Extracto
D, L-sulforafano (SFN), un análogo sintético de la constituyente racémica brócoli L- sulforafano, es un agente quimiopreventivo del cáncer altamente prometedor con
in vivo
eficacia contra químicamente inducida, así como cáncer de oncogén impulsada en modelos de roedores preclínicos. efecto quimiopreventivo del cáncer de SFN se caracteriza por G detención
2 /M de células fase del ciclo, la inducción de apoptosis y la inhibición de la migración celular y la invasión. Por otra parte, SFN inhibe múltiples vías de señalización oncogénica menudo hiperactivos en los cánceres humanos, incluyendo el factor-kB, Akt, transductor nuclear de señal y activador de la transcripción 3, y del receptor de andrógenos. El presente estudio fue diseñado para determinar el papel de la señalización de Notch, que es constitutivamente activa en muchos cánceres humanos, en efectos contra el cáncer de SFN usando células de cáncer de próstata como modelo. La exposición de células de cáncer de próstata humano (PC-3, LNCaP, y /o LNCaP-C4-2B) para SFN, así como su origen natural tio-, sulfinyl-, y sulfonilo análogos resultaron en la escisión (activación) de Notch1, notch2, y Notch4, que fue acompañado por una disminución en los niveles de Notch formas de larga duración, especialmente en los puntos de tiempo de 16 y 24 horas. La división mediada por Notch SFN de las isoformas se asoció con su activación transcripcional como se evidencia por RBP-JK-, HES-1A /B y HEY-1 ensayos de reportero de luciferasa. La migración de las células LNCaP PC-3 y se redujo significativamente la interferencia por ARN de Notch1 y Notch2, pero no Notch4. Además, la inhibición mediada por SFN de PC-3 y la migración de células LNCaP fue sólo marginalmente afectada por desmontables de Notch1 y Notch2. Sorprendentemente, la administración SFN a Transgénicos El adenocarcinoma de próstata alfombrilla de ratones transgénicos no aumentó los niveles de troceados Notch1, Notch2 escindido, y HES-1 proteínas
in vivo
de neoplasia intraepitelial prostática, carcinoma de próstata o pobremente diferenciado bien diferenciado lesiones de cáncer. Estos resultados indican que la activación de Notch es en gran parte prescindible para la inhibición mediada por SFN de la migración celular, la cual debe ser visto como una ventaja terapéutica como la activación de Notch es frecuente en los cánceres de próstata humanos
Visto:. Hahm ER, Chandra-Kuntal K, D Desai, Amin S, SV Singh (2012) Notch activación es prescindible para la D, L-sulforafano mediada por la inhibición de la migración de las células del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (9): e44957. doi: 10.1371 /journal.pone.0044957
Editor: Xiaolin Zi, Universidad de California Irvine, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Junio, 2012; Aceptado: August 10, 2012; Publicado: 7 Septiembre 2012
Copyright: © Hahm et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el CA115498-07 subvención del Instituto Nacional del cáncer. Esta investigación utilizó una instalación de tejidos y patología de investigación apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer (P30 CA047904). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
D, L-sulforafano (SFN), un análogo sintético de brócoli racémica derivados isómero L (L-SFN), es un agente quimiopreventivo contra el cáncer altamente prometedor, con una notable actividad en modelos animales preclínicos [1], [2]. Talalay y colaboradores fueron los primeros en observar la prevención del cáncer mamario 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno inducida en ratas por este compuesto [3]. la eficacia de quimioprevención del cáncer de SFN o L-SFN se extendió posteriormente a otros modelos de carcinogénesis química. Por ejemplo, la administración SFN se demostró para suprimir colon focos de criptas aberrantes azoximetano inducida en ratas [4]. Asimismo, el tratamiento SFN resultó en la prevención de la benzo [a] pireno inducida por cáncer forestomach y la inhibición de la progresión maligna de adenomas pulmonares inducidas por el tabaco carcinógeno 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona en ratones [5 ], [6]. Estudios más recientes han utilizado modelos de ratones transgénicos para establecer la eficacia de la SFN quimiopreventivo contra los cánceres de oncogenes impulsada. Por ejemplo, la administración dietética de 300 y 600 ppm SFN durante 3 semanas a ApcMin /+ ratones resultó en la supresión de los pólipos en el intestino delgado de una manera dependiente de la dosis [7]. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que la sonda oral de 6 mol SFN (tres veces por semana) a partir de las 6-7 semanas de edad incidencia significativamente inhibido y carga de la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y /o bien diferenciado de cáncer de próstata (WD ), así como la multiplicidad metástasis pulmonar en Transgenic Adenocarcinoma de ratón de próstata (TRAMP) ratones sin causar efectos secundarios [8]. De acuerdo con estos datos [8], 8 semanas de edad ratones TRAMP alimentados con 240 mg de brotes de brócoli /ratón /día mostraron una disminución significativa en el crecimiento del tumor de próstata en otro estudio [9]. Además, el crecimiento de células de cáncer de próstata humano PC-3 xenoinjertado en ratones atímicos macho se retrasó significativamente por el tratamiento oral con SFN [10]
Debido a resultados prometedores en modelos de roedores preclínicos [3] - [8]., [10] elucidación del mecanismo de respuesta de quimioprevención del cáncer subyacente a SFN ha sido el tema de intensa investigación durante la última década. Mecanismos que contribuyen a la quimioprevención del cáncer por SFN incluyen: la inhibición de CYP2E1 [11], detención del ciclo celular [12], [13], la apoptosis de inducción [12], [14], la supresión de la angiogénesis [15], la inhibición de la histona deacetilasa [16 ], de unión a proteínas [17], la inducción de enzimas de fase 2 [18], la represión epigenética de
hTERT
[19], y la inhibición de la auto-renovación de las células madre del cáncer de mama [20]. Estudios mecanicistas utilizando células cancerosas cultivadas también han puesto de manifiesto la supresión mediada por SFN de las diversas vías oncogénicas menudo hiperactivos en los cánceres humanos, incluyendo el factor nuclear kappa B, receptor de andrógenos, Bcl-2, Bcl-xL, y transductor de señales y activador de la transcripción 3 [14 ], [21] - [23]. Aunque la activación del transductor de señal y activador de la transcripción 3 confiere una protección modesta contra la apoptosis inducida por el SFN, especies reactivas de oxígeno mitocondrias derivadas (ROS) proporcionan la señal inicial para el compromiso de la apoptosis en células de cáncer expuestos a este agente [14], [24].
La señalización Notch se ha implicado en el desarrollo del cáncer de próstata y metástasis [25] - [28]. Por ejemplo, un estudio con muestras de tumores de 154 hombres mostró sobreexpresión de Jagged-1, un ligando Notch, en el cáncer de próstata metastásico en comparación con cáncer localizado y la enfermedad benigna de la próstata [26]. Del mismo modo, Bin Hafeez et al. [27] encontraron una mayor expresión de Notch1 en los cánceres de próstata. Por otra parte, desmontables de
Notch1
invasión inhibido de las células de cáncer de próstata humano en asociación con la inhibición de la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) y la uroquinasa activador del plasminógeno [27]. Down-regulación de Notch1 y su ligando Jagged-1 se ha demostrado que inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata [28]. El presente estudio se utilizaron las células de cáncer de próstata humano cultivadas (PC-3, LNCaP y LNCaP-C4-2B), y tejidos de la próstata dorsolateral de control y los ratones TRAMP tratados con SFN [8] para determinar el papel de Notch1, Notch2 y Notch4 en efectos anticancerígenos de SFN.
