Extracto
ácido lisofosfatídico (LPA) juega un papel crítico en la proliferación y migración de células de cáncer de colon; Sin embargo, los eventos de señalización que subyacen a estos procesos siguen siendo mal caracterizado. El objetivo de este estudio fue investigar las vías de señalización desencadenadas por LPA para regular los mecanismos implicados en la progresión del cáncer colorrectal (CRC). Hemos utilizado tres modelos de líneas celulares de CRC, e inicialmente analizado el perfil de expresión de los receptores de LPA (LPAR). A continuación, se trataron las células con LPA y eventos relacionados con su potencial tumorigénico, como la migración, invasión, crecimiento independiente de anclaje, la proliferación, así como el ciclo celular y la apoptosis fueron evaluados. Se utilizó la técnica de matriz de chip para analizar el perfil de expresión génica global que se produce después del tratamiento LPA, y se identificaron de señalización celular vías relacionadas con el ciclo celular. La inhibición de estas vías verificó las conclusiones del análisis de transcriptómica. Se encontró que las líneas celulares expresaron LPAR1, -2 y -3 de manera diferencial y que 10 M LPA no afectó la migración celular, invasión y crecimiento independiente de anclaje, pero indujo la proliferación y la progresión del ciclo celular en las células HCT-116 . Aunque LPA en esta concentración no indujo actividad transcripcional de β-catenina, que promueve la activación de Rho y STAT-3. Por otra parte, los inhibidores de ROCK y STAT-3 prevenir la proliferación LPA inducida, pero la inhibición ROCA no impidieron que la activación de STAT-3. Finalmente, se observó que LPA regula la expresión de genes relacionados con el ciclo celular y que la inhibición combinada de roca y STAT-3 impedido la progresión del ciclo celular y aumentó la expresión inducida por LPA de las ciclinas E1, A2 y B1 en un grado mayor que ya sea inhibidor solo. En general, estos resultados demuestran que el LPA incrementa el potencial proliferativo de las células de adenocarcinoma de colon HCT-116 a través de un mecanismo que implica la cooperación entre las vías Rho-ROCK y STAT3 implicadas en el control del ciclo celular
Visto:. Leve M, Peres- Moreira RJ, Binato R, e Abdelhay, Morgado Díaz-JA (2015) LPA induce la proliferación celular del cáncer de colon a través de una cooperación entre la roca y STAT-3 Rutas. PLoS ONE 10 (9): e0139094. doi: 10.1371 /journal.pone.0139094
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de Estados Unidos |
Recibido: 15 de Junio, 2015; Aceptado: 9 de septiembre de 2015; Publicado: 29 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Leve et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo a la Pesquisa do Estado de Río de Janeiro (FAPERJ) y el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología del cáncer-em INCT (573.806 /2008-0 y 170.026 /2008) para JAMD; y la Fundación Carlos Chagas Filho de Amparo a la Pesquisa do Estado de Río de Janeiro (FAPERJ) (26/11703/2013) para JAMD
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ácido lisofosfatídico (LPA) es una forma natural bioactivo presente lisofosfolıpido en la mayoría de los tejidos y fluidos biológicos. LPA puede ser generado por ambos lisofosfolipasa D (liso-PLD), tales como autotaxina (ATX), o por medio de la fosfolipasa A1 o A2 (PLA1 y PLA2, respectivamente) [1]. ATX fue identificado primero en el melanoma maligno como un factor quimiotáctico necesario para el melanoma invasividad [2], y ATX /liso-PLD se expresan de manera aberrante en muchos cánceres humanos y en la enfermedad inflamatoria intestinal [1,3]. Por otra parte, se han encontrado altos niveles de LPA en el fluido ascítico y plasma de pacientes con cáncer de ovario [4]; Del mismo modo, se han encontrado altos niveles de lisofosfatidilcolina (LPC), un precursor de LPA, en el plasma de cáncer colorrectal (CRC) de los pacientes [5]. Aunque el aumento de los niveles de LPA en los fluidos de pacientes con CRC todavía no se ha demostrado directamente, Lin
et al
. [6] han demostrado que la administración oral de LPA a Apc
Min /+ ratones, que es un modelo ampliamente utilizado en la CRC, casi se duplicó el número de pólipos en el intestino. En conjunto, estos estudios apoyan la idea de que el LPA desempeña un papel importante en la patología CRC, que es el tercer tipo de cáncer más frecuente en hombres y la segunda más frecuente en las mujeres en todo el mundo [7].
