Extracto
Humano adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es un cáncer con un pronóstico sombrío. La eficacia de las terapias contra el cáncer PDAC es a menudo de corta duración; Sin embargo, existe poca información sobre cómo esta entidad de la enfermedad con tanta frecuencia gana resistencia al tratamiento. Hemos adoptado el concepto de las células madre del cáncer (CSC) para explicar el mecanismo de resistencia y evaluamos la eficacia de un fármaco contra el cáncer candidato para dirigir estas células madre cancerosas resistentes a la terapia. Se identificaron una subpoblación de células en PDAC con características de CSC que se enriquecieron para aldehído deshidrogenasa (ALDH), un marcador expresado en ciertas células madre /progenitoras. Estas células también eran altamente resistentes a, y se enriquecieron adicionalmente por, el tratamiento con gemcitabina. Del mismo modo, las piezas quirúrgicas de pacientes PDAC mostraron que los que habían sido sometidos a quimio-radioterapia preoperatoria con más frecuencia muestran los cánceres con subpoblaciones ALDH fuertemente positivos en comparación con los pacientes no tratados. Es importante destacar que estas células de cáncer de ALDH-alta fueron sensibles al disulfiram, un inhibidor de ALDH, cuando se prueba
in vitro
. Además,
in vivo
estudios de xenoinjertos mostraron que el efecto de disulfiram fue aditivo a la de gemcitabina de baja dosis, cuando se aplica en combinación. En conclusión, las células derivadas de la PDAC humanas que expresan altos niveles de ALDH mostrar características CSC y tienen un papel clave en el desarrollo de resistencia a las terapias contra el cáncer. Disulfiram se puede utilizar para suprimir esta subpoblación resistente a la terapia
Visto:. Kim SK, Kim H, Lee D-h, Kim T-s, Kim T, Chung C, et al. (2013) La inversión de la naturaleza intratable del cáncer pancreático por orientación selectiva de ALDH-alta, las células cancerosas resistentes a la terapia. PLoS ONE 8 (10): e78130. doi: 10.1371 /journal.pone.0078130
Editor: Benedetta Bussolati, Centro de Biotecnología Molecular, Italia |
Recibido: 1 de julio de 2013; Aceptado: September 17, 2013; Publicado: 23 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación creativa Iniciativas (2010-001827, http://www.nrf.re.kr). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Hoguen Kim es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE, y entiende que esta no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El pronóstico de los pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es extremadamente pobre. Sólo el 10-20% de los PDAC son apropiados para la resección quirúrgica en el diagnóstico inicial, y la tasa de recurrencia del tumor se ha informado a alcanzar hasta 70 a 90%, incluso en pacientes que han sido sometidos a resección curativa [1]. Las opciones terapéuticas en la mayoría de los pacientes finalmente, fuesen reducidas a la quimioterapia intensificada y /o terapia de radiación [1,2]. Por lo tanto, el tratamiento de la PDAC es extremadamente exigente, ya que fácilmente gana resistencia a la quimio-radioterapia y se vuelve intratable.
Un creciente cuerpo de investigación apoya el concepto de células madre del cáncer (CSC) o células iniciadoras del tumor. Los CCC caracterizan características únicas, incluyendo la capacidad de autorrenovación ilimitada, vida útil larga, alto potencial metastásico, y la resistencia a la quimioterapia [3,4]. Por lo tanto, los CSC han llegado a ser reconocido como una subpoblación tumor que debe ser dirigida enérgicamente [2,3,5]. Sin embargo, como cuestión práctica, las eficacias de las terapias actualmente disponibles CSC-dirigidos están lejos de ser satisfactoria. Varios estudios han validado el papel de células madre cancerosas en el desarrollo de la resistencia terapéutica en PDAC [4], y demostró que a menudo son resistentes a los medicamentos contra el cáncer más comúnmente utilizados, tales como gemcitabina y 5-fluorouracilo [1,4,6].
en este estudio, se presume que el concepto de células madre cancerosas podría explicar por qué los efectos de la quimioterapia estándar son frecuentemente limitados en pacientes que reciben quimioterapia adyuvante o quimio-radioterapia [7-11]. Además, la hipótesis de que ciertas características únicas de células madre cancerosas podrían ser explotadas para volver a sensibilizar a PDAC contra el cáncer tratamientos y posteriormente invertir la naturaleza intratable; Se llama la atención a aldehído deshidrogenasa (ALDH), que ha sido reconocido como un nuevo marcador de células madre cancerosas en especial como parte de un panel de marcadores de células madre [12-18]. La acumulación de evidencia apoya la idea de que el aumento de expresión de ALDH se asocia con un pronóstico adverso en mama, pulmón, y cánceres de próstata [15,16,18]. Añadiendo a esta lista, Rasheed et al. informaron recientemente que las células de cáncer de páncreas ALDH1-positivas influyen negativamente en la supervivencia de los pacientes PDAC [12].
