Extracto
Antecedentes
El cáncer gástrico (CG) se asocia con altas tasas de mortalidad y un pronóstico desfavorable en etapas avanzadas. Además, no existen métodos eficaces para el diagnóstico de cáncer gástrico en una etapa temprana o para predecir el resultado para el propósito de la selección de las opciones de tratamiento específicos para cada paciente. Por lo tanto, es importante investigar nuevos métodos para el diagnóstico GC.
Metodología /Principales conclusiones
Para facilitar su uso en un entorno de diagnóstico, un grupo de 74 genes con información diagnóstica y pronóstica se tradujo en un microarray personalizado que contiene un conjunto reducido de 1.042 sondas adecuadas para procesamiento de alto rendimiento. En este informe, hemos demostrado por primera vez que la costumbre mini-array puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico fiable en el cáncer gástrico. Con un valor de AUC de 0,565 (IC del 95% 0,305-0,825) que indica una prueba perfecta, la sensibilidad y especificidad de diagnóstico de la curva ROC se calcularon para ser del 70% y 80%, respectivamente.
Conclusiones /Importancia
Los datos demuestran claramente la reproducibilidad y robustez de la pequeña microarrays a medida. La matriz es una excelente herramienta para la clasificación y la predicción del resultado de la enfermedad en pacientes con cáncer gástrico
Visto:. Yin Y, Zhuo W, Y Zhao, Chen S, Li J, Wang L, et al. (2013) La conversión de una Firma de microarrays en una prueba de diagnóstico: un ensayo de encargo 74 conjunto de genes para la clarificación y predicción El pronóstico del cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (12): e81561. doi: 10.1371 /journal.pone.0081561
Editor: Courtney G. Montgomery, Oklahoma Medical Research Foundation, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: Diciembre 3, 2013
Derechos de Autor © 2013 Yin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81302070, 81272678, 81071961) (http://www.nsfc.gov.cn), Programa Nacional de Investigación básica de China (973 programas) (2012CB945004) (www.973.gov .cn). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) tiene una alta incidencia y es la segunda causa de mortalidad por cáncer [1,2]. El pronóstico de la GC depende de la etapa de la enfermedad en el diagnóstico y el método de tratamiento [3] altamente. La tasa de supervivencia a 5 años en pacientes con cáncer avanzado de estómago es alrededor del 20%, mientras que en el cáncer gástrico en etapa inicial es superior al 60% [4-6]. Sin embargo, no ha habido métodos eficaces y viables para detectar el cáncer de etapa temprana y para predecir la posible pronóstico para proporcionar un tratamiento adecuado para cada paciente. En Japón, aunque podrían detectar y tratar el cáncer gástrico temprano (CGT) a través de una amplia proyección de manera más eficiente, sólo se endoscopia podría ser utilizado comúnmente para la detección de EGC. Esta es la razón por el diagnóstico precoz y la capacidad de distinguir las lesiones malignas y premalignas son importantes [7]. Por lo tanto, es importante investigar nuevos métodos de GC predicciones de diagnóstico o pronóstico para aplicaciones clínicas.
Ciertas alteraciones genéticas podrían estar asociados con la cancerización y la progresión de GC [8-11]. Por ejemplo, los datos anteriores se estudiaron sugirió que los genes de colágeno pueden ser un biomarcador potencial para distinguir maligna de las lesiones premalignas en el estómago [12]. Debido a que la progresión de la enfermedad de las condiciones premalignas a GC es un proceso dinámico [13-15], la detección de alteraciones de genes podría permitir la identificación de genes asociados a enfermedades anteriores de exámenes patológicos. Además, la expresión de genes proporciona información adicional acerca de la condición del paciente [16]. Por lo tanto, el análisis de microarrays puede ser un método importante y útil para el diagnóstico y la estratificación del riesgo en el cáncer gástrico.