Resultados
tratamiento SFN aumento de los niveles de Notch1 escindido, se escindió Notch2, y se escindió Notch4 en células cultivadas de cáncer de próstata humano
activación de Notch implica la unión de el receptor de ligandos contiguo seguidas por un cambio conformacional dentro de la escisión del receptor Notch y mediada por el complejo γ-secretasa en un sitio ubicado dentro del dominio transmembrana Notch [29]. El resultado neto de estas reacciones es la liberación del dominio intracelular Notch en el citoplasma, que entonces se transloca al núcleo para regular la expresión del gen diana [25], [29]. Se utilizó PC-3 (una línea celular de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos que carecen de p53 funcional), LNCaP (una línea celular de cáncer de próstata humano andrógeno-sensible, con p53 de tipo salvaje), y LNCaP-C4-2B (una variante independiente de andrógenos de la línea celular LNCaP) para estudiar el papel de la señalización Notch en efectos anticancerígenos de SFN. Los niveles de troceados Notch1, Notch2 escindido, y las proteínas Notch4 escindidos se aumentó notablemente por tratamiento con SFN en PC-3 (Fig. 1A), LNCaP (Fig. 1B), y las células LNCaP-C4-2B (Fig. 1C), aunque con diferentes cinéticas. Por ejemplo, a diferencia de las células LNCaP (Fig. 1B), la escisión de la Notch1 tras el tratamiento con SFN fue transitoria (aumento de escisión observados sólo a 8 hora- punto de tiempo) en las células PC-3 (Fig. 1A). Base molecular de la célula diferencias específicos de la línea de activación de Notch por SFN no está claro, pero la activación de Notch por SFN fue acompañado por una disminución en los niveles de larga duración Notch1, Notch2 y Notch4 en cada línea celular en especial en el de 16 y los puntos de tiempo de 24 horas (Fig. 1A-C). Notablemente, Notch2 fue en general más sensibles a la escisión por SFN en comparación con Notch1 o Notch4 (Fig. 1A-C). En conjunto, estos resultados indicaron que el tratamiento SFN resultó en la escisión de Notch1, Notch2 y Notch4 tanto en las células de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos y andrógenos sensible.
inmunotransferencia para escindido y de longitud completa Notch1, Notch2 y Notch4 usando lisados de células LNCaP-C4-2B (A) PC-3, (B) LNCaP y (C) después del tratamiento de 8, 16, o 24 horas con DMSO o SFN (10 o 20 mM). Blots fueron despojados y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina como control de carga. Inmunotransferencia para cada proteína se llevó a cabo al menos dos veces usando lisados preparados de manera independiente. Los números por encima de banda representan cambios en los niveles de proteína relación a las correspondientes de control tratado con DMSO.
Efectos de los análogos de la SFN de origen natural en la activación de Notch en PC-3 y LNCaP células
utilizado de origen natural tio-, sulfinyl-, y sulfonil análogos de SFN con diferente longitud de la cadena alquilo (Fig. 2A) para determinar si la activación de Notch era única para SFN. la exposición de ocho horas de PC-3 (Fig. 2B) y las células LNCaP (Fig. 2C) a tio- (Iberverin, Erucin, y Berteroin) y sulfinil-análogos (Iberin y Alyssin) dieron como resultado la escisión de Notch1 y Notch2 (Fig . 2B, C). Además, los tio y sulfinilo análogos eran relativamente más potente en la causa de la escisión de Notch1 y Notch2 en comparación con sulfonilo-análogos (Cheirolin, Erysolin, y Alyssin sulfona), tanto en PC-3 (Fig. 2B) y células LNCaP (Fig . 2C). Sorprendentemente, los niveles de Notch4 escindidos se redujeron a medida que varía después del tratamiento con tio- y sulfinilo análogos pero no de sulfonilo análogos en ambas líneas celulares. En conjunto, estos resultados indicaron que los de origen natural sulfinil-análogos de tio y de SFN eran eficaces para provocar la escisión de Notch1 y Notch2. Por otro lado, la activación Notch4 parece única para SFN.
(A) Los nombres químicos, nombres comunes, y las fórmulas químicas de análogos utilizados en el presente estudio. Inmunotransferencia para escindido Notch1, Notch2 y Notch4 usando lisados de células LNCaP (B) PC-3, y (C) después del tratamiento de 8 horas con DMSO o diferentes análogos de (10 o 20 mM). Blots fueron despojados y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-actina como control de carga. Inmunotransferencia para cada proteína se llevó a cabo al menos dos veces usando lisados preparados de manera independiente. Los números por encima de banda representan cambios en los niveles de proteína en relación con el control tratado con DMSO.