Disulfiram (1- [diethylthiocarbamoyldisulfanyl] -N, N-dietil-methanethioamide) es un inhibidor irreversible de ALDH que tiene ha utilizado para lograr un comportamiento de evitación de alcohol durante el tratamiento de los alcohólicos [19]. Disulfiram ha ganado la atención como un medicamento candidato contra el cáncer y hasta la fecha ha sido probado durante varios tumores sólidos, como el cáncer de mama, melanoma y cáncer colorrectal [20-22]. Aunque el mecanismo exacto que subyace a la actividad anticancerígena de este agente no ha sido completamente aclarada, varias pistas importantes han surgido [20-26]. Recientemente, Dalla Pozza et al. informó de que el tratamiento combinado con gemcitabina y disulfiram con ion zinc inhibe el crecimiento del tumor de xenoinjerto de células de cáncer de páncreas [27]. Sin embargo, el efecto directo del disulfiram en las CSC de PDAC en relación con ALDH es indeterminado.
En este estudio, hemos explorado la importancia de la expresión de ALDH y las poblaciones de CSC en PDAC. Se compararon las respuestas a disulfiram entre subpoblaciones tumorales con diferentes niveles de expresión de ALDH y se encontró que las células ALDH fuertemente positivas fueron sensibles al disulfiram. Nuestros resultados sugieren la aplicabilidad del disulfiram como un agente anti-CSC que podría mejorar la eficacia de la quimioterapia estándar contra PDAC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
se utilizaron las siguientes líneas celulares humanas: MIA, (líneas celulares de cáncer de páncreas) Paca-2, PANC-1, y la ASPC-1 CFPAC-1; hTERT-HPNE (línea normal de las células epiteliales ductales pancreáticas). Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) .Las líneas celulares fueron analizados con identificador AmplFLSTR kit de amplificación por PCR (Applied Biosystems, Foster, CA, cat. 4322288) y autenticadas por KCLB en febrero 2013. El disulfiram y gemcitabina (Sigma) se utilizaron para
in vitro
viabilidad y
in vivo
ensayos de xenoinjertos.
muestras de tumores humanos
Este estudio retrospectivo fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Yonsei Medical Center. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente para el almacenamiento y el uso de la muestra y la información médica. Los criterios de inclusión definen una población de estudio de 57 pacientes PDAC que habían sido diagnosticados histológicamente y operados Yonsei University Medical Center de 2005 a 2008. La evaluación clínica se realizó sobre la base de Comité Conjunto sobre el Cáncer TNM (tumor-nódulo-metástasis) clasificaciones. Porque en estadio III y IV son los cánceres de páncreas inoperable según la clasificación TNM [28], se analizaron solamente pacientes en estadio II PDAC que recibieron la operación de Whipple o pancreatoduodenectomy con disección de los ganglios linfáticos conservadora del píloro. Para la quimioterapia preoperatoria /CCRT, se utilizó gemcitabina en la mayoría. (18/20; 90%) de los pacientes
La citometría de flujo
Todas las líneas celulares se analizaron para la expresión de ALDH por citometría de flujo utilizando un kit de Aldefluor (Aldagen, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la comparación de células ALDH-brillante y ALDH-negativa, se clasificaron las células CFPAC-1 de cáncer basado en la intensidad de su actividad ALDH medida por FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia, clasificador de células BD FACS Aria ™ II). anti-CD24 y PerCP-Cy5.5 anticuerpos anti-CD44 conjugado con biotina (eBioscience) se utilizaron de acuerdo con un protocolo immunophenotyping incluido en el manual proporcionado por el vendedor. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) se utilizó para teñir los núcleos de las células vivas. Un kit PE Anexina V Detección de Apoptosis I (BD Bioscience) se utilizó en la conjugación con 7-AAD (eBioscience) para identificar células de cáncer temprano de apoptosis. Para el análisis de la TSI (lineage- Sca + c-kit +) la frecuencia de células madre hematopoyéticas en la médula ósea de fémur murino y la tibia, se utilizó el linaje (CD11b-biotina, Gr1-biotina, CD4-biotina, CD8-biotina, B220- biotina, Ter119-biotina) -estreptavidina-PerCP-Cy5.5, sca-1 PEcy7 conjugado, y los anticuerpos c-kit + APC-conjugado (eBioscience).