Además, el uso de mini-matrices personalizadas para la práctica clínica no sólo puede ser más barato, pero puede también requieren menos insumos muestra de RNA para el etiquetado y la hibridación, y el tiempo de procesamiento de datos podría ser reducido sustancialmente en comparación con microarrays normales [17]. Una costumbre de microarrays de 70 genes para el pronóstico del cáncer de mama, que ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), verifica la viabilidad de microarrays de costumbre en el uso clínico [18,19]. Aunque se han realizado varios estudios sobre determinados grupos de genes para el diagnóstico de GC, la tecnología de microarrays es en la actualidad no se utiliza como una herramienta de diagnóstico en el cáncer gástrico.
En este trabajo se describe por primera vez el desarrollo de una personalizado de diagnóstico GC mini-array y demostrar que la costumbre mini-matriz podría ser utilizado como una herramienta de diagnóstico y predicción fiable en el cáncer gástrico.
Resultados
Una costumbre mini-matriz de un grupo de posibles genes relacionados con la cancerización GC y el progreso
En un estudio anterior, se utilizó un oligonucleótido de microarrays de 38.500 genes para examinar sistemáticamente la expresión génica diferencial entre 33 muestras de lo normal, premalignas y malignas en el estómago [12]. Una fracción de 696 genes de expresión diferenciada que se encuentra en el estudio formal fueron diseñados en la costumbre mini-matriz como parte de una base de investigación. Además, para algunos grupos en los que se encontraron genes que fueron posiblemente estrechamente relacionada con la GC, la costumbre mini-matriz también incluye 44 genes relacionados con colágeno [20-22], 54 genes para los receptores de hormonas sexuales y las vías, los genes de expresión diferenciada encontraron en otros estudios, y los genes de normalización 915 (datos del cuadro se detalla S1). En este estudio, un perfil de expresión de genes 1042 se estableció como un diagnóstico potente y predictor de evolución de la enfermedad en pacientes con cáncer gástrico.
Comparación del rendimiento de la matriz 1042-Gen con la del original 25k Microarray
Para determinar si la prueba mini-serie personalizada realiza similar a los originales 25 K microarrays [12], dos muestras ( LYXT y LYXS) desde unos mismos pacientes utilizados en la serie original para desarrollar el clasificador 1042-diagnóstico se recuperaron. Las expresiones de 696 genes generadas mediante el diagnóstico mini-array son muy similares (Pearson correlación de 0,957, p & lt; 0,01) a los datos publicados originales (Figura 1)
Los datos indicaron la relación de expresión de maligna. /premaligna. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos.
Identificación de genes expresados diferencialmente en los tejidos gástricos malignas y premalignas
Todos los datos de hibridaciones se antecedentes corregido, normalizada, y se analizan para identificar los genes diferenciados de expresión en 40 muestras que representan lesiones malignas y lesiones premalignas (n = 20 en cada grupo). Se encontró un conjunto de 371 genes para separar las lesiones malignas de las lesiones premalignas utilizando la agrupación jerárquica y SVM dejar fuera de una confirmación, mientras que una muestra premaligna (MGF) se clasificaron en el grupo maligno, y cinco muestras malignas (XSHT, gjft, CXCT , XYT y QLTT) se clasificaron en el grupo premaligna. El MGFS y la muestra se recogió de los tejidos circundantes de un carcinoma en anillo de sello. El informe patológico reveló que la muestra XSHT era un adenocarcinoma moderadamente diferenciado, gjft de la muestra fue un adenocarcinoma moderadamente a bien diferenciado, mientras que CXCT, XYT y muestras QLTT estaban bien diferenciadas adenocarcinoma. Estos genes expresados diferencialmente incluyen 199 genes regulados y 172 genes regulados en lesiones malignas en comparación con las lesiones premalignas (Figura 2).
