Extracto
inductor de metaloproteinasas de matriz extracelular (EMMPRIN), una proteína de la membrana plasmática de la inmunoglobulina (Ig) superfamilia, se ha informado que promover la invasión de células de cáncer y metástasis en varios tumores malignos humanos. Sin embargo, las funciones de las diferentes isoformas EMMPRIN y sus mecanismos asociados en la cabeza y la progresión del cáncer de cuello siguen siendo desconocidos. Usando cuantitativa en tiempo real PCR, encontramos que EMMPRIN isoforma 2 (EMMPRIN-2) fue la única isoforma que se sobreexpresa en ambos tejidos cáncer de cabeza y cuello y líneas de células y que se asoció con la cabeza y el cuello metástasis del cáncer. Para determinar los efectos de EMMPRIN-2 en la cabeza y la progresión del cáncer del cuello, las células transfectadas cáncer de cabeza y cuello con un vector de expresión EMMPRIN-2 y EMMPRIN-2 siRNA para modular de forma exógena EMMPRIN-2 de expresión y examinamos la importancia funcional de EMMPRIN-2 en cabeza y cuello cáncer de invasión y metástasis. Se encontró que EMMPRIN-2 de cabeza y la invasión de células del cáncer del cuello, la migración y la adhesión in vitro promovidos y el aumento de la metástasis de pulmón in vivo. Estudios mecanicistas revelaron que EMMPRIN-2 sobreexpresión promovió la secreción de moléculas de señalización extracelular, incluyendo metaloproteinasas de matriz-2 (MMP-2), de tipo activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) y la catepsina B, en células de cáncer de cabeza y cuello. Mientras que MMP-2 y UPA han demostrado ser importantes mediadores de la señalización de EMMPRIN, no se ha establecido el papel de la catepsina B en cascadas moleculares mediadas por EMMPRIN y la tumorigénesis. Se encontró que EMMPRIN-2 sobreexpresión y catepsina B baja regulación inhibieron significativamente la invasión, la migración y adhesión de las células Tca8133, lo que sugiere que se requiere la catepsina B para la migración celular EMMPRIN-2 mejorada y la invasión en el cáncer de cabeza y cuello. Los resultados de nuestro estudio demuestran el importante papel de EMMPRIN-2 en la progresión del cáncer de cabeza y cuello por primera vez y revelan que el aumento de la secreción extracelular de la catepsina B puede ser un nuevo mecanismo que subyace a la progresión del tumor EMMPRIN-2 mejorada en el cáncer de cabeza y cuello.
Visto: Huang Z, Tan N, W Guo, Wang L, H Li, Zhang T, et al. (2014) La sobreexpresión de la isoforma EMMPRIN 2 está asociada con cabeza y cuello metástasis del cáncer. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10.1371 /journal.pone.0091596
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de noviembre de 2013; Aceptado: 12 de febrero de 2014; Publicado: 4 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 81101592, a la Z. Huang) y la Fundación de la provincia de Guangdong de Ciencias Naturales (# S2013010014794, a la Z. Huang), y por los premios de la asistente de vuelo Instituto de Investigación médica (# 062.545, a la Z. Guo) y por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 81272951, a J.Li). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de cabeza y cuello (CCC) es el sexto cáncer más común en todo el mundo [1], y se ha vuelto más frecuente en los países en desarrollo en la última década [2]. Más de 650.000 nuevos casos de HNC se diagnostican cada año en todo el mundo [3], [4]. Sólo en Europa, aproximadamente 143.000 nuevos casos y más de 68.000 muertes se producen debido a la enfermedad cada año [4]. La cirugía combinada con quimioterapia y radioterapia ahora se acepta como el tratamiento más eficaz para los pacientes con carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas. Sin embargo, la tasa de mortalidad por cáncer de cabeza y cuello no ha cambiado significativamente en los últimos 30 años, y la tasa de supervivencia a 5 años sigue siendo inferior al 50% [2]. El fracaso del tratamiento principalmente se ha atribuido a la recurrencia local y metástasis a distancia [5]. En la actualidad, las decisiones terapéuticas se realizan sobre la base de parámetros clínico, incluyendo la edad, etapa de metástasis en los ganglios del tumor y el grado histológico. Aunque útiles, estos factores a menudo no pueden proporcionar información precisa sobre las características biológicas de los tumores [3]. Por lo tanto, conocer las alteraciones moleculares asociadas con la cabeza y la metástasis del cáncer de cuello proporcionará información decisiva sobre los mecanismos fundamentales cabeza y la progresión del cáncer de cuello subyacentes y contribuir también a las mejoras en el manejo clínico de los pacientes con cáncer de cabeza y cuello.