Efecto del tratamiento SFN sobre la actividad transcripcional de Notch
procedió a probar si la escisión de Notch 1 SFN-mediada , Notch2 y Notch4 fue acompañada por la activación transcripcional de Notch usando ensayos de reportero de luciferasa. La RBP-Jk [proteína C de unión al factor 1 /supresor de sin pelo /LAG1 (CBF1 /Su (H) /Lag 1)] es un modulador aguas abajo directa de señalización Notch [25], [29]. La exposición de las células PC-3 y LNCaP a 20 M SFN para 8 y /o 24 horas resultó en un aumento estadísticamente significativo en la actividad de informador de luciferasa RBP-Jk (Fig. 3A). De acuerdo con estos resultados, los niveles de HES-1 nuclear, un objetivo corriente abajo de Notch, se incrementaron tras el tratamiento de 24 horas de las células PC-3 y LNCaP con SFN en comparación con sulfóxido de dimetilo (DMSO) tratados con células de control (Fig. 3B ). La actividad de la luciferasa asociado a los genes diana de Notch
HES-1A /B Opiniones y
HEY-1 gratis (Fig. 3C, D) también aumentaron significativamente después del tratamiento con 20 mM SFN en células de cáncer de próstata . En conjunto, estas observaciones indicaron que el tratamiento SFN causó la activación transcripcional de Notch en células de cáncer de próstata cultivadas
.
(A) Efecto del tratamiento SFN sobre la actividad de informador de luciferasa RBP-Jk (una medida de la actividad transcripcional de Notch) en PC -3 células LNCaP y después del tratamiento de 8 ó 24 horas con DMSO o 20 mM SFN. (B) de inmunofluorescencia imágenes microscópicas que representa los niveles de proteínas nucleares HES-1 en las células LNCaP PC-3 y después de 24 horas de tratamiento con DMSO o 10 mM SFN (100 × aumento del objetivo). actividad (C) HES-1A /B reportero de luciferasa en células LNCaP PC-3 y después del tratamiento de 8 ó 24 horas con DMSO o 20 mM SFN. (D) HEY-1 (células PC-3) o HES-1A /B (células LNCaP-C4-2B) luciferasa reportero de la actividad después de un tratamiento de 8 ó 24 horas con DMSO o 20 mM SFN. En los grupos A, C, y D, resultados mostrados son la media ± SD (n = 6; datos combinados de dos experimentos independientes realizados por triplicado cada una). * Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05) en comparación con el correspondiente control de DMSO tratados por el estudiante de
t-test
(paneles A, C y D). Cada experimento se realizó dos veces.
Efecto de la interferencia de ARN de Notch1 en SFN-Mediado Inhibición de la PC-3 y LNCaP migración de células
El descenso de regulación de Notch 1 ha demostrado inhibir la próstata la migración del cáncer celular y la invasión [28]. Por lo tanto, hemos diseñado experimentos usando células PC-3 y LNCaP para determinar las consecuencias de la activación Notch1 sobre la inhibición mediada por SFN de la migración celular. Las células LNCaP PC-3 y transfectadas transitoriamente con un siRNA dirigidos-Notch1 exhibieron 80% o mayor disminución de los niveles de de longitud completa Notch1 en comparación con las células transfectadas con un ARNsi de control (Fig. 4A). ARN de interferencia de Notch1 solo resultó en una disminución significativa en PC-3 y la migración de células LNCaP (Fig. 4B, C). Sin embargo, la inhibición mediada por SFN de PC-3 y la migración de células LNCaP fue sólo marginalmente afectada por desmontables de Notch1 (Fig. 4C). Con base en estos resultados, se concluye que la activación Notch1 es en gran parte prescindible para la inhibición mediada por SFN de la migración de células de cáncer de próstata.
(A) La inmunotransferencia de proteínas Notch1 de longitud completa usando lisados de PC-3 y las células LNCaP transitoriamente transfectadas con un ARNsi de control (no específica) o un siRNA dirigidos-Notch1. (B) Imágenes representativas (ensayo de cámara de Boyden) la migración que representa de PC-3 y las células LNCaP transfectadas con un control (no específica) siRNA o una Notch1 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con DMSO o 10 mM SFN (× 100 aumentos). (C) Cuantificación de la PC-3 y la migración de células LNCaP a partir de datos que se muestran en el panel B. De dos a tres campos en cada filtro se anotó para la migración de células en un microscopio invertido. Los datos representan la migración de células ciento normalizado con las células control siRNA-transfectadas tratadas con DMSO (media ± SD, n = 6; datos combinados de dos experimentos independientes realizados por triplicado cada una). Significativamente diferente (
P Hotel & lt; 0,05)
acompared con los respectivos controles tratados con DMSO (células transfectadas con siRNA control o focalizada Notch1 siRNA), y
bbetween células transfectadas control de siRNA y Notch1-dirigido siRNA células por ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Bonferroni transfectadas. Cada experimento se realizó dos veces.