A través de su unión a G específica receptores acoplados-proteína-(GPCRs), LPA media muchas respuestas biológicas en el cáncer. En las células de CRC, LPA aumenta la proliferación [8], la protección de la apoptosis [9], la migración [10] y la adaptación a la hipoxia [11]. Es bien aceptado que la respuesta celular a LPA depende del patrón de expresión de LPA receptores (LPAR), ya que varía ampliamente entre los diferentes tejidos y tipos celulares. Actualmente hay seis LPAR reconocidos, LPA
1-6, que se sobreexpresan en diferentes tipos de cáncer, incluyendo CRC [12,13,14]. Entre estos LPAR, los clásicos LPAR bien conocidos, LPA
1-3, pertenece al gen de la diferenciación de células endoteliales (EDG) la familia de GPCRs y se han descrito para regular diferentes comportamientos en las células de CRC. Por ejemplo, mediante el uso de la interferencia de ARN específica, se ha demostrado que LPA
2 y LPA
3 pero no LPA
1 son objetivos para la proliferación inducida por LPA de HCT-116 y LS174T [8]. Además, se demostró que LPA
1 media la dispersión celular estimulada por LPA de células DLD-1 usando un sistema de shRNA-lentivirus [15]. Por otra parte, LPA
3 caída aumenta la migración y la invasión de células HCT-116 [16].
LPAR desencadenan una serie de vías de señalización corriente abajo. Es bien establecido que el LPA produce respuestas citoesqueleto Rho-dependientes tales como la formación de fibras de estrés [17], que son estructuras relacionadas con la migración de células. De hecho, hemos demostrado que en células Caco-2, la migración celular inducida por LPA es dependiente de Rho-ROCK [10]. Además, también se informó de señalización Rho-ROCK jugar un papel en la regulación de la proliferación celular [18]. Aunque algunos estudios ya han demostrado que LPA estimula la proliferación de células de cáncer de colon, como HCT-116 y SW480 [8,19], la participación de señalización Rho-ROCK en este evento fue que no se tratan.
El transductor de la señal y activador de la transcripción 3 (STAT-3) es un factor de transcripción que participan en los procesos de la tumorigénesis. Constitutiva de activación STAT-3 está asociada con varios cánceres humanos y comúnmente sugiere mal pronóstico [20]. Se ha demostrado previamente que el rock estimula la activación de STAT-3 a través de Janus quinasa 1 (JAK 1); STAT-3 y JAK 1 cooperan para controlar la contractilidad actomiosina para mediar en la migración ameboide redondeada en células de melanoma [21]. Además, se observó que LPA induce la motilidad celular a través de STAT-3 fosforilación en células de cáncer de ovario [22]. Curiosamente, la fosforilación de STAT-3 está implicada en HCT-116 el crecimiento de células de cáncer de colon [23]. Sin embargo, se desconoce si LPA activa STAT-3 en las células de CRC o provoca la activación de la participación de Rho-ROCK en esta vía de señalización.
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue analizar el papel que desempeña en la LPA diferentes procesos biológicos de la progresión de la CRC, como la migración, invasión y proliferación, y para determinar los mecanismos subyacentes a estos eventos. Aquí, hemos demostrado que LPA incrementa la proliferación de células HCT-116 a través de una cascada que integra RhoA-ROCK y la señalización de STAT-3 para controlar la expresión de ciclina y la progresión del ciclo celular.