extracelular inductor de metaloproteinasas de matriz (EMMPRIN), también conocido como CD147 o basigin, es una proteína de la membrana plasmática de la inmunoglobulina (Ig) superfamilia y fue nombrado basa en su función de inducir la producción de metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP), las enzimas clave que están implicados en el mantenimiento de la integridad y la rotación de la matriz extracelular (ECM) [6]. EMMPRIN participa en una variedad de fisiologías de células normales, incluyendo la capacidad de respuesta de los linfocitos, procesos reproductivos femeninos, y el transporte intracelular [7] - [9]. La expresión elevada EMMPRIN se ha correlacionado con la progresión del tumor en los gliomas, tumores de células gigantes del hueso, carcinoma de células escamosas de laringe, carcinoma de ovario seroso y melanomas [10]. EMMPRIN promueve la progresión del cáncer mediante la mejora de la invasión de células del cáncer y la metástasis. La importancia funcional de EMMPRIN durante la progresión tumoral principalmente se ha atribuido a su capacidad para estimular la producción de MMPs [8] - [10]. En células tumorales, EMMPRIN promueve la producción de MMP-1, MMP-2 y MMP-9 y facilita la síntesis de MT1-MMP y MT2-MMP [11] - [13]. Además de la mediación de la degradación de la ECM, EMMPRIN desempeña papeles multifuncionales en la progresión del cáncer. Por hasta la regulación de la expresión de VEGF y su principal receptor, VEGFR-2, tanto en las células tumorales y las células endoteliales, EMMPRIN puede promover la angiogénesis, que es un evento crítico no sólo durante el crecimiento del tumor, sino también durante el cáncer de metástasis de las células [14], [15]. EMMPRIN también puede actuar como una molécula de adhesión e interactuar con β1-integrina [16], [17]. Muchas otras moléculas se han reportado para interactuar con EMMPRIN, incluyendo la caveolina-1, uPA, transportadores de monocarboxilato (MCT), y CYP450s [18].
Debido a corte y empalme alternativo, por lo menos 4 variantes diferentes de EMMPRIN ARNm que codifica se han identificado diferentes isoformas de la proteína EMMPRIN (EMMPRIN-1 a -4). Entre estas cuatro variantes, EMMPRIN-2 es la isoforma más abundante expresada en células tumorales [19]. EMMPRIN-1 codifica la isoforma más larga retina específica, que se distingue por un dominio adicional similar a Ig (dominios similares a Ig de tres en total) en la porción extracelular [20]. Las otras dos variantes, EMMPRIN-3 y EMMPRIN-4, se identificaron primero en células estromales endometriales humanas y líneas celulares de carcinoma cervical [19]. EMMPRIN-3 es la isoforma más corta, que consiste en sólo un dominio similar a Ig en su porción extracelular [21], y que interactúa con el interiorizado EMMPRIN complejo receptor-ligando [19].
EMMPRIN Nuestro estudio anterior identificado como un objetivo para la inmunoterapia efectiva de la lengua carcinoma de células escamosas [22]. Sin embargo, las características precisas de las isoformas EMMPRIN y su papel en la iniciación y progresión del cáncer de cabeza y cuello siguen siendo desconocidos. Mientras EMMPRIN isoforma 3 es un regulador negativo demostrado en la proliferación y la invasión de las células del cáncer [23], EMMPRIN isoformas 1, 2 y 4 se han propuesto para desempeñar un papel oncogénico en tumores malignos humanos incluyendo el cáncer oral. En este estudio, se investigó el papel fundamental de las isoformas EMMPRIN en la progresión del cáncer de cabeza y cuello. Nuestros resultados demuestran el importante papel de EMMPRIN-2 y sus mecanismos asociados en cabeza y cuello cáncer de invasión y metástasis por primera vez.