efecto de la proteína Notch2 caída tras SFN-Mediado Inhibición de la PC-3 y la migración de células LNCaP
Hemos demostrado previamente que el silenciamiento de larga duración Notch2 proteína disminuye significativamente la capacidad de migración de los dos PC-3 y LNCaP células [30]. Se procedió a probar si la activación por Notch2 SFN afectada su capacidad para inhibir la migración de PC-3 y LNCaP celular. Nivel de la proteína Notch2 de longitud completa se redujo en & gt; 90% y 60%, respectivamente, después de la transfección transitoria de las células PC-3 y LNCaP con un siRNA Notch2 orientada en comparación con las células correspondientes transfectadas con el ARNsi de control (Fig . 5A). De acuerdo con nuestras observaciones anteriores [30], desmontables de proteína Notch2 sola redujo PC-3 y la migración de células LNCaP (Fig. 5B, C). La inhibición mediada por SFN de PC-3 y la migración de células LNCaP fue moderadamente aumentada por RNA de interferencia de Notch2 (Fig. 5C). Por ejemplo, la migración de células PC-3 se inhibió por 43% y 18% (es igual a la inhibición de 59%), respectivamente, después de tratamiento de 24 horas de siRNA de control de células con SFN 10 M y ARN de interferencia de Notch2 solo transfectadas. La migración de células PC-3 se inhibió en un 67% tras el tratamiento con SFN en células Notch2 silenciados. Estos resultados sugieren que la activación Notch2 por SFN imparte resistencia marginal contra su efecto inhibitorio sobre la migración celular.
(A) La inmunotransferencia de proteínas Notch2 de longitud completa usando lisados de PC-3 y las células LNCaP transfectadas transitoriamente con un control ( no específica) siRNA o un siRNA Notch2-dirigida. (B) Imágenes representativas (ensayo de cámara de Boyden) la migración que representa de PC-3 y las células LNCaP transfectadas con un control (no específica) siRNA o una Notch2 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con DMSO o 10 mM SFN (× 100 aumentos). (C) Cuantificación de la PC-3 y la migración de células LNCaP a partir de datos que se muestran en el panel B. De dos a tres campos en cada filtro se anotó para la migración de células en un microscopio invertido. Los datos representan la migración de células ciento normalizado para el control de las células transfectadas con siRNA tratados con DMSO (media ± SD, n = 6; datos combinados de dos experimentos independientes realizados por triplicado cada una). (D) Análisis de la liberación de fragmento de ADN de histona asociada en el citosol en células LNCaP PC-3 y se transfectaron con un control (no específica) siRNA o una Notch2 orientada siRNA y se trató durante 24 horas con DMSO o SFN. Los datos representan el enriquecimiento de la liberación fragmento de ADN histona asociada en el citosol en relación con las células control transfectadas siRNA tratados con DMSO (media ± SD, n = 6; datos combinados de dos experimentos independientes realizados por triplicado cada una). En los paneles C y D, significativamente diferentes (
P
& lt; 0,05)
acompared con respectivos controles tratados con DMSO (células transfectadas con ARNsi de control o Notch2-dirigida de siRNA), y
bbetween siRNA de control células transfectadas y células transfectadas siRNA dirigidos-Notch2 por ANOVA de una vía seguido por la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Cada experimento se realizó dos veces.
O'Neill et al [31] han demostrado previamente que Notch2 regula la apoptosis al menos en MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano. Por lo tanto, era lógico para determinar si la activación Notch2 afectada apoptosis inducida por SFN. Como se muestra en la Fig. 5D, desmontables de proteína Notch2 por sí solo no tiene ningún impacto significativo sobre la liberación de fragmento de ADN de histona asociada en el citosol, que es un método bien aceptado para la cuantificación de la apoptosis. La liberación fragmento de ADN histona asociada mediada por SFN en el citosol fue abrogada poco sobre la interferencia de ARN de Notch2 en las células LNCaP, pero esta diferencia no alcanzó significación estadística en la línea celular PC-3 (Fig. 5D). Debido a los efectos marginales y las diferencias de la línea específica de células, llegamos a la conclusión de que la activación Notch2 tiene un impacto mínimo en la capacidad de SFN para inducir la apoptosis al menos en las células del cáncer de próstata.