Materiales y Métodos
Anticuerpos y reactivos
L-α-lisofosfatídico ácido (cat oleoil de sodio no L7260..), de conejo anti-LPA
1 (N-terminal; cat. No. SAB4500689), de conejo anti-LPA
2 (cat. no. HPA019616), de conejo anti-LPA
3 (cat. no. HPA013421), anti-ciclina B1 (cat. no. SAB4503501), dihidrocloruro de 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI ;.. Cat no 32670) y peroxidasa de rábano picante conjugado de cabra anti-conejo y anti-IgG de ratón se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.). monoclonal de conejo anti-STAT-3 (cat nº 9139..), monoclonal de ratón (pTyr 705..; cat nº 9131)-fosfo-STAT3 anti, policlonal de conejo anti-tubulina α (cat nº 2.144..), anticuerpo monoclonal anti conejo -GSK-3β (cat nº 9315.), anti-fosfo-GSK-3β (pSer9;.. cat nº 9336)., monoclonal de ratón anti-β-catenina (.. cat nº 9582) y anti-GAPDH (nº de cat . 2118) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.). STA-21 ((S) -Ochromycinone deoxytetrangomycin;.. Cat no sc-200 757), anti-ciclina A2 (.. Cat no sc-596) y el ratón anti-ciclina E1 (.. Cat no sc-247) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE.UU.). El Alexa 488-conjugado anticuerpo secundario (cat. No. A11008) se obtuvo de Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Y-27632 ((R) - (+) - trans-N- (4-piridil) -4- (1-aminoetil) ciclohexancarboxamida; Cat. No US1688000). Se adquirió de Calbiochem EMD Millipore (Darmstadt, Alemania)
cultivo de células y tratamientos LPA
las líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2 (HTB-37TM) y HT-29 (HTB-38TM), el colorrectal humano línea celular de carcinoma HCT-116 ( CCL-247TM) y la línea celular de cáncer de ovario OVCAR-3 (HTB-161) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Las células de cáncer de colon se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), penicilina G (60 mg /L) y estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 /aire. Las células se pasaron semanalmente con 0,05% de tripsina /0,02% de EDTA en solución de PBS. Las células de adenocarcinoma de ovario se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich), que fue suplementado con 20% FBS, penicilina G (60 mg /L) y estreptomicina (100 mg /L) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 /aire. las células Caco-2 tienen un fenotipo diferenciado cuando forman una monocapa confluente, con bajo potencial invasivo y metastásico; las células HT-29 están moderadamente diferenciado, mientras HCT-116 células tienen un fenotipo indiferenciado y alto potencial tumorigénico. Por lo tanto, estas células representan diferentes etapas de la progresión CRC. Los cultivos celulares se cambiaron a medio libre de suero durante 24 h antes del tratamiento de LPA 10 M, como se informó anteriormente [10].
inhibidores farmacológicos selectivos se añadieron a los cultivos de células de 1 h antes del tratamiento y LPA estaban presentes durante todo el tratamiento como se indica. Los inhibidores se diluyeron en DMSO y se almacenaron a -20 ° C. Cada solución concentrada se diluye inmediatamente antes de su uso para dar concentraciones finales de 10 mM de Y-27632 (ROCK) y 10 mM STA-21 (STAT-3).
Western-blot análisis
La células tratadas se homogeneizaron en tampón de lisis (Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,2% SDS, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 1%) que contiene NaF 20 mM, ortovanadato 1 mM, y una cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, MO, 1: 100 dilución) durante 30 min a 4 ° C. Los lisados homogeneizadas fueron sometidas a centrifugación a 10.000 g durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80 ° C para el análisis subsiguiente. Cantidades iguales de proteína (30 a 60 g /carril), cuantificado por el kit de ensayo de proteínas BCA (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.), se prepararon hirviendo después de la adición del tampón de muestra de desnaturalización; fueron separados por electroforesis por SDS-PAGE en 7,5, 10 o 12% de geles y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando una célula de transferencia semi-seco (BioRad) a 10 V durante 60 min. Las membranas se bloquearon durante 1 h con TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 137 mM y 0,1% de Tween-20) que contiene 5% de leche descremada en polvo o con 1% de BSA (Sigma); se incubaron durante la noche con los siguientes anticuerpos primarios: anti-LPA