Materiales y Métodos
1. Los tejidos humanos y líneas celulares
Un total de 51 pares de tejidos cáncer de cabeza y cuello y los correspondientes tejidos adyacentes nontumorous se recogieron 2009-2011 en el Departamento de Cirugía Oral y Maxilofacial, Hospital Memorial Sun Yat-Sen, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, china. Las muestras de tejido fueron inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido después de la resección y se almacenan a -80 ° C. Tanto los tejidos tumorales no tumorosas y adyacentes se examinaron histológicamente. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito para la recopilación de todos los materiales humanos, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital de Sun Yat-sen Memorial de la Universidad de Zhongshan. Todas las muestras se recogieron de pacientes antes del tratamiento clínico. Las características clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
Los cánceres de cabeza y cuello y líneas celulares Tca8113 ACCM fueron amablemente proporcionados por el Colegio de Odontología de la Universidad de Shanghai Jiao Tong (Shanghai, China) [24 ], [25]. TSCCA células fueron amablemente proporcionados por el Sun Yat-Sen Universidad del Centro del Cáncer [26] y la fuente de células SCC25 fue descrito en nuestra publicación anterior [27]. Las líneas celulares Tca8113 y ACCM se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), mientras que las líneas celulares TSCCA3 y SCC25 se cultivaron en DMEM (Invitrogen Carlsbad, CA). Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal (Gibco), 100 IU /ml de penicilina G y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y las células se hicieron crecer en 37 ° C incubadoras que contienen 5% de CO
2 y una atmósfera húmeda.
2. La transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído de los tejidos o células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo recomendado por el fabricante. El ADN complementario se sintetizó con el kit Prime-Script RT Reactivo (Takara, Dalian, China). RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizaron análisis con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara). Los cebadores utilizados se muestran en la Tabla S1.
3. Western Blot
Las células se lisaron en NP-40 tampón de lisis que contiene un cóctel inhibidor de proteasa y un cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche, Rotkreuz, Suiza). Después de la separación mediante SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). Posteriormente, las membranas se bloquearon con 5% de leche no grasa en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween-20 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las transferencias se sondearon con los anticuerpos primarios relevantes durante la noche a 4 ° C, se lavaron, y se sondearon con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante específico de la especie (Cell Signaling, Beverly, EE.UU.). Un método de detección de quimioluminiscencia (Pierce ECL Western Blot sustrato, Thermol, Beverly, MA, EE.UU.) se utiliza para visualizar las manchas. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-EMMPRIN, anti-MMP-2, anti-UPA, anti-catepsina B (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.), y anti-β-actina (Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.).
4. EMMPRIN-2 Plásmido construcciones, la transfección, la producción de lentivirus y el establecimiento de expresar de manera estable líneas celulares
El vector de expresión lentiviral EMMPRIN-2-pWPXL EMMPRIN-2 se construyó reemplazando el fragmento de GFP del vector pWPXL (Addgene plásmido 12257 , Didier Trono) con la secuencia de codificación de EMMPRIN-2 (número de acceso NM_198589), que se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc de hígado humano utilizando EcoRI y BamHI como enzimas de clonación. Los oligonucleótidos fueron sintetizados para generar shRNA recocido dirigidos contra la secuencia de EMMPRIN-2 desde la posición de +430 a +449 (5'-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 ') y la secuencia de la catepsina B desde la posición de +670 a +689 (5'-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 '). Las secuencias de los oligonucleótidos para las construcciones de plásmidos se enumeran en la Tabla S2. Los fragmentos se clonaron por separado en el vector pLVTHM (Addgene plásmido 12247, Didier Trono) usando los sitios de restricción MluI y ClaI. partículas lentivirales se cosecharon 48 horas después de la co-transfección de pWPXL-EMMPRIN-2 o pLVTH-shRNA con psPAX2 y pMD2.G en células HEK-293T utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen). Las células diana (Tca8113 y ACCM) fueron transducidas con lentivirus recombinante además de 6 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich). Después de 2 semanas de cultivo en una incubadora de 37 ° C que contiene 5% de CO
2 y una atmósfera humidificada, el ARN total y se extrajeron las proteínas y la expresión de EMMPRIN-2 o la catepsina B fue verificado mediante Western blot y RT-cuantitativa PCR [28].