Cada columna representa una muestra y cada fila un gen. El carácter de "T" se refiere a tumor y el carácter de "S" se refiere a tejido premalignas en nombres de las muestras. Las expresiones de genes entre dos grupos tienen diferencias significativas, pliegue registro de cambios
2 & gt; = 1 o & lt; = -1, P & lt; 0,01
Distinguir el pronóstico del cáncer gástrico
Un algoritmo de agrupamiento jerárquico no supervisado nos permitió agrupar las lesiones malignas 20 GC sobre la base de sus similitudes medidos en los genes significativos de 371 genes expresados diferencialmente entre lesiones malignas y premalignas. Cabe destacar que en el grupo de izquierda, 4 de los 10 pacientes esporádicos estaban en una etapa temprana de la GC y las demás presentadas con lesiones altamente diferenciados, mientras que en el grupo de la derecha, 2 de 10 pacientes esporádicos eran del grupo que desarrolló metástasis a distancia dentro de los 5 años o con la etapa alta y lesiones pobremente diferenciados. Por lo tanto, el uso de agrupamiento no supervisado, podemos distinguir entre "buen pronóstico" y los tumores de mal pronóstico 'hasta cierto punto (Figura 3). Además, el tipo y el estadio del CG de los pacientes se asociaron con los subgrupos de pobres o de buen pronóstico (Tabla 1, los datos detallados en la tabla S2).
Cada columna representa un tumor y cada fila una gene. La longitud y la subdivisión de las ramas muestran la relación de la GC (parte inferior) y la expresión de los genes (derecha). La línea amarilla marca la subdivisión en dos grupos dominantes. Las expresiones de genes entre dos grupos tienen diferencias significativas, pliegue registro de cambios
2 & gt; = 1 o & lt; = -1, P & lt;. 0,01
Grupo 1 (Buen pronóstico)
Grupo 2 (mal pronóstico)
Age62.8 ± ± 7.1161.3 7.02Gender (Hombre /Mujer) 7/38 /2stage (I /II /III /IV) 2/1/7/01/0/5 /tipo 4Pathological (moderadamente bien diferenciado de adenocarcinoma /diferenciado adenocarcinoma /carcinoma de células en anillo de sello /mucinoso adenocarcinoma pobremente) 7/2/1/03/4/1/5 con 2Metastasis years13Table 1. La etapa de los pacientes con cáncer gástrico en dos grupos.
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array de encargo con el número mínimo de genes para el diagnóstico y la predicción GC
Sin Supervisión análisis de conglomerados en dos dimensiones de la agrupación de genes y GC agrupamiento se realizó de forma independiente mediante un algoritmo de agrupamiento jerárquico de aglomeración con 371 genes que podrían identificar GC malignas y premalignas. lesiones El coeficiente de correlación de la expresión de cada gen con la evolución de la enfermedad se calculó, y no se encontraron 252 genes que se asociaron significativamente con la evolución de la enfermedad (coeficiente de correlación & lt; -0.3 o & gt; 0,3) (datos detallados en la Tabla S1).
Estos 252 genes fueron clasificadas-rango en función de la magnitud del coeficiente de correlación. El número de genes en el "clasificador de pronóstico 'se optimizó mediante la adición secuencial subconjuntos de 5 genes de la parte superior de esta lista ordenada y evaluar su poder para la clasificación correcta utilizando el método de" dejar uno fuera "para la validación cruzada. La clasificación se hizo con base en la correlación de los niveles de expresión de las restantes muestras de los pacientes buenos y malos, respectivamente. La precisión mejorada hasta que se alcanzó el número óptimo de genes marcadores. Por lo tanto, 74 genes se determinó que el número mínimo de genes que podrían ser calificadas como de dos subgrupos de diferente pronóstico (Figura 4). Con un valor de AUC de 0,565 (IC del 95% 0,305-0,825) que indica una prueba perfecta, la sensibilidad y especificidad de diagnóstico de la curva ROC se calculó en 70% y 80%, respectivamente (Figura 5).
cada columna representa un tumor y cada fila un gen.