1 (1: 500), anti-LPA
2 (1: 500), anti-LPA
3 (1: 500), anti -α-tubulina (1: 1.000), anti-GAPDH (1: 3.000), anti-β-catenina (1: 1.000), anti-GSK3-β (1: 1.000), anti-fosfo-GSK3-β (Ser9 ) (1: 1000), anti-STAT-3 (1: 1.000), anti-fosfo-STAT-3 (Tyr 705) (1: 1000), anti-ciclina A2 (1: 2.000), anti-ciclina E1 ( 1: 2000) y anti-ciclina B1 (1: 2000). Después del lavado, las membranas se incubaron durante 1 h con conjugado de peroxidasa de cabra anti-conejo o anti-ratón-IgG (1: 5000). A continuación, las membranas se lavaron, y las bandas de proteína se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK). Las imágenes de la banda de tres experimentos independientes fueron cuantificados por la densidad óptica utilizando LabWorks de software 4.6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
se determinaron RhoA ensayo de activación
Las actividades de la proteína Rho utilizando un G-LISA específica
TM
Ensayo de activación de RhoA Biochem Kit
TM (citoesqueleto, CO, EUA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, Rhotekin RBD unido a las placas se utilizó para precipitar unido a GTP Rho a partir del lisado celular. El RhoA activo se detectó usando un anticuerpo específico contra Rho y se visualizó utilizando una reacción de quimioluminiscencia. El nivel de activación se midió con la absorbancia ajustado a 490 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
cicatrización de heridas ensayo
monocapas de células se privaron de suero durante 24 h, se trató con LPA y rayado utilizando una punta de pipeta estéril. Para cada plato, tres heridas fueron hechas manualmente, y los tres sitios regulares de la herida fueron verificados bajo un microscopio Axio Observador Z1 (Carl Zeiss, Inc., Jena, Alemania) equipado con un Axio Cam HRc y un Axio Vision Release 8.2 Analizador de Imagen; las heridas fueron seleccionados y marcados. Después de lavar con PBS, se añadió medio fresco que contenía los inhibidores de las células, que se incubaron a 37 ° C en DMEM libre de suero que contiene 10 mM LPA. se permitió Las células no tratadas y tratadas para migrar a la zona de la herida y se fotografiaron tanto inmediatamente después de la herida (0 h) y 24 h después de la herida. La distancia entre los dos bordes de la lesión se cuantificó usando Adobe Photoshop 6.0 a partir de tres experimentos independientes. Los valores son representados como porcentajes y se representan en el gráfico.
ensayo de invasión
Para probar invasión de células tumorales, un transwell con un filtro de policarbonato de 6,5 mm (8 micras de tamaño de poro, Cat. No. 3422; Costar, Cambridge, MA) se revistió con 20 l de Matrigel® (Cat no 356230;.. BD Biosciences, San Diego, CA) diluido en DMEM (01:10) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Caco-2 (2,5 x 10
4), HT-29 (2 x 10
4), HCT-116 (2 x 10
4) y OVCAR-3 (2 x 10
4) células, en 200 l de medio libre de suero con LPA, se sembraron en la cámara superior de la transwell. El medio de cultivo con 20% de FBS se añadió como un quimioatrayente en la cámara inferior. Después de 48 h de incubación, la superficie superior de la membrana se frotó con un hisopo de algodón. Las células invadidas en la membrana inferior se fijaron en etanol durante 10 min y se tiñeron con cristal violeta. El número de células tratadas y no tratadas invadidos se expresó como la media de cuatro campos aleatorios bajo el microscopio. Los valores son representados como porcentajes y se representan en el gráfico. se utilizó OVCAR-3 como control positivo de la eficacia de LPA.
independiente del anclaje crecimiento
Caco-2, HT-29 y células HCT-116 se sembraron en una placa de 12 pocillos ( previamente cubierto con 1 ml de 0,6% de agarosa semi-sólido) a una densidad de 250 células /pocillo en una solución de DMEM que contiene 10% de SFB y 0,3% de agarosa durante 30 min. DMEM con 10% de FBS que contenía ya sea LPA o no contenía LPA (control) se añadió a la parte superior de la solución semi-sólido y se renovó cada 3 días. Después de 14 días, las colonias formadas se obtuvieron imágenes y se contaron usando un Observador Z1 Axio (Carl Zeiss, Inc.) microscopio equipado con una cámara Axiocam MRC5.