Western Blot
Los extractos de proteínas se obtuvieron a partir de células o masas tumorales utilizando una solución de extracto de proteína (Pro-Prep; intrón) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados para el análisis de transferencia de Western incluyen anti-ALDH1A1 (Abcam), GAPDH y anti-β-actina (Sigma).
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR)
El aislamiento de ARN y la síntesis de ADNc se realizó siguiendo el protocolo del fabricante (RiboEx; intrón). SYBR matriz de base verde PCR se realizó con el Sistema iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detección (Bio-Rad). Las secuencias de los cebadores de PCR diferentes están disponibles bajo petición. los niveles de expresión de mRNA relativa se calcularon utilizando el método comparativo Ct con la normalización de ß-actina.
experimentos con ratones
Cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales KAIST . Utilizamos 6 semanas de edad de sexo masculino
Foxn1
nu
ratones SCID para ensayos de xenoinjertos (Orient Bio). tabletas disulfiram (Ind-Swift) se disolvieron en aceite de maíz (Sigma) para la administración oral a través de una sonda. Gemcitabina (Sigma) se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) de
in vivo
ensayos de regresión en.
Para la medición de la respuesta disulfiram, se dividió a los ratones xenotransplantados en ratones tratados con disulfiram (300 mg /m
2, dos veces por semana, administrado a través de una sonda) y los ratones de control tratados con aceite de maíz. Para la medición de la eficacia de la terapia de combinación con disulfiram y gemcitabina en dosis bajas, se dividió a los ratones xenotransplantados en cinco grupos como, los ratones tratados solamente disulfiram (300 mg /m
2, dos veces por semana, administrado a través de una sonda) , dosis bajas de gemcitabina ratones tratados (40 mg /m
2 de superficie corporal, IP, semanal) [29], de baja dosis de gemcitabina junto con disulfiram oral, 10 veces más altas dosis de los ratones tratados con gemcitabina (400 mg /m
2 de superficie corporal, semanal), y los ratones de control tratados con PBS (IP).
se recomienda que el disulfiram fármaco oral se toma una dosis inicial de 500 mg seguida de una dosis diaria de mantenimiento 250 mg en humanos [30]. Se recomienda la traducción dosis de una especie animal a otra utilizando el método de normalización del área de superficie corporal (BSA) [31]. Según esta fórmula, se administró 300 mg de disulfiram /m
2 a ratones dos veces por semana
por
oral.
mediciones del volumen tumoral
Los ratones se inscribieron para el tratamiento de drogas cuando sus tumores habían alcanzado un tamaño de al menos 200 mm
3. El tamaño del tumor se midió con un calibrador, y el volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula estándar, largo x ancho
2 x 0,5 (mm
3). la iniciación del tumor en ratones inyectados con células de cáncer se controló diariamente y el tamaño del tumor se determinó a la semana durante 3 a 5 semanas, como se indica.
Inmunohistoquímica
xenoinjertos de tumor se fijaron en formalina, incluidas en parafina , seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & amp; e). La inmunohistoquímica (IHC) con el anticuerpo anti-ALDH1A1 (Abcam) se realizó utilizando un Kit Dako Envision siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Utilizamos estándares internos para definir ALDH1A1 células fuertemente positivas cuando la amplitud de la señal es igual o mayor que la de las células madre /progenitoras normales situados en la región libre de tumor de la misma diapositiva (Figura S1).