5. En los ensayos de migración e invasión in vitro página 2 × 10
4 células se sembraron en la cámara superior de cada inserto (BD Biosciences, NJ)
Para los ensayos de migración Transwell,. Para los ensayos de invasión, 1 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior de cada inserción, que había sido recubierto con 150 g de Matrigel (BD Biosciences, MA). Las células en ambos ensayos se trataron con tripsina y se resuspendieron en DMEM, y se añadieron 700 a 900 l de medio que había sido suplementado con suero bovino fetal al 10% a las cámaras inferiores de cada pocillo. Después de 12 horas de incubación a 37 ° C, las células que quedan en las cámaras superiores o en las membranas superiores de los insertos se retiran cuidadosamente, y las células que habían migrado o invadido en las cámaras inferiores se fijaron y tiñeron con una solución de colorante que contiene 0,1% de cristal violeta y 20% de metanol. Las células que migran y se obtuvieron imágenes que invaden y se contaron usando un microscopio invertido IX71 (Olympus, Tokio, Japón). Los mismos experimentos se llevaron a cabo un mínimo de tres veces.
6. Ensayo de adhesión celular
A ensayo de adhesión celular se realizó de acuerdo con el protocolo que se describe en una publicación anterior [29]. Para este ensayo, placas de 96 pocillos de cultivo de fondo plano se recubrieron con 30 g de Matrigel (BD Biosciences, MA) en DMEM durante 3 horas a 37 ° C. Las placas que se habían recubierto con albúmina de suero bovino 0,2% (BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente sirvieron como controles negativos. Las células se recogieron usando tripsina /EDTA, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en DMEM. Las células (2,5 × 10
4) se añadieron a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las placas se agitaron a 1000 rpm durante 30 segundos y se lavaron tres veces con DMEM para eliminar las células no unidas. Las células que permanecían unidas a las placas se cuantificaron usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Ensayo (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) según las instrucciones recomendadas por el fabricante. Después de la resta de la unión de pocillos recubiertos con BSA célula fondo, el porcentaje de células adherentes se calculó dividiendo la densidad óptica de las células adherentes por el de la entrada de la célula inicial. Finalmente, las células que habían sido fijados y teñidos en una solución de colorante que contiene 0,1% de cristal violeta y 20% de metanol se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio invertido IX71 (Olympus). Todos los experimentos de adhesión se llevaron a cabo en pocillos por triplicado y repite un mínimo de tres veces.
7. Los modelos de ratón para el análisis in vivo de metástasis
En el
in vivo
análisis de las capacidades metastásicas de las líneas celulares, cada ratón desnudo (diez por grupo, macho BALB /c-nu /nu ) se inyectaron por vía intravenosa con cola-1 × 10
6 Tca8113 células que expresan de forma estable células EMMPRIN-2 o Tca8113 que expresan el vector vacío. Los ratones fueron sacrificados después de 6 semanas, y se diseccionaron los pulmones, se fijaron con formalina neutra tamponada con fosfato y embebidos en parafina. focos metastásicos en los pulmones se contaron microscópicamente en H & amp; E-manchado secciones de tejido. Los ratones fueron manipulados y proteja de acuerdo con los protocolos que habían sido aprobados por el Comité de Atención Médica de Shanghai Experimental Animal y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de Shanghai Medical College, Universidad de Fudan.
8. Gelatina ensayo de zimografía
El ensayo de zimografía de gelatina se lleva a cabo para determinar la actividad de MMP-2 [30]. Brevemente, las células se incubaron en medio libre de suero, y se recogió el medio después de 24 horas. El medio de un número igual de células se separó usando 10% de acrilamida geles que contienen 1 mg /ml de gelatina tipo A (Sigma-Aldrich). Los geles se incubaron en una solución de 2,5% de Triton-X-100 a temperatura ambiente con agitación suave para eliminar SDS y volver a la naturaleza de la MMP-2. Los geles fueron incubadas en tampón de desarrollo (50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, mM CaCl 5
2, y 0,02% Brij35) durante 24 horas a 37 ° C para inducir la lisis de gelatina por la MMP-2 renaturalizada. Después de la reacción, los geles se tiñeron con solución de tinción (0,1% Coomassie Brilliant Blue R250, 30% de metanol y ácido acético al 10%) durante 1 hora y se destiñeron en una solución que contiene 30% de metanol y ácido acético al 10%. Las imágenes de los geles fueron adquiridas mediante la ChemiDoc XRS + Sistema (Bio-Rad). Los mismos experimentos se llevaron a cabo un mínimo de tres veces.