Notch4 activación es prescindible para SFN-Mediado Inhibición de la PC -3 migración celular
a continuación, se procedió a determinar el papel de la activación Notch4 en la inhibición mediada por el SFN de la migración celular usando células PC-3. Nivel de proteína Notch4 de longitud completa se redujo en 70% después de la transfección transitoria de células PC-3 con un siRNA dirigidos-Notch4 comparación con las células transfectadas con el ARNsi de control (Fig. 6A). A diferencia de Notch1 (Fig. 4C) o Notch2 (Fig. 5C), ARN de interferencia de Notch4 solo tuvo un efecto mínimo en PC-3 migración celular (Fig. 6B, C). Por otra parte, la inhibición de la migración de células PC-3 resulta de la exposición SFN no fue influenciado por la interferencia de ARN de Notch4 (Fig. 6C). Por lo tanto la activación de Notch4 también era prescindible para la inhibición mediada por SFN de la migración de células PC-3 por lo menos en células PC-3. No se han realizado estudios similares usando Notch4 siRNA en células LNCaP.
(SFN) la inhibición mediada por la migración celular PC-3. (A) La inmunotransferencia de proteínas Notch4 de longitud completa usando lisados de células PC-3 transfectadas transitoriamente con un control (no específica) siRNA o un siRNA Notch4-dirigida. (B) Imágenes representativas (ensayo de cámara de Boyden) que representa la migración de las células PC-3 transfectadas con un control (no específica) o de un siRNA dirigido Notch4-siRNA y tratados durante 24 horas con DMSO o 10 mM SFN (100 × aumento del objetivo). (C) La cuantificación de la migración de células PC-3 a partir de datos que se muestran en el panel B. De dos a tres campos en cada filtro se anotó para la migración de células en un microscopio invertido. Los datos representan la migración de células ciento normalizado con las células control siRNA-transfectadas tratadas con DMSO (media ± SD, n = 6; datos combinados de dos experimentos independientes realizados por triplicado cada una).
aSignificantly diferente (
P
& lt; 0,05) en comparación con controles respectivos tratados con DMSO (células transfectadas con ARNsi de control o-dirigida de Notch4 siRNA) por ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Cada experimento se realizó dos veces.
Análisis Imzmunohistochemical para escindido Notch1, Notch2 escindido, y HES-1 proteínas en secciones de tejido de la próstata dorsolateral de Control y SFN tratados con ratones TRAMP
Hemos utilizado archivados tejidos de la próstata en parafina procedentes de nuestro estudio TRAMP completada anteriormente [8] para determinar
in vivo
efecto de la administración SFN sobre los niveles de Notch1 troceados, escindido Notch2 y proteínas HES-1. Imágenes representativas de Notch1 troceados, escindidos Notch2 y HES-1 expresión de la proteína en el PIN, WD, y cáncer de próstata pobremente diferenciado (PD) de control y los ratones TRAMP tratados con SFN se muestran en la Fig. 7A. Sorprendentemente, la administración SFN no para aumentar los niveles de estas proteínas en PIN, WD, y PD. Sin embargo, una disminución modesta, pero significativa en el nivel global de Notch2 escindido (expresión combinada en PIN, WD, y PD) era discernible en la próstata dorsolateral de los ratones TRAMP tratados con SFN comparación con la de los ratones TRAMP de control.
(a) imágenes de inmunohistoquímica representativos que representa la expresión de escindido Notch1, exfoliados Notch2, y HES 1-proteínas en la neoplasia intraepitelial prostática (PIN), bien diferenciado cáncer de próstata (WD), y cáncer de próstata pobremente diferenciado (PD) en el dorsolateral próstatas de ratones TRAMP de los grupos indicados (200 × aumento del objetivo). (B) Cuantificación de la expresión (análisis combinado de PIN, WD, y PD) se representan como H-score (media ± SD, n = 5). La significación estadística se determinó por el estudiante de
t-test
.