Se realizó el análisis de IHC ALDH1A1 y diferenciación glandular en comparación con la expresión ALDH1A1 sobre el espécimen PDAC humanos (Figura 1A). Para expresar la correlación numérica, contamos ALDH1A1 células cancerosas fuertemente positivas por las células cancerosas total de compuestos de glándulas bien diferenciados y pobremente diferenciados, respectivamente. Se examinaron tres bien diferenciados y tres casos PDAC pobremente diferenciados de humano en 10 campos de gran aumento (X 400 aumentos).
(A) IHC análisis de ALDH1A1 en muestras quirúrgicas de pancreatitis crónica humana y PDAC. Los paneles superiores, H & amp; E mancha y paneles inferiores, ALDH1A1 IHC mancha. (B) La frecuencia de células ALDH1A1 fuertemente positiva entre PDAC bien diferenciados y pobremente diferenciados. (C) Perfiles de actividad de ALDH de PDAC humanos en función de si se realizó el tratamiento preoperatorio. * P & lt; 0.05. Las barras de error representan desviaciones estándar.
La limitación de dilución de análisis
Para estimar la frecuencia de formación de colonias, se diluyeron las células CFPAC-1 en una única célula por pocillo (100 pl) y se cultivaron en placas de 96 pocillos en 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C. Después de dos semanas, se contó cada excrecencia colonia de una única célula y el número de colonias calculó de pozos totales.
Viabilidad ensayo
Se realizó el ensayo de viabilidad mediante WST (sal de tetrazolio soluble en agua) colorante (kit de ensayo de viabilidad celular EZ-cytox, itsBIO), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las muestras fueron leídas por un lector de microplacas utilizando 450 nm de longitud de onda de absorbancia. Para cuantificar la viabilidad celular, se determinaron los valores promedio de las lecturas por triplicado o cuadruplicado y hemos conseguido curva estándar utilizando el software GraphPad Prism 5.
Estadísticas
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5. Para el análisis de la viabilidad celular y el volumen del tumor de acuerdo con el tratamiento de drogas, las diferencias significativas entre medias se determinaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido por pruebas t. IHC y citometría de flujo resultados se analizaron mediante la prueba t y la relación de los tumores contienen células cancerosas positivas ALDH-fuertemente en PDAC resecado quirúrgicamente se comparó por el método de chi-cuadrado. Se comparó la eficiencia de formación de colonias por un análisis de la prueba t. Todos los p-valores reportados son de doble cara, y los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
ALDH1 expresión en una sustracción de páncreas humano tumoral y no tumoral tejidos
células ductales terminales han sido reportados como las células madre /progenitoras pancreáticas en varios estudios [32-34] y Rovira et al. caracterizado el patrón ALDH1 expresión de estas células en ratones [35]. Sin embargo, no se ha informado el patrón de expresión de ALDH1 en el tejido pancreático humano no tumoral. lo tanto, examinar las muestras humanas y encontramos que, de forma similar al páncreas murino, la pancreatitis crónica humana mostró metaplasia regenerativa y la proliferación de las células ductales que sería la progenie inmediata de las células madre /progenitoras pancreáticas [32,35] {Rovira, 2010#96} también mostró altos niveles de expresión ALDH1A1 (Figura 1A).
En PDAC humana, la expresión ALDH1A1 varió entre las diferentes células en un amplio espectro de negativo a positivo fuerte (Figura S1). Cabe destacar que, mal PDAC diferenciadas muestran más abundante ALDH1A1 fuertemente las células cancerosas positivas que PDAC bien diferenciados hicieron (Figura 1A). Figura 1B indica la diferencia estadística en la frecuencia de células ALDH1A1 fuertemente positiva entre bien diferenciado (n = 7) y pobremente diferenciado (n = 7) PDAC. Contamos con las células cancerosas en los campos de alta potencia 10 (X400) de la corredera representante de cada una de las muestras PDAC.
A continuación, se examinaron los especímenes quirúrgicos que, o bien recibieron quimioterapia preoperatoria /terapia concurrente quimio-radioterapia ( CCRT; n = 20) o no (n = 37), y buscado la presencia de ALDH1A1 fuertemente positiva (Tabla S1). Estas células se identificaron por comparación del nivel ALDH1A1expression de una célula de cáncer de individuo a la de una célula normal madre /progenitoras incluido en el tejido pancreatitis crónica asociada al tumor adyacente (Figura S1). Se encontró que la frecuencia de los tumores que poseen ALDH fuertemente células positivas fueron mayores en los pacientes que recibieron la quimioterapia /CCRT antes de la cirugía (80,0%) en comparación con la de los pacientes que recibieron la resección quirúrgica sola (51,4%) (Figura 1C) , lo que sugiere que las células del cáncer de ALDH fuertemente positivas fueron enriquecidos por la quimioterapia /CCRT convencional.