La viabilidad celular análisis
HT-29 ( 1x10
3 células /ml) y HCT-116 (2 x 10
4 células /ml de células) se sembraron y cultivaron en placas de 96 pocillos y, después de la depleción de SFB, se trata con una de las siguientes soluciones: 10 M LPA solo, 10 mM STA-21, 10 M y-27632, o LPA en combinación con estos inhibidores para los tiempos indicados antes de la incubación con MTT (Sigma Chemical Co.). Las células se mantuvieron durante 2 horas a 37 ° C y se centrifugaron a 1500 g durante 5 min. El sobrenadante se eliminó, y los cristales se disolvieron en DMSO. La absorbancia a 538 nm se midió con un Spectra Max 190 espectrofotómetro (Molecular Devices Sunnyvale, CA).
proliferación de las células de ensayo
El método violeta de cristal se utilizó para medir la proliferación celular. Caco-2 (2x10
4 células /ml), HT-29 (10
3 células /ml) y HCT-116 (2x10
4 células /ml), las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y fueron FBS-agotado y tratada como se indica con LPA y los inhibidores de STAT-3 y el rock durante 24, 48 y 72 horas y se fijaron con etanol durante 10 min. Se añadió la solución de cristal violeta (0,05% de cristal violeta y 20% de metanol) durante 10 min. Las células se lavaron dos veces con agua y luego se solubilizaron con metanol. La absorbancia a 595 nm se midió con un espectrofotómetro Spectra Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los valores se representan como porcentajes y se representan en el gráfico.
apoptosis y análisis de supervivencia gratis (10
5-10
6 células
HT-29 y células HCT-116 /ml) se cultivaron en placas de microtitulación de seis pocillos y se privaron de suero durante 24 h. Después, fueron tratados durante 24, 48 y 72 h con LPA 10 mM. La apoptosis se detectó mediante un yoduro de propidio (PI) tinción ensayo /anexina V para detectar células apoptóticas temprana, células apoptóticas tarde, y las células no apoptóticas en los tiempos indicados. Las células se lavaron en PBS enfriada con hielo y se resuspendieron en 100 l de anexina V tampón (0,1 M Hepes /NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, CaCl 25 mM
2) que contiene la anexina V-FITC y PI (unión 1 mg /ml) durante 15 min. Un análisis FACS se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur y el software CellQuest (BDBiosciences, San Jose, CA, EE.UU.); las células negativas tanto para anexina V y PI se consideran viables (supervivencia).
Análisis del ciclo celular
células HCT-116 (10
5-10
6 células /ml ) se cultivaron en placas de microtitulación de seis pocillos fueron FBS agotado y se trataron durante 8, 12 y 16 h con LPA y /o inhibidores de STAT-3 o roca. Después de este período, las células se recogieron por tripsinización y se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo. Las células fueron teñidas en la oscuridad con 75 yoduro mu M de propidio (Sigma) durante 10 min en un tampón que contiene 3,4 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 10 mM, 0,2% de Triton X-100 y 3500 U /L de RNAsa. Un análisis del contenido de ADN se realizó mediante la recopilación de 10.000 eventos para el análisis del ciclo celular y sub-G1 usando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Transduction Labs, Lexington, KY, EUA) y Mod Fit LT software.
Inmunofluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos que habían sido colocadas en placas de 24 pocillos con antelación. Después de agotamiento y el tratamiento de FBS, las células se lavaron en PBS suplementado con CaCl 100 mM
2 y 100 mM MgCl
2 (PBS /CM) y se fijaron en 100% de metanol durante 20 min. Las muestras se permeabilizaron con 0,5% TX-100 en PBS durante 10 min. Más tarde, se incubaron las células en mM NHCl 50
4 en PBS durante 10 min y se bloquearon en BSA al 3% durante 1 h. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios, anti-β-catenina (1: 250) y anti-STAT3 (01:50) para 1 h, seguido de una hora adicional de incubación con secundario Alexa 488-conjugado anti-conejo o anti -mouse anticuerpos. A continuación, las células se incubaron con dihidrocloruro de 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1: 1000) durante 3 min. Los cubreobjetos se lavaron en PBS y se montaron con
n
propil-galato, y la tinción de células se detectó usando un microscopio de inmunofluorescencia Axio Observador Z1 equipado con una cámara Axiocam HRc Rev. 3 y una liberación Axiovision 4.8. 1 programa analizador de imagen (Carl Zeiss Inc., Alemania) |
ensayo de luciferasa para la actividad TCF
dos genes informadores de luciferasa diferentes TCF se utilizaron en este ensayo:. un intacta de tipo salvaje TCF-luciferasa constructo indicador (SUPER 8 TOPFLASH) y un mutado TCF-luciferasa constructo indicador (SUPER 8 FOPFLASH), que se utilizó como control negativo. HCT-116 (2x10
4) células se sembraron en placas de seis pocillos y se transfectaron de forma transitoria con 2 g de la SUPER 8 TOPFLASH o FOPFLASH plásmido reportero, junto con 3 l de la FUGENE® 6 reactivo de transfección (Roche). Como control para la eficiencia de la transfección, 0,2 g de un constructo de luciferasa Renila se incluyó en cada transfección. Después de 24 h de transfección, las células se lavaron dos veces con PBS, FBS agotado durante 24 horas y después se trató con LPA 10 mM. Las células se recogieron 6 y 24 h después de la transfección, y los extractos se prepararon con 200 l de tampón de lisis reportero (Promega). la actividad de luciferasa Renila y se ensayaron de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando un Sistema de Kit Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). La actividad luciferasa en cada pocillo se normalizó a la actividad renila. Tres experimentos independientes, cada uno ensayaron por triplicado, se realizaron en pases de células separadas.
Expresión chip de datos de la matriz de análisis
El ARN total de las células agotadas FBS-HCT-116 que fueron tratados o no con cualquiera LPA durante 12 h se obtuvieron usando un RNeasy Mini Kit (QIAGEN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Cien nanogramos de ARN total fue utilizado para sintetizar la biotina cRNA de acuerdo a la transcripción entera (WT) ensayo de sentido objetivo-etiquetado GeneChip (
Affymetrix
,
EE.UU.
). Después, la biotina cRNA se hibridó con el gen humano GeneChip 1,0 array ST (
Affymetrix
,
EE.UU.
), se lavó y se tiñeron según los protocolos del fabricante. Los GeneChip arrays fueron escaneados utilizando un escáner GeneChip ® 3000. La expresión Affymetrix consola de Software Version 1.0 se utilizó para crear los valores de expresión resumidos (CHP-files), y se aplicó el sólido análisis multichip (RMA) algoritmo. Los datos fueron analizados utilizando Partek
® software (http://www.partek.com) [24]; los genes expresados diferencialmente con ≥ 2 veces de cambio se utilizaron como los criterios para definir la sobreexpresión o regulación a la baja. Los procesos de análisis de ruta y afines se obtuvieron utilizando MetaCore
TM software (http://thomsonreuters.com/metacore) e ingenio
® software de análisis de vías de entrada (http://www.ingenuity.com).