Sobre la base de la clasificación de la función de genes ontología (GO), la anotación funcional de los genes implicados en el ciclo celular, la invasión y la metástasis, la angiogénesis y la transducción de señales son upregulated significativamente en el mal pronóstico firma (anotación de los genes enumerados en la tabla S1). Estos genes incluyen varios grupos para los que la función de anotación proporciona información sobre el mecanismo biológico subyacente que conduce a las funciones clave implicados en la tumorigénesis y progresión. Los genes implicados en el ciclo celular, la invasión y la metástasis, la angiogénesis y la transducción de señales se significativamente expresados diferencialmente entre dos firmas (por ejemplo, GKN1, INHBA, SPP1 y THBS4). Mientras tanto, el análisis de conglomerados sin supervisión distingue entre diferentes tumores de pronóstico. Mediante la evaluación de los 74 genes indicadores de pronóstico, más genes que pertenecen a estas categorías funcionales se hacen evidentes (por ejemplo, GKN1, GKN2, GIF, PSCA y LIPF).
Los pacientes de los dos grupos clasificados por los 74 genes y enteros las sondas son casi iguales, excepto por el LCM muestra, que se clasifica en el grupo de buen pronóstico en todo el sondas de microarrays y en el grupo de mal pronóstico en la clasificación 74-gen. La muestra LCM se recogió del tejido maligno de un paciente que sufre de adenocarcinoma mucinoso en la etapa IV con una vida útil más corta que los otros pacientes en los grupos formales. Por lo tanto, la clasificación de microarrays 74-gen podría ser más fiable.
Verificación de los 74 genes de matriz personalizada y la correlación de los datos de microarrays con el perfil de pronóstico
En los 11 pacientes incluidos en el GC estudio anterior [12], se calculó el coeficiente de correlación del nivel de la expresión de los 74 genes con el perfil promedio medido de estos genes en los tumores de pacientes con buen pronóstico (CI). Un paciente con un coeficiente de correlación de más de -0.007 (el umbral dio lugar a una tasa de 13 por ciento de resultados falsos negativos) y luego fue asignado al grupo con la firma de buen pronóstico, y todos los demás pacientes fueron asignados al grupo con los pobres -prognosis firma (Figura 6). Además, la curva de supervivencia de los dos grupos varía notablemente (p & lt; 0,05) (Figura 7). Por lo tanto, el clasificador mostró un rendimiento comparable sobre la validación de los 11 tumores esporádicos independientes y confirmó la capacidad de predicción y la robustez de la clasificación de pronóstico de la matriz personalizada 74-gen.
La línea amarilla marca la subdivisión en dos dominante grupos por análisis de conglomerados en dos dimensiones. La línea blanca marca la subdivisión en dos grupos dominantes con sensibilidad optimizada.
El eje X indica los meses en los que los pacientes siguen vivos. El eje Y indica que el porcentaje de pacientes vivos (incluyendo los que tienen metástasis o recurrencia).
La reproducibilidad de personalizar mini-serie
Para validar los datos de expresión de genes de los datos de microarrays, se optó por un gen diferenciada-expresión, INHBA, y examinaron su expresión con el análisis de RT-PCR cuantitativa. Nuestros datos muestran que el gen cambió significativamente la expresión en los tejidos malignos en comparación con los tejidos premalignos en 11 muestras de pares emparejados, consistente con los resultados obtenidos del análisis de microarrays (Figura 8).
Los números verticales con registro
2 transformación son la relación agrupan por parejas de las lesiones malignas de las lesiones premalignas. A. Las columnas representan los coeficientes derivados de experimento cuantitativo QRT-PCR. B. Comparación de las relaciones entre los microarrays y QRT-PCR cuantitativa análisis.
Un subgrupo de reproducción genes asociados con el cáncer gástrico
En la lista personalizada de microarrays de 74 genes, encontrado un grupo de genes con la clasificación GO de la reproducción (Tabla 2), en la que 5 genes para los receptores de hormonas sexuales y las vías (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 y FOXL2), no sólo podrían separar eficazmente malignas a partir de muestras pre-malignas sino también clasificar pobre y buen pronóstico con la agrupación jerárquica y SVM (Figura 9). Además, dos genes de la hormona del sexo tenían expresión differentiated- significativa de buen pronóstico de mal pronóstico de GC (8,83 ESRRG, AR 0,37, p & lt; 0,01).