Las células cancerosas que altamente expresado pantalla ALDH múltiples CSC cuenta con
Para establecer un
in vitro
plataforma , que exhibió una línea normal ductal pancreático humano de células epiteliales (hTERT-HPNE) y cuatro líneas celulares derivadas de humanos (PDAC CFPAC-1, MIA Paca-2, PANC-1 y ASPC-1). Se midió la actividad de ALDH en cada línea celular por citometría de flujo utilizando el kit Aldefluor (Figura S2). Debido ALDH1A1 es un producto importante de la
ALDH
intensidad gen, la fluorescencia debe correlacionar positivamente con ALDH1A1 [36]. Por lo tanto, una subpoblación de células que expresan altamente ALDH en citometría de flujo se pudo corresponde con la ALDH1A1 células fuertemente positivas observadas en las muestras de PDAC humanos.
Hemos definido tres subconjunto de células sobre la base de su distribución de citometría de flujo con relación a la compuerta de control negativo DEAB ya sea como ALDH-negativo (células situadas dentro de la región acotada por el control de DEAB), (células situadas en la región por el control DEAB) ALDH-alta, y ALDH-brillante (una subpoblación de células ALDH-alta). En hTERT-HPNE, la ALDH altamente expresar subconjunto constituido menos del 5% de la población total. Entre las cuatro líneas celulares PDAC, MIA PaCa-2 (& gt; 90% de la población total) y CFPAC-1 (aproximadamente 50%) demostraron células de cáncer de ALDH de alta abundantes. En PANC-1 y las células ASPC-1, las proporciones de poblaciones de ALDH-alta fueron comparables a o menor que la de las células hTERT-HPNE. Consistentemente, se detectó proteína ALDH1A1 en cantidades significativas en MIA PaCa-2 y CFPAC-1 líneas de células, pero sólo a niveles mínimos en PANC-1 y AsPC-1 en las células (Figura S2).
Sobre la base de la literatura anterior [12-14,18,37] y nuestras observaciones, se infiere que las células cancerosas ALDH-brillante en realidad podría representar células madre cancerosas. Estudios previos han aplicado ALDH, como parte de un panel con otros marcadores de células madre, para identificar las células normales y madre de cáncer en el páncreas [12,13,37]. Hemos probado si ALDH solo se puede utilizar como un marcador de células madre bona fide y si las células con altos niveles de expresión de ALDH CSC realmente representados. Para ello, se utilizó CFPAC-1 línea celular porque se sabe que la subpoblación de CFPAC-1 está enriquecida con células madre, como el cáncer [38] y se encontró que CFPAC-1 mostró uniformemente distribuida ALDH-alta y el cáncer -negativo células de ensayo Aldefluor. Estamos ordenados además células en función de la magnitud de su actividad ALDH identificado por FACS y se comparó la parte superior e inferior al 5% de las células, lo que nos define como subpoblaciones ALDH-brillantes y ALDH-negativos, respectivamente. los niveles de mRNA y proteína ALDH1A1 fueron consistentes con los niveles de ALDH identificados por FACS (Figura S2).
A continuación analizaron las células con diferentes niveles de ALDH para la co-expresión de CD24 y CD44, que se utilizan comúnmente 1 CFPAC- marcadores de células madre [14]. Esto reveló que la actividad de ALDH correlacionó positivamente con los de CD24 y CD44 (Figura 2A). Un ensayo de formación de colonias de dilución limitante puesto de manifiesto que las células ALDH-brillante tenían una mayor actividad de formación de colonias de células ALDH-negativa (Figura 2B). Nos células ALDH-luminoso y ALDH-negativas cultivadas por separado, y analizamos la actividad de ALDH después de 2 semanas (Figura 2C). La progenie de células ALDH-brillante incluye tanto las células ALDH-brillantes y ALDH-negativas; por lo tanto, las células ALDH-brillante éxito restablecieron la población original. En contraste, las células ALDH-negativos no se recuperaron totalmente la población de células ALDH-brillante.