9. Ensayos ELISA
preparación
Muestra: Las células (2 × 10
6) se añadieron a cada placa de 10 cm y se cultivaron durante 24 horas. Para retirar las células no unidas, los platos se lavaron tres veces con medio libre de suero. A continuación, las células se incubaron con 15 ml de medio libre de suero, y se recogieron los medios de comunicación usando una columna Amicon Ultra 15 ml 10K (Millipore) después de 24 horas. la actividad del uPA, las concentraciones de catepsina B MMP-2 y se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de uPA Actividad (Millipore), un Quantikine ELISA Kit humano MMP-2 (amp I +; D Systems) y un kit de catepsina humana B Duo Set (R & amp; D Systems) de acuerdo con los fabricantes de los protocolos recomendados. Todos los análisis de las muestras se realizaron por triplicado y se repitieron un mínimo de tres veces.
10. Los análisis estadísticos
Los resultados se presentan como la media +/- el error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre grupos se evaluaron utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) o la prueba t de Student de dos colas, como se especifica en las leyendas de las figuras correspondientes.
P Hotel & lt; 0,05 se fija como el nivel de significación estadística. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS 17.0.
Resultados
1. EMMPRIN-2 se sobreexpresa en cáncer de cabeza y cuello y se asocia con cáncer de cabeza y cuello metástasis
A pesar de que la expresión alterada de diversas isoformas EMMPRIN se ha implicado a desempeñar un papel en la tumorigénesis HNC, las contribuciones individuales de los diferentes EMMPRIN isoformas a la iniciación y progresión de HNC siguen sin estar claros. Para aclarar aún más el papel de las isoformas EMMPRIN en HNC, se analizó la expresión de diferentes isoformas EMMPRIN en tejidos y líneas celulares HNC. La expresión de los 4 isoformas EMMPRIN se examinó por primera vez en 12 casos de cáncer de los tejidos orales utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Mientras EMMPRIN isoformas 1, 2 y 4 mostraron relativamente abundante expresión, EMMPRIN isoforma 3 era apenas detectable en los tejidos de cáncer orales analizadas (Figura S1). Por lo tanto, nuestro estudio continuo centrado en el papel de las isoformas EMMPRIN 1, 2 y 4 en la cabeza y la progresión del cáncer de cuello. La expresión de las isoformas EMMPRIN 1, 2 y 4 se analizó más de 51 tumores HNC y sus tejidos orales normales emparejados utilizando RT-PCR cuantitativa. Como se muestra en la Figura 1A, EMMPRIN-2 y EMMPRIN-4 que parecían ser las principales isoformas que son expresados en tejidos de cabeza y cuello, mientras que EMMPRIN-1 está representada sólo niveles muy bajos de expresión. Hemos observado que EMMPRIN-2 fue la única isoforma EMMPRIN en el que los niveles de expresión de ARNm se incrementaron significativamente en los tumores en comparación con los tejidos emparejados adyacentes no cancerosas (Fig. 1A). Se detectaron aproximadas 2 veces el aumento (C /A, 1,90) en promedio EMMPRIN-2 niveles de expresión en los tejidos tumorales en los controles normales adyacentes. No se detectaron diferencias significativas en EMMPRIN-1 y EMMPRIN-4 expresión del ARNm entre los tumores y los tejidos no cancerosos adyacentes (fig. 1A).