Símbolo
doble cambio
Símbolo
Fold change
AMHR20.442DMRT34.8637INHBA11.2072DMRTA10.366MMP142.009SFRP413.0683NOTCH12.2898FOXL23.291PGF2.9307SPP19.4141Table . 2. Los genes con GO clasificación de la reproducción en 74 genes de microarrays grupo
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Las expresiones de genes entre dos grupos tienen diferencias significativas, doble registro de cambios
2 & gt; = 1 o & lt; = - 1, p. & lt; 0,01
Discusión
en el presente estudio, se presenta por primera vez que la costumbre de microarrays podría ser un método eficaz para el diagnóstico y la predicción del pronóstico en GC clínicamente. A falta de biomarcadores clínicos para el cáncer gástrico temprano sin ningún tipo de síntomas tempranos específicos conduce a retraso en el diagnóstico y contribuye a la elevada mortalidad de cáncer gástrico [23]. En algunos casos, los cambios sólo se manifiestan a nivel de genes, sin ningún cambio patológico. Los cambios en la expresión génica podría ayudar en el diagnóstico precoz, el pronóstico y el tratamiento guía para la radiación postoperatoria y quimioterapia. El desarrollo de las tecnologías de microarrays permite el estudio de la posibilidad de reversión patológica y la evaluación y la orientación de la terapia. Además, la creación de equipos microarray dirigida podría hacer la técnica más útil. Debido a la poca especificidad y la deficiencia de diagnóstico conjunto madura, la costumbre de microarrays no se ha aplicado en la práctica clínica para el cáncer gástrico, sin embargo, aunque hay estudios en diagnóstico genético.
Análisis de microarrays es una tecnología ampliamente utilizada para el estudio de la expresión génica en una escala global. Varios ensayos moleculares empleadas actualmente en la evaluación clínica de los cánceres se derivan de perfiles de expresión génica basada en microarrays. Un ejemplo de un ensayo basado en microarrays es MammaPrint, una costumbre de microarrays de 70 genes asociados con el riesgo de que el desarrollo temprano de metástasis a distancia en pacientes jóvenes con ganglios linfáticos negativos de cáncer de mama. MammaPrint ha sido ratificado por la FDA. La capacidad de utilizar este perfil en un entorno de diagnóstico rendimiento alto podría ser una gran ventaja en el pronóstico y tratamiento del cáncer de mama [17-19]. Sin embargo, la tecnología está en la actualidad no se utiliza como una herramienta de diagnóstico de rutina en el cáncer gástrico, y no ha habido ningún estudio de microarrays personalizados utilizados en el diagnóstico o predicción de pronóstico. En este informe, hemos demostrado por primera vez que la costumbre mini-array puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico fiable en el cáncer gástrico.
En este trabajo se describe el desarrollo de un cáncer gástrico mini-serie de diagnóstico personalizado y describir su uso en un entorno fiable de diagnóstico. Muchos estudios clínicos han correlacionado alteraciones en la expresión de genes individuales con el resultado del cáncer gástrico, a menudo con resultados contradictorios. Los ejemplos incluyen CXCL1, HOXA10, y la metilación de PCDH10 [24-26]. Sin embargo, estos genes no se incluyeron en nuestro mini-matriz. Es posible que los otros estudios prestado más atención a las funciones de estos genes, mientras nos centramos en las expresiones de ARNm. La matriz personalizada 74-gen puede ser una posible herramienta de predicción para el cáncer gástrico. Los datos demuestran claramente la reproducibilidad y robustez de la pequeña microarray medida. El uso de un microarray de encargo podría proporcionar varias ventajas, tales como información precisa sobre el riesgo de recurrencia en comparación con los criterios clínicos convencionales, y por lo tanto mejorará la orientación para el requisito de la terapia adyuvante.