(A) FACS análisis para CD24
+ CD44
+ CFPAC-1 en las células clasifica en ALDH
brillante, ALDH
altas y ALDH
grupos negativos. (B) La limitación de dilución ensayos de formación de colonias realizados con células CFPAC-1-ordenados por FACS. actividad (C) ALDH medida por análisis FACS en ALDH
negativo y ALDH
brillantes células CFPAC-1 cultivadas por separado durante 2 semanas. (D) Ensayo de ALDH
luminosa y ALDH
negativo CFPAC-1 viabilidad de las células después del tratamiento con gemcitabina. (E) Imagen Representante y gráfico que compara la incidencia de tumores después de la inyección de ALDH-ordenados FACS
negativos brillante células o ALDH
CFPAC-1. Los ratones fueron inyectados con el número indicado de células (ALDH
Br, 5 x 10
5 [
n
= 5]; ALDH
Ng, 5 x 10
5 [
n
= 5]; y ALDH
Ng, 1 x 10
6 [
n
= 5]; ALDH
Br, 1 x 10
6 [ ,,,0],
n
= 10]) en el flanco derecho y se observaron durante 5 semanas. 1X10
5ALDH
células cancerosas negativos no generaron ningún nódulo, incluso cuando el periodo de observación se extendió hasta las 14 semanas. ALDH
Br, ALDH-luminoso y ALDH
Ng, ALDH-negativo. * P & lt; 0,05 y *** P & lt; 0,0005.
Otra característica bien caracterizado de células madre cancerosas es su resistencia a la quimioterapia y /o radioterapia, la terapia [3]. Por lo tanto, se evaluó la sensibilidad de las células ALDH-brillantes y cáncer -negativa a un medicamento contra el cáncer convencional, gemcitabina. células de cáncer de ALDH-brillante eran altamente resistentes a la gemcitabina en comparación con células de cáncer de ALDH-negativo, lo que requiere concentraciones significativamente más altas para matar el 50% de las células (la concentración inhibitoria media máxima, IC
50) (Figura 2D). Este resultado es compatible con los de datos humanos que ALDH fuertemente las células cancerosas positivas fueron enriquecidas por la quimioterapia convencional /CCRT (Figura 1C)
.
A continuación, se inyecta por vía subcutánea 5 x 10
5 FACS ordenados CFPAC-1 las células cancerosas ALDH-brillantes y negativos en los costados de ratones desnudos, respectivamente. Las células xenoinjertados ALDH-brillante comenzaron a formar un nódulo dentro de 1 semana después de la inyección, y por 5 semanas 60% de los ratones habían formado con éxito un nódulo (Figura 2E). Sin embargo, el mismo número de células de cáncer de ALDH-negativo no pudo generar cualquier nódulo, incluso cuando el periodo de observación se prolongó hasta 14 semanas. cánceres ALDH-negativos fueron capaces de establecer solamente nódulos tumorales cuando se aumentó el número de la inyección de las células a 1 x 10
6. En el examen histológico, los nódulos de xenoinjertos originó a partir de células de cáncer de ALDH-brillante estructuras expuestas con diversos grados de diferenciación, que van desde las células bien diferenciadas que se formaron con éxito glándulas organizados con un lumen de las células poco diferenciadas que apenas se formaron arquitecturas glandulares abortivos (figura S2). Las células tumorales localizadas dentro de las regiones pobremente diferenciado con frecuencia exhiben una morfología relativamente atípica y pleomórfico y se muestran núcleos extrañas en comparación con las de las zonas bien diferenciadas. IHC para ALDH1A1 mostró células más fuertemente positivas en la hoja sólida que glándulas en bien formados (Figura S2), de una manera consistente con los de las muestras PDAC humanos (Figura 1A-B).
Estos resultados indicaron que los niveles de ALDH es suficiente para definir una subpoblación de células de cáncer pancreático que demuestra la mala diferenciación, capacidad de repoblación, la resistencia a la gemcitabina, y una mayor tumorigenicidad, que son compatibles con las características típicas de las células madre cancerosas.