Discusión
señalización Notch es bastante complejo que implica interacción entre cuatro receptores (Notch1, Notch2, Notch3, y Notch4) y cinco ligandos [Jagged1, Jagged2, Delta-like y ligandos (Dll1, DLL3, y Dll4)] [25], [29]. la señalización de Notch está implicada en la determinación del destino celular en tejidos embrionarios y adultos [32], [33], y el desarrollo normal de la próstata, así como en la patogénesis de los cánceres de próstata [25]. La sobreexpresión de Jagged-1 se demostró en el cáncer de próstata metastásico en comparación con el cáncer localizada y enfermedad de la próstata benigna [26]. Por otra parte, Notch1 caída ha demostrado inhibir la MMP-9 y la invasión de las células PC-3 [27]. Down-regulación de Jagged1 se ha demostrado que inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata [28]. ARN de interferencia de Notch1 inhibe la migración de células de cáncer de próstata y la invasión [28]. El presente estudio muestra que el tratamiento SFN activa la señalización de Notch en líneas celulares de cáncer de próstata humano con independencia de la capacidad de respuesta a andrógenos. La activación mediada por SFN de Notch1, Notch2 y Notch4 se caracteriza por su escisión y el aumento de la actividad transcripcional. La activación de Notch1 y Notch2, pero no Notch4, no es única para SFN como algunos de sus análogos de origen natural son eficaces para provocar la escisión de los dos Notch1 y Notch2 en las células LNCaP PC-3 y. En consonancia con datos de la literatura [28], también se encontró que desmontables de Notch1 y Notch2 reduce la migración de las células de cáncer de próstata, independientemente de la capacidad de respuesta de andrógenos. Sorprendentemente, la activación Notch por SFN tiene un impacto mínimo en su capacidad para inhibir la migración de células de cáncer de próstata. En concreto, desmontables de Notch1, Notch2 o Notch4 no tiene ningún impacto en absoluto o sólo un efecto marginal sobre la inhibición mediada por el SFN de la migración de células de cáncer de próstata. Estas observaciones indican que la activación Notch es prescindible para la inhibición mediada por SFN de la migración de células de cáncer de próstata.
Evidencia sigue acumulando para indicar que las diferencias estructurales en los isotiocianatos de origen natural (ITC) pueden afectar profundamente su actividad. Por ejemplo, la inducción de la autofagia por SFN sirve para proteger contra la apoptosis [34]. Por el contrario, la autofagia contribuye a la celda inducción de muerte por isotiocianato de fenetilo (PEITC) [35], que es un constituyente natural de berro con similitud estructural con SFN (es decir, la presencia del grupo funcional ITC). El presente estudio proporciona otro ejemplo para ilustrar diferencias mecánicas de compuestos estructuralmente relacionados ITC (por ejemplo, SFN y fenil isocianato). Hemos demostrado anteriormente que, a diferencia de SFN (presente estudio) por activación de Notch fenil isocianato impide su efecto inhibidor de la migración de células de cáncer de próstata [30]. Estas observaciones subrayan precaución en la extrapolación de los resultados mecánicas entre estructuralmente diferentes compuestos ITC.
La activación de Notch2 por la sobreexpresión de su dominio intracelular se ha demostrado que la promoción de la apoptosis en MB 231 MDA-células de cáncer de mama humanos [31] . Debido a la inducción de apoptosis se considera un mecanismo importante en la quimioprevención del cáncer por el SFN [12], [14], que era de interés para determinar las consecuencias de la activación de la respuesta Notch2 proapoptótico a SFN. A diferencia de las células MDA-MB-231, desmontables de Notch2 no tiene ningún impacto sobre la apoptosis en las células, ya sea PC-3 o LNCaP. Por otra parte, la apoptosis inducida por SFN fue mínimamente afectada por desmontables de Notch2 en las células LNCaP PC-3 y. Así papel proapoptótico de Notch2 puede ser un fenómeno exclusivo de las células MDA-MB-231.