Mientras tanto, a causa de un 2 veces mayor incidencia en los hombres que en las mujeres con cáncer gástrico [1], varios estudios epidemiológicos más grandes sugieren que el género era un factor pronóstico independiente de la supervivencia global en pacientes con cáncer gástrico [27,28 ] y predominio masculino de cáncer gástrico se correlaciona con un retardo de 10 a 15 años en la aparición de cáncer gástrico de tipo intestinal en las mujeres en comparación con hombres [29]. En este perfil de los 74 genes de encargo mini-serie, 5 genes fueron expresados diferencialmente entre lesiones malignas y premalignas de lesiones GC (ESRRG, DMRT3, DMRTA1, AMHR2 y FOXL2). fue propuesto por primera vez este grupo de genes asociadas al sexo con posibles funciones en GC, y hay pocos estudios sobre este grupo de genes asociados con el cáncer. Es importante notar que el último estudio reportado por Matson y sus colegas mostraron una posible asociación y la vía de DMRT1, FOXL2 y la hormona de género [30]. DMRT1, DMRT3, y DMRTA1 están incluidos en un grupo de la familia de genes que tienen un motivo de zinc (dominio DM) de unión a ADN de dedo en común, que también es un regulador clave de desarrollo de los machos en las moscas y nematodos. Por otra parte, los principales genes en esta vía están incluidos en nuestros datos. Los datos nos pueden proporcionar con una dirección de investigación de genes asociadas al sexo en GC y revelar una posible vía y el mecanismo de cancerización GC.
Por lo tanto, la matriz puede ser una excelente herramienta para la clasificación y la predicción del resultado de la enfermedad en pacientes con cáncer gástrico. Sin embargo, hay algunas limitaciones en nuestro perfil. Las muestras deben ampliarse para verificar la validez clínica y la reproducibilidad.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Cuarenta resecado quirúrgicamente especímenes de cáncer gástrico y las muestras no tumorales adyacentes eran obtenida de Sir Run Run Shaw del hospital, Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang y se utilizaron durante junio de 2007 a mayo de 2011. se recogieron tejidos malignas y premalignas de diferentes regiones del estómago resecado de cada paciente que se sometió a la cirugía. Cuarenta muestras de tejidos agrupados de veinte pacientes con cáncer gástrico primario sometidos a cirugía (veinte lesiones malignas, lesiones premalignas veinte) fueron escogidos para el análisis de microarrays de oligonucleótidos (Tabla 1, los datos detallados en la tabla S2). Todas las muestras fueron recogidas fijas, empotradas, teñidas con H & amp; E y diagnosticados con Lauren y de clasificación de la OMS de forma independiente por tres patólogos profesionales. Doce muestras pareadas con lesiones malignas y premalignas de los pacientes que se sometieron a cirugía fueron elegidos para cuantitativa PCR con transcripción inversa (RT-PCR cuantitativa). Los resultados de RT-PCR cuantitativa se compararon con los registros patológicos de la institución que contribuye. análisis patológico final se determinó por consenso y, si procede. "Maligno" se refiere a varios tipos de cánceres gástricos. "Premalignas" indica gastritis atrófica, metaplasia y /o displasia intestinal. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior procesamiento. escrito el consentimiento informado se obtuvo antes de la recogida de muestras, y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital Sir Run Run Shaw.
personalizada Mini-Array
El original personalizado 8 * 15k mini-array contenía 1042 genes canceración y pronóstico relacionado idénticas a las sondas en la matriz original [12]. La mini-serie incluye 696 genes expresados diferencialmente entre lesiones malignas y lesiones premalignas de pacientes con cáncer gástrico que encontramos en los anteriores 38, 500 chips de genes, 44 genes relacionados con el colágeno, 54 genes para los receptores de hormonas sexuales y las vías, y los genes diferenciada de expresión que se encuentran en otros estudios que fueron vistos por triplicado. Cada matriz también incluye 1042 sondas de hibridación y el control de calidad de impresión, así como 915 genes de normalización (datos detallados en la Tabla S1). Ocho idénticos mini-matrices están presentes en una sola diapositiva 1 "x 3", lo que permite ocho hibridaciones individuales que se realizan simultáneamente (personalizado en Shanghai BioChip Co. Ltd., Agilent Technologies).