(A) la expresión de mRNA en EMMPRIN 51 cabeza y tejidos de cáncer de cuello y los tejidos no cancerosos adyacentes se analizaron mediante qPCR. EMMPRIN-2 expresión del ARNm en tejidos tumorales de cabeza y cuello es mayor que en los tejidos no cancerosos adyacentes (
p
& lt; 0,01). No se observaron diferencias significativas en EMMPRIN-1 y EMMPRIN-4 la expresión de ARNm entre los tejidos tumorales y los tejidos no cancerosos adyacentes (
p
& gt; 0,05). (B) Comparación de EMMPRIN-2 mRNA expresión entre los 26 casos de tumores metastásicos y 25 casos de tumores sin ningún signo de metástasis locales y distantes. EMMPRIN-2 mRNA expresión fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer de cabeza y cuello metastásico en comparación con los tejidos de cáncer de cabeza y cuello no metastásico (
p Restaurant & lt; 0,05). detección (C) qPCR de la expresión de ARNm EMMPRIN en líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello. (D) La detección de la expresión EMMPRIN en líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello mediante Western blot. Se detectaron altos niveles de la proteína codificada por el gen EMMPRIN-2 en todos los 4 de las líneas celulares de cáncer.
A fin de determinar la asociación entre EMMPRIN-2 expresión y la progresión y metástasis de HNC, nos en comparación expresión de ARNm de EMMPRIN-2 en 26 casos de tumores metastásicos y 25 casos de tumores sin ningún signo de metástasis local y distante. Si bien se detectó marginalmente mayor expresión EMMPRIN-2 en los tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes de pacientes con tumores no metastásicos (Fig. 1B), marcadas diferencias en EMMPRIN-2 expresión se observaron entre los tumores y los tejidos normales de control de pacientes con metástasis tumores (Fig. 1B). Por otra parte, EMMPRIN-2 expresión fue significativamente mayor en los tumores metastásicos que en los tumores no metastásicos (Fig. 1B). No se encontraron diferencias significativas en el género o la edad de los pacientes con tumores metastásicos y no metastásicos.
Los resultados de los tejidos HNC se ve confirmado por los análisis realizados en las líneas celulares CECC (ACCM, Tca8113, y TSCCA SCC25). EMMPRIN-2 y EMMPRIN-4 fueron los principales isoformas que son expresados en las 4 líneas de células, y los niveles relativos de expresión de EMMPRIN-2 fueron mucho mayores en las líneas celulares de cáncer (que van desde 0,05 hasta 0,15, Fig. 1C) que en los HNC tejidos no cancerosos (que promedió aproximadamente 0,01, Fig. 1A). También se detectaron altos niveles de proteína que fueron codificados por el gen EMMPRIN-2 en todas las líneas celulares del cáncer de 4 mediante Western blot (Fig. 1D).
2. EMMPRIN-2 promueve la cabeza y la invasión de células del cáncer del cuello, la migración y la adhesión in vitro, in vivo y la metástasis
Para determinar el papel funcional de EMMPRIN-2 sobre-expresión en la invasión, la migración y la adhesión de las células HNC , experimentalmente sobreexpresado y abajo reguladas EMMPRIN-2 expresión utilizando un vector exógeno EMMPRIN-2 y la expresión siRNA (siEMMPRIN-2) en las líneas celulares de cabeza y cuello, ACCM y Tca8113. Como se muestra en la Figura 2, la expresión de EMMPRIN-2 cabeza promovido y la invasión de células del cáncer del cuello, la adhesión y la migración mejorada, tanto en la ACCM y líneas celulares Tca8113. Por el contrario, experimental baja regulación de EMMPRIN-2 utilizando ARNsi atenuada invasión celular, la migración y la adhesión en las líneas celulares analizadas (figs. 2A, B y C).
sobreexpresión exógena de EMMPRIN-2 utilizando una expresión construir mejorada cabeza y la invasión de células de cáncer de cuello (A), la migración (B) y la adhesión (C), mientras que la baja regulación de EMMPRIN-2 utilizando siRNA (siEMMPRIN-2) suprimió la cabeza y la invasión de células de cáncer de cuello (A), la migración ( B) y la adhesión (C). Las diferencias en la invasión celular, la migración y la adhesión entre los grupos construct- o siRNA transfectadas y los controles simulados fueron estadísticamente significativas (
p
& lt; 0,05). Los efectos de EMMPRIN-2 expresión en la metástasis tumoral in vivo se investigaron más en modelos de ratón desnudo. líneas celulares de cáncer (D) Tca8113 de cabeza y cuello con forma estable expresan EMMPRIN-2 o un vector de control mock se inyectaron por vía intravenosa en ratones desnudos. focos metastásicos en los pulmones de ratones desnudos se calcularon en la semana 6 después de la inyección. El número medio de focos metastásicos en los pulmones de los ratones con los EMMPRIN-2 células que expresan fue 28,4 en comparación con 6,4 en los pulmones de los ratones inyectados con las células que portan el vector de control (
p
& lt; 0,01).