PDAC células ALDH-brillantes son selectivamente y eficazmente eliminado por el disulfiram
Debido a que hemos identificado las células cancerosas ALDH-brillante como altamente resistentes a gemcitabina, por la sospecha de que las células ALDH fuertemente positivos fueron los responsables de la resistencia a la quimioterapia. Para eliminar selectivamente las células ALDH-brillante, que se convirtió al disulfiram, que es un inhibidor irreversible conocida de ALDH [19], y se investigó la correlación entre el nivel de expresión de ALDH y sensibilidad disulfiram en las cuatro líneas celulares humanas PDAC. Se han tratado disulfiram y se calcularon los IC
50 valores sobre la base de ensayos de viabilidad. Se observó una correlación inversa entre el porcentaje de células que expresan ALDH e IC
50 valores para disulfiram (Figura 3A y la figura S3).
(A) IC
50 de disulfiram según la expresión de ALDH. (B) Ensayo de la actividad de ALDH Aldefluor en las células CFPAC-1 tratados con disulfiram (paneles superiores) o tratadas de forma transitoria con el disulfiram, seguido de la retirada del fármaco (paneles inferiores). (C) de flujo ensayo de citometría de 7AAD
-AnnexinV
+ células apoptóticas tempranas después del tratamiento de 12 horas con el disulfiram (10μM). (D) Las transferencias Western representativo que muestra los niveles de proteína en ALDH1A1 CFPAC-1 bajo condiciones de control, las células tratadas con disulfiram, y en las células tratadas de forma transitoria disulfiram con la posterior retirada del disulfiram. mediciones (E) RT-PCR y QRT-PCR de la expresión de ARNm en ALDH1A1 control y células tratadas con disulfiram. * P & lt; 0.05.
La toxicidad de los agentes quimioterapéuticos en el tejido normal es otra consideración importante durante el tratamiento contra el cáncer. Por lo tanto, hemos simulado la toxicidad del disulfiram midiendo sus efectos sobre una línea normal de páncreas células epiteliales, hTERT-HPNE (Figura S3). células hTERT-HPNE eran en gran parte insensible a concentraciones relativamente altas de disulfiram. Cabe destacar que el IC
50 de disulfiram para células hTERT-HPNE por superó con creces las de Mia Paca-2 y CFPAC-1 en las células, lo que indica que una parte suficientemente amplia ventana terapéutica se puede asegurar. En contraste con los efectos de disulfiram en MiaPaCa-2 y las células CFPAC-1, el IC
50 valores de disulfiram para líneas celulares PANC-1 y AsPC-1 de cáncer era muy alta, una diferencia que atribuimos al bajo porcentaje de las células ASPC-1 PANC-1 y que expresar ALDH.
A continuación, se examinó además los efectos de disulfiram en las células cancerosas ALDH-brillante, mediante la evaluación de los niveles de ALDH por citometría de flujo en las células cancerosas restantes viables CFPAC-1 después del tratamiento con disulfiram (10 M) durante 12 horas ( Figura 3B). Estos experimentos revelaron que el disulfiram no afectó significativamente la población ALDH-bajo. Para probar si el efecto disulfiram se mantuvo incluso después de que había sido retirado, se había retirado de los medios de comunicación y las células se cultivaron posteriormente durante 2 semanas adicionales. Curiosamente, después de disulfiram se ha retirado, las células no se recuperaron de la jerarquía tumor original y exhibieron un cambio permanente a la parte izquierda de la distribución de citometría de flujo. Por otra parte, disulfiram parecía inducir la muerte celular apoptótica en células CFPAC-1, el aumento de la proporción de células 7AAD-negativos y anexina V-positivas que representan las poblaciones sometidas a la apoptosis temprana (Figura 3C y la figura S3). ALDH1A1 ARNm y los niveles de proteína se mantuvieron persistentemente disminuyó en las células de repoblación, lo que indica que la expresión de ALDH no fue restaurado (Figura 3D-E). En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto el potencial de disulfiram para atacar y eliminar células madre cancerosas que de otro modo serían resistentes a los tratamientos contra el cáncer estándar de forma selectiva y eficiente. Además, se realizó un
in vitro
ensayo de formación de colonias usando células CFPAC-1 disulfiram pretratados. Como era de esperar, las células pretratadas con disulfiram formaron colonias con mucha menos frecuencia que las células de control hicieron (Figura S3).