El análisis estadístico
El análisis estadístico de los tres experimentos independientes se realizó utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Los análisis estadísticos de la migración, invasión, crecimiento independiente de anclaje, la actividad TCF y la densidad óptica de proteínas se realizaron mediante pruebas t de Student; el análisis del ciclo celular se realizó mediante un ANOVA de una vía con el post-test de Bonferroni; y un ANOVA de dos colas con el post-test de Bonferroni se realizó durante el ensayo de proliferación celular. Los datos se expresaron como la media ± SEM. Se consideró una diferencia estadísticamente significativa cuando * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt;. 0.001
Resultados
células de cáncer colorrectal expresan receptores de LPA de una manera diferencial, pero el tratamiento LPA no altera la migración celular, la invasividad o el crecimiento independiente de anclaje
en un principio, se investigaron los niveles de expresión de los receptores de LPA en tres líneas celulares de cáncer de colon, las células Caco-2, HT-29 y HCT-116, utilizando el Western Blot. Fig 1 muestra que Caco-2, HT-29 y HCT-116 células expresan los receptores de LPA
1, LPA
2 y LPA
3 de maneras diferenciales. Los invasores células Caco-2 de bajo grado presentan los niveles más bajos de LPA
1 y LPA
3 en relación con las otras líneas celulares y mayores niveles de LPA
2 en relación con HT-29. El HT-29 de forma intermedia invasiva células expresaron niveles similares de los tres receptores de LPA; y las células altamente invasivos HCT-116 presentan niveles más altos de los receptores LPA
3, en comparación con las células Caco-2 y células
2 y LPA HT-29, pero los niveles más bajos de LPA
1 en relación con HT-29. Este resultado indica que, de hecho, las tres líneas celulares son sensibles a este biolípido. Algunos estudios han demostrado que el LPA media la migración celular en una amplia gama de tipos de células de cáncer [25,26], y hemos demostrado previamente que LPA incrementa la migración de células Caco-2 [10]. Por lo tanto, hemos querido evaluar los efectos de la LPA sobre eventos relacionados con la progresión del cáncer en células de cáncer de colon con un mayor potencial invasivo. Por lo tanto, hemos realizado la curación de heridas, un ensayo de la invasión de células y el crecimiento (AIG) independiente de anclaje en HT-29 y HCT-116 células Caco-2,. Se encontró que el LPA no alteró la migración de células en células HT-29 y HCT-116 o aumentar el potencial invasivo de las líneas celulares de cáncer de colon tres; Por otra parte, LPA no alteró la tumorigenicidad, según se evaluó por AIG (S1, S2 y S3 Figs, respectivamente).
Western Blot Representante y los análisis densitométricos de Caco-2, HT-29 y las células HCT-116 usando anticuerpos específicos contra LPAR
1-3 (ac, respectivamente). las células Caco-2 expresan altos niveles de LPA
2, HT-29 células expresan altos niveles de LPA células
1-3 y HCT-116 expresan altos niveles de LPA
2-3. Las puntuaciones medias ± SEM. de tres experimentos independientes se muestran.
LPA no induce la muerte celular, pero aumenta la proliferación celular mediante la promoción de la progresión de la fase S y G2 /M fases
Debido a LPA incrementa celular la proliferación y la evasión de la muerte de las células del cáncer de colon [8,9,27], decidimos evaluar si LPA modula la viabilidad celular en nuestro estudio. Nuestros resultados indican que después de 48 y 72 h de tratamiento, LPA aumentó el número de células viables HCT-116, pero no el número de viable Caco-2 y HT-29 células (Fig 2A). Debido a que un mayor número de células viables pueden indicar la inducción de la proliferación o disminución de la muerte celular por la evasión de la apoptosis, determinamos si LPA podría afectar a la muerte celular mediante la incubación de las células privadas de suero HCT-116 con LPA para 24, 48 y 72 h y luego tinción de la células con anexina V y PI (Fig 2B y 2C). LPA no alteró el número de células muertas, lo que indica que el aumento en el número de células observado en la figura 2A se produce a través del aumento en la proliferación celular y no la reducción de la muerte. Para determinar si el crecimiento de las células HCT-116 inducida por LPA fue el resultado de la alteración de la regulación del ciclo celular, los perfiles del ciclo celular se controlaron mediante un análisis de citometría de flujo del contenido de ADN. Como se muestra en la figura 3, la distribución en las fases del ciclo celular indicó que el tratamiento con LPA para 8, 12 y 16 h promueve la progresión de la célula a la fase S y luego la G2 /M fases, durante la cual la población aumentó en comparación con el Las células privadas de suero.
células de cáncer de colon se mueren de inanición FBS durante 24 horas y después se trató con LPA (10 M) durante 24, 48 o 72 h. Se evaluó el número de células relativo mediante tinción con violeta cristal (a), y la apoptosis fue seguido por el método de tinción doble con anexina-V /PI (b). a) LPA aumentó el número relativo de células HCT-116, pero no Caco-2 o células HT-29. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
de dos vías ANOVA con
post-hoc de Bonferroni
prueba. ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0,001. las puntuaciones medias ± SEM. de tres experimentos independientes se muestran. b) análisis de FACS a través de Anexina V-FITC /PI tinción mostró que LPA no redujo la muerte celular en las células HCT-116. Cuatro poblaciones celulares diferentes se detectaron después de la tinción con Anexina V /PI de las células HCT-116. Las células vivas se agrupan en la parte inferior izquierda del panel, las células temprana de apoptosis se agrupan en la parte inferior derecha del panel, las células finales de apoptosis se agrupan en la parte superior derecha del panel y las células necróticas se agrupan en la parte superior izquierda del panel. FL1-H, anexina V; FL2-H, PI. c) Datos obtenidos a partir del flujo análisis de citometría se representan en un gráfico. No se incrementó el porcentaje de apoptosis mediada por LPA.