Hemos ampliado aún más nuestras observaciones in vitro para examinar los efectos de EMMPRIN-2 sobre la metástasis de células HNC in vivo. Tca8113 células establemente sobre-expresión de EMMPRIN-2 o el vector de control se inyectaron por vía intravenosa en ratones desnudos a través de la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron 6 semanas después de las inyecciones y se diseccionaron los pulmones, se fijaron con formalina y embebido en parafina neutral tamponada con fosfato. focos metastásicos en los pulmones de los ratones desnudos se contaron microscópicamente en H & amp; E manchado secciones de tejido. se observaron significativamente mayor número de focos metastásicos en los pulmones de ratones que habían sido inyectados con células que expresan Tca8113 EMMPRIN-2. El número medio de focos metastásicos en los pulmones de los ratones con los EMMPRIN-2 células que expresan fue 28,4, en comparación con 6,4 en los pulmones de los ratones que habían sido inyectados con las células Tca8113 que llevan el vector de control (Fig. 2D).
3. EMMPRIN-2 sobreexpresión promueve la secreción de las moléculas de señalización extracelular de MMP-2, uPA y catepsina B en células de cáncer de cabeza y cuello
EMMPRIN ha sido bien demostrado para mejorar la invasión de células de cáncer en varios tumores malignos humanos mediante el aumento de la expresión de las moléculas de señalización extracelular de MMP-2 y uPA [6], [10], [31], [32]. Además, la catepsina B, un miembro de la familia catepsina enzima lisosomal proteolítica, también se ha informado a desempeñar un papel crucial en la invasión del cáncer y la metástasis [33]. Para identificar los mecanismos subyacentes que gobiernan los efectos de EMMPRIN-2 en cáncer de células invasión y metástasis, se analizó la expresión y secreción de uPA, catepsina B y MMP-2 en células de cáncer de cabeza y cuello que modulan después exógenamente la expresión de EMMPRIN-2. La transfección de un vector de expresión EMMPRIN-2 o siRNA (siEMMPRIN) mayor o atenuado la expresión de EMMPRIN-2 en el nivel de mRNA tanto en la ACCM y células Tca8113 selectivamente, mientras que la expresión de las otras isoformas EMMPRIN, uPA, la catepsina B y MMP -2 mantenido al margen (Fig. 3A). Se observaron resultados similares cuando expresión de la proteína se detectó mediante Western Blot (Fig. 3B).
Los niveles de expresión de mRNA de uPA, catepsina B, MMP-2 y diferentes isoformas EMMPRIN en la cabeza y las células cancerosas del cuello (A) fueron examinados después de la expresión exógena de EMMPRIN-2. La transfección de un vector de expresión EMMPRIN-2 o siRNA (siEMMPRIN) mayor o atenuado los niveles de expresión de ARNm de EMMPRIN-2 tanto en las células Tca8113 ACCM y selectivamente, mientras que la expresión de otras isoformas EMMPRIN, uPA, la catepsina B y MMP-2 no se vio afectado (
p Hotel & gt; 0,05). hallazgos de expresión (B) El ARNm se confirmaron mediante el análisis de expresión de la proteína usando transferencia Western. (C) Detección de extracelular MMP-2, la catepsina B y de uPA mediante ELISA. MMP-2, la catepsina B y la secreción de uPA en el medio de cultivo se incrementa en células que habían sido transfectadas con el vector de expresión EMMPRIN-2, mientras que la secreción se redujo en 2 EMMPRIN células siRNA transfectadas (
p
& lt; 0,05). (D) Análisis de la actividad extracelular MMP-2 usando un ensayo de zimografía de gelatina. la actividad extracelular de MMP-2 se incrementó después de EMMPRIN-2 expresión fue reforzada, mientras que la actividad de MMP-2 se redujo después EMMPRIN-2 desmontables expresión.