Hemos demostrado anteriormente que la administración SFN inhibe la incidencia y la carga (área afectada) de PIN y WD, pero no la enfermedad, ya así como multiplicidad metástasis pulmonar en ratones TRAMP [8]. Curiosamente, la administración SFN es incapaz de incrementar los niveles de troceados Notch1, Notch2 exfoliados o HES-1
in vivo
en la próstata dorsolateral de los ratones TRAMP (presente estudio). Por un lado, estos resultados sugieren que la prevención de cáncer de próstata en ratones TRAMP SFN en no está relacionada con la señalización de Notch. Al mismo tiempo, la posibilidad de que un régimen de dosificación más intensa de SFN (por ejemplo, altas concentraciones y la administración diaria) puede ser necesaria para provocar la activación Notch
in vivo
no puede ser descartada. discrepancia observada entre la
in vitro
y
in vivo
sistemas relativos a efecto de SFN sobre la activación de primera clase también puede estar relacionado con microambiente tumoral. Sin embargo, es necesario seguir trabajando para explorar estas posibilidades.
En conclusión, los resultados del presente no sólo revelan
in vitro y Hoteles en
in vivo
diferencias en el efecto del SFN en la activación de Notch, pero también indican que la activación de Notch1, Notch2 y Notch4 es en gran parte prescindible para las respuestas celulares a SFN (por ejemplo, la inhibición de la migración celular o apoptosis) por lo menos en las células de cáncer de próstata humano.
Declaración de Ética
Se utilizó secciones de tejido archivadas de nuestra publicados anteriormente
in vivo
estudio [8] para determinar el efecto de la administración SFN sobre la expresión de Notch1 troceados, escindido Notch2, y HES-1 proteínas. El uso de ratones y su cuidado fue aprobado por y de acuerdo con la Universidad de Pittsburgh directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo.
Reactivos y Líneas Celulares
El SFN se sintetizó como se describe por Conaway et Alabama. [6], mientras que sus análogos de origen natural fueron adquiridos de LKT Laboratories (St. Paul, MN). Las soluciones madre de SFN y sus análogos se prepararon en DMSO, se almacenaron a -20 ° C, y se diluyeron con medio fresco inmediatamente antes del uso. se añadió a las muestras de control; el mismo volumen de DMSO (0,1% de concentración & lt final). reactivos de cultivo celular, tales como suero fetal bovino, antibióticos mezclas, solución salina tamponada con fosfato (PBS), y la tripsina se compraron de Invitrogen-Life Technologies (Carlsbad, CA). Los anticuerpos contra escindido Notch1 y de larga duración Notch2 eran de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA); un anticuerpo específico para la detección de escindido Notch2 era de EMD-Millipore (Billerica, MA); anticuerpos contra de larga duración Notch1, Notch4 (este anticuerpo detecta tanto de longitud completa como formas escindidas), y HES-1 eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); y el anticuerpo anti-actina fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ARN de interferencia pequeños dirigidos contra Notch1, Notch2 y Notch4 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Un siRNA de control no específica fue adquirido de Qiagen (Germantown, MD). líneas celulares de cáncer de PC-3 y LNCaP de próstata humana se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron como se describe anteriormente [14], [24]. línea celular LNCaP-C4-2B se adquirió de UroCor y se mantiene según lo sugerido por el proveedor.
Immunoblotting
Se prepararon lisados de células enteras como se describe [36] y se sometieron a de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida electroforesis en gel [36], [37]. La membrana húmeda transferido se incubó con anticuerpos primarios y secundarios apropiados y las bandas inmunorreactivas se detectaron usando el método de quimioluminiscencia. Multiplexing o extracción /re-sondeo se realizó para algunas proteínas en algunos experimentos.
Luciferase reportero de ensayo
Se determinó la actividad transcripcional de Notch usando un kit de indicador de luciferasa Cignal RBP-Jk (SABiosciences- Qiagen) siguiendo las recomendaciones del proveedor. Para la determinación de la HES-1A /B y HEY-1 actividad de la luciferasa, se utilizó pGL2-HES-1A /B y pGL2-Hey-1 plásmidos dado generosamente a nosotros por el Dr. Kimberly E. Capataz (Departamento de Patología de la Universidad de Loyola Centro médico, Maywood, IL). Las células transitoriamente co-transfectadas con el plásmido de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla utilizando FuGENE6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) fueron tratadas con DMSO (control) o SFN para 8 ó 24 horas.