microarrays de oligonucleótidos
El ARN total fue extraído y purificado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemania) a través de los procedimientos estándar recomendados por los fabricantes. Los niveles y cualidades de cRNA se midieron mediante un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, EE.UU.), y la calidad de RNA se controló por la norma 2100 RIN & gt; = 7,0 y 28S /18S & gt; = 0,7. El cRNA se fragmentó con el módulo de limpieza de la muestra de Gene Chip (Affymetrix, EE.UU.) y se marcó con un solo color utilizando el método de notación agrandar Agilent. Hibridación, lavado, tinción y escaneo procedimientos se llevaron a cabo como se describe en el análisis de expresión génica de la viruta manual técnico (Affymetrix, EE.UU.).
Análisis de los datos de microarrays de oligonucleótidos
Los resultados de los microarrays fueron escaneada por un escáner de Agilent. Los datos se normalizaron y conversaron después de la adquisición de imágenes y cuantificación de identificar los genes con expresiones diferenciales significativos utilizando el software de extracción de características. Se ha realizado una fuente abierta lenguaje de programación interpretado (R) para el cálculo y gráficos estadísticos [12]. Los datos en bruto de microarrays personalizada se ha subido a la ArrayExpress el número de registro A-MEXP-2338.
Diseño del estudio
Se utilizó un método basado en los perfiles de expresión de genes para clasificar tipos de cáncer gástrico en categorías de pronóstico o de diagnóstico. El método incluye los siguientes pasos: (1) el diseño de un mini-matriz personalizada con un grupo de genes posiblemente relacionados con la cancerización GC y el progreso sobre la base de estudios previos, (2) la selección de los genes de expresión diferenciada entre lesiones malignas y premalignas (fold cambio & gt; 2 veces y p & lt; 0,05) (3), sin supervisión análisis de conglomerados en dos dimensiones de la agrupación de genes y la agrupación GC realizado de forma independiente utilizando un algoritmo de agrupamiento jerárquico de aglomeración (4), la selección de discriminar genes candidatos de genes seleccionados en el paso 2 de acuerdo su correlación con la categoría (bien o mal pronóstico) (5), la determinación del conjunto óptimo de genes indicadores que utilizan un procedimiento de validación cruzada de dejar uno de salida (6), la predicción de pronóstico o diagnóstico basado en la expresión de genes de la óptima conjunto de genes informadores [18,19], (7) GO anotación de los genes reportero, y (8) el análisis de correlación de los datos de microarrays con el perfil de pronóstico
análisis cuantitativo de RT-PCR
el ARN total extraído de muestras se transcribió inversamente en cDNA utilizando el primer guión TM RT kit de reactivos (Takara, Japón) a 37 ° C durante 15 min y a 85 ° C durante 15 s. Las reacciones de PCR usando el kit SYBR premis EX Taq TM se realizaron a 95 ° C durante 30 segundos seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 10 seg, y 72 ° C durante 40 seg con el 7500 Real- hora del sistema de PCR (Applied Biosystems, EE.UU.). La limpieza de genes β-actina sirvió como control interno. La secuencia de cebador directo de INHBA es GTGATGGCAAGGTCAACATCT, y el reverso es GCGGTAGTGGTTGATGACTGT.
El análisis estadístico
Se utilizó riesgos proporcionales de análisis de regresión para ajustar la relación entre el coeficiente de correlación (CI) y metástasis por otras variables. El p-valores asociados a los odds ratios se calculan utilizando la prueba exacta de Fisher.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
La información de los genes en los pasos de los métodos para el diseño de la mini-serie y los últimos 74 genes de mini-array.
doi: 10.1371 /journal.pone.0081561.s001 gratis (XLS)
Tabla S2. Empresas El detalle de la información de las lesiones de microarrays.
doi: 10.1371 /journal.pone.0081561.s002 gratis (DOC)