Además, se examinaron los niveles extracelulares de las tres proteínas usando ELISA. Los niveles extracelulares de MMP-2, uPA y catepsina B en el medio de cultivo celular se incrementaron en EMMPRIN-2 vector de expresión de la transfección y se redujeron por EMMPRIN-2 siRNA transfección en células Tca8113 (Fig. 3C) ACCM y. Estos hallazgos sugieren que EMMPRIN-2 promueve específicamente la secreción extracelular, en lugar de la expresión, de uPA, MMP-2 y catepsina B en células de cáncer de cabeza y cuello. Los efectos de EMMPRIN-2 sobre MMP-2 secreción extracelular se verificaron adicionalmente usando un ensayo de zimografía de gelatina. Como se muestra en la figura 3D, extracelular actividad de MMP-2 se incrementó tanto en las células ACCM y Tca8113 que habían sido transfectadas con el vector de expresión EMMPRIN-2, mientras que extracelular actividad de MMP-2 se redujo en las líneas celulares que habían sido transfectadas con EMMPRIN-2 siRNA (Fig. 3D).
4. Catepsina B es un importante mediador de los efectos de EMMPRIN-2 sobre la invasión, la migración y adhesión de células de cáncer de cabeza y cuello
Para determinar el papel funcional de la catepsina B en inducida por la invasión EMMPRIN-2, la migración y adhesión, que el regulado expresión de catepsina B en las células que sobreexpresan Tca8113 EMMPRIN-2 usando catepsina B siRNA. El tratamiento con catepsina B siRNA resultó en reducciones correspondientes en la catepsina B mRNA y los niveles de proteína, tanto en las células Tca8113 sobreexpresan parentales y EMMPRIN-2, mientras que EMMPRIN-2 y MMP-2 no se vieron afectados por la catepsina B transfección (Figs. 4A y B). la secreción extracelular de la catepsina B también se redujo mediante el tratamiento siRNA en células Tca8113, tanto en presencia como en ausencia de EMMPRIN-2 sobreexpresión (Fig. 4C). Como se observa en los experimentos descritos anteriormente, las células que sobreexpresan Tca8113 EMMPRIN-2 muestra aumento de la invasión celular, la migración y la adhesión en comparación con las células parentales Tca8113 (Figura 4D). Por el contrario, la baja regulación de la catepsina B utilizando siRNA inhibe significativamente la invasión, la migración y la adhesión de las células Tca8113 sobreexpresan EMMPRIN-2 (Fig. 4D), que implican a la importancia funcional de la catepsina B en EMMPRIN-2-señalización mediada por la invasión tumoral y . metástasis
(a) El tratamiento con catepsina B siRNA dado lugar a las correspondientes reducciones en los niveles de ARNm de la catepsina B en tanto EMMPRIN-2 sobreexpresión y Tca8113 células parentales (
p Hotel & lt; 0,05), mientras que EMMPRIN -2 y MMP-2 no se vieron afectados por la catepsina B siRNA transfección (
p Hotel & gt; 0,05). (B) Los efectos sobre la catepsina B, EMMPRIN-2 y MMP-2 expresión siguientes catepsina B siRNA transfección en EMMPRIN-2 sobreexpresión y Tca8113 células parentales más fueron confirmados mediante análisis de transferencia Western. (C) La secreción extracelular de la catepsina B también se redujo mediante el tratamiento siRNA en células Tca8113 tanto en presencia como en ausencia de EMMPRIN-2 sobreexpresión (
p
& lt; 0,05). (D) Como se observa en los experimentos anteriores, las células que sobreexpresan Tca8113-2 EMMPRIN muestran una mayor invasión celular, la migración y la adhesión en comparación con células parentales Tca8113. Por el contrario, la baja regulación de la catepsina B utilizando siRNA inhibe significativamente la invasión, la migración y la adhesión de las células que sobreexpresan Tca8113 EMMPRIN-2.
Discusión
A pesar de los avances que se han logrado en el tratamiento de la cabeza localmente avanzado y cáncer de cuello, el pronóstico sigue siendo pésimo, y la supervivencia a los 5 años no supera el 40% [34]. La recurrencia local y metástasis son responsables de la mayoría de las muertes por cáncer de cabeza y cuello.