La administración oral de disulfiram elimina selectivamente las células cancerosas ALDH-alta e inhibe el crecimiento del tumor en combinación con dosis bajas de gemcitabina
Para probar el efecto del disulfiram
in vivo
, nos por vía subcutánea ratones inyectados con células de cáncer CFPAC-1 y se dividió a los ratones en grupos de control xwnotransplantado petróleo tratado con disulfiram-tratada y maíz. El crecimiento tumoral se retrasó significativamente por la administración de disulfiram (Figura 4A). IHC para ALDH1A1 de tumores de xenoinjertos reveló que la frecuencia de las células cancerosas fuertemente positiva ALDH1A1 se redujo notablemente por disulfiram-tratamiento (Figura 4B). Contamos con las células cancerosas en los campos de alta potencia 10 (X400) de la corredera representante de xenoinjertos de tumores de control (n = 3) y se trató disulfiram (n = 3) grupos. los niveles de proteína ALDH1A1 también se redujeron en los tumores tratados con disulfiram (Figura 4C). Un análisis de citometría de flujo de las células que expresan ALDH disociadas de los tumores reveló un desplazamiento hacia la izquierda de la distribución en los ratones tratados con disulfiram, lo que indica que la actividad de ALDH fue reprimida por el disulfiram (Figura 4D y figura S4). Se realizó
in vivo
ensayos de carcinogénesis realizados utilizando células CFPAC-1 disulfiram pretratados. Como era de esperar, las células disulfiram pretratados tenían una tendencia a generar nódulos menores en comparación con las células de control correspondientes (Figura S4, P & lt; 0,05).
(A) La tasa de crecimiento de CFPAC-1 xenoinjertos se midió y se presentó como el cambio porcentual en volumen tras el tratamiento con disulfiram (300 mg /m
2, PO, n = 4). (B) El análisis histológico y cuantificación comparando la frecuencia de ALDH1A1 células fuertemente positivos en el control y CFPAC-1 ratones xenoinjertados disulfiram-tratada. El gráfico muestra la cuantificación de células ALDH1A1 fuertemente positivas en virtud X 400 aumentos en los grupos tratados con disulfiram control y. (C) Western blot representativo que muestra la expresión de proteínas ALDH1A1 en el control y los tumores tratados con disulfiram. (D) ensayo de la actividad de ALDH Aldefluor en las células cancerosas disociadas recuperados de control y CFPAC-1 xenoinjertos disulfiram-tratada. (E) Tasa de crecimiento de CFPAC-1 xenoinjertos se midió y se presenta como el cambio porcentual en volumen tras el tratamiento de ratones con vehículo (control), disulfiram (300 mg /m
2, PO), de baja dosis de gemcitabina (40 mg /m
2, IP), altas dosis de gemcitabina (400 mg /m
2, IP), o disulfiramand bajas dosis de gemcitabina juntos (n ≥ 3). * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005 y *** P & lt; 0,0005.
Por último, hemos explorado por los beneficios potenciales de disulfiram combinado y el tratamiento con gemcitabina. Varios ensayos clínicos previos han adoptado los tratamientos combinados basados en protocolos de gemcitabina en dosis bajas para evitar toxicidades graves [29,39-41]. Del mismo modo, se ha diseñado un protocolo que adoptó dosis bajas de gemcitabina [29] junto con disulfiram oral. Alentador que la combinación de gemcitabina de dosis baja y disulfiram suprime eficazmente el crecimiento del tumor en un grado comparable a la de un 10-veces más alta dosis de gemcitabina (Figura 4E). Por lo tanto, concluimos que el disulfiram no sólo podría lograr aditivos /sinérgicos efectos contra el cáncer durante el tratamiento combinado en nuestro
modelos PDAC in vivo, sino que también permiten una reducción significativa en la dosis necesaria de agentes citotóxicos.
Discusión
El tratamiento de la PDAC es extremadamente difícil, ya que este tumor es con frecuencia refractarios a las terapias contra el cáncer convencionales. La mayoría de los pacientes se presentan con un tumor inoperable cuando se diagnostica por primera vez; Por lo tanto, neo-adyuvante y /o quimioterapia post-operatoria intensivos /CCRT está indicado para la mayoría de pacientes en un propósito paliativo. En el presente estudio, se describe un escenario por el que se hace intratable PDAC a tratamientos contra el cáncer desde la perspectiva de los CAC.