Las células se mueren de inanición FBS durante 24 h (cont, control), tratadas con LPA en los tiempos indicados, se tiñeron con PI y se analizaron mediante FACS. a) La proporción de células en la fase G2 /M aumentó significativamente después de 12 y 16 h con el tratamiento de LPA. M1: células en G1; M2: células en la fase S; M3: células en G2 /M. b) El gráfico indica el porcentaje de S y las células G2 /M en relación con el grupo de control. La proporción de ADN en la fase S se calculó usando ModfitLT Software. Los datos se muestran como la media ± SEM de tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
unidireccional
ANOVA (*** p & lt; 0,001). PI, yoduro de propidio; FACS, la clasificación de células activadas por fluorescencia.
proliferación celular LPA inducida por la HCT-116 implica Rho-ROCK señalización de activación
Sobre la base de estudios previos que muestran que el LPA activa la pequeña GTPasa Rho [14] y que Rho regula la proliferación celular en diferentes tipos de células [28], decidimos investigar si LPA-inducir la proliferación de las células HCT-116 es Rho-ROCK dependiente. Las capas de células se mueren de inanición de suero durante 1 h, seguido de tratamiento con 10 mM LPA en los tiempos indicados; entonces realizó el ensayo de actividad de Rho. S4 Fig muestra que LPA induce la activación de RhoA principalmente a los 5 y 15 minutos de tratamiento. Este resultado corrobora los estudios anteriores que muestran que LPA activa RhoA GTPasa.
A continuación, se examinó si se activa LPA ROCA aguas abajo de Rho y si esta vía de señalización es responsable de la modulación de la proliferación celular. Por lo tanto, se realizó un ensayo de cristal violeta y análisis del ciclo celular después de la inhibición de la roca con Y-27632. Los resultados indican que la inhibición ROCA impidió que el aumento en el número relativo de células después del tratamiento con LPA durante 48 h (Fig 4A). Por otra parte, el inhibidor de ROCA impedido inducida por LPA progresión del ciclo celular (Fig 4B). Estos datos apoyan la noción de que el LPA induce la proliferación de células HCT-116 a través de la activación de Rho-ROCK.
monocapas de células subconfluentes se agotan FBS durante 24 horas y se trataron con LPA en los tiempos indicados. a) Cristal violeta tinción de HCT-116 mostró que el inhibidor de la ROCA Y-27632 (10 mM) impidió un incremento mediado por el LPA en el número relativo de células después de 48 h de tratamiento. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
de dos vías ANOVA con
post-hoc de Bonferroni
prueba. *** P & lt; 0,001, frente al control; ### P & lt; 0,001, frente a LPA. las puntuaciones medias ± SEM. de tres experimentos independientes se muestran. b) El análisis FACS mediante tinción PI mostró que la inhibición de la roca con Y-27632 impidió el aumento inducido por el LPA en la proporción de células en la fase S-G2 /M. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
unidireccional
ANOVA con
post-hoc de Bonferroni
prueba. Los datos se presentan como media ± SEM. (*** P & lt; 0,001, frente al control; ## p & lt; 0,01, frente a LPA) guía empresas
LPA activa STAT-3 para mediar la proliferación celular de una manera independiente de Rho-ROCK
es bien conocido que tanto la LPA y Rho pueden desencadenar diferentes vías de señalización para modular la proliferación celular. Por otra parte, hemos demostrado previamente que el LPA interrumpe uniones adherentes en células Caco-2 a través de Rho-ROCK señalización [10], y un estudio realizado por Yang
et al
. [35].