro trabajo va a servir de base para una mayor investigación, preferentemente validación a gran escala en los ensayos clínicos, antes de miRNAs en suero puede ser utilizado como una herramienta de detección de rutina para la CRC.
Apoyo a la Información
Figura S1. Francia El asociación de los niveles de expresión de los seis miRNAs con factores demográficos y clínicos de los pacientes con CCR. (A) Cuando los casos de CCR se agruparon por su estadificación TNM, la puntuación de riesgo media de los casos de CCR en etapas posteriores (IIb, III, y IV) fue significativamente mayor que en las fases anteriores (I y IIa) (p & lt; 0,05). (B-E) No se encontró asociación significativa entre los seis miRNAs y la profundidad del tumor invasivo, estado ganglionar, el género y la edad
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s001 gratis (DOCX)
figura S2.
dendrograma de los resultados de la agrupación sin supervisión. El dendrograma indica una clara separación de las muestras de CRC a partir de las muestras de control en base a la firma de seis miARN tanto en el conjunto de entrenamiento (A) y el conjunto de validación (B)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451. S002 gratis (DOCX)
Tabla S1. miRNAs en estadio I-
diferencialmente expresado /muestras de suero II CRC en comparación con los de las muestras de suero de control. Los normalizaron los niveles de expresión de miRNAs se presentan como media ± desviación estándar
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s003 gratis (DOCX)
Tabla S2.
sensibilidad y la especificidad de la firma biomarcador de seis miARN en comparación con el CEA y CA19-9 marcadores
doi:. 10.1371 /journal.pone.0087451.s004 gratis (DOCX)