Extracto
progreso significativo se ha logrado hacia la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de mama; sin embargo, se sabe mucho menos acerca de las características biofísicas celulares asociados. Con este fin, se utiliza la microscopía confocal de tiempo transcurrido para investigar la interacción entre la motilidad celular, en tres dimensiones (3D) la rigidez de la matriz, la arquitectura de la matriz, y el potencial de transformar en una serie la progresión del cáncer de mama de células epiteliales (MEC). Usamos un modelo de progresión del cáncer de mama bien caracterizado en que MECs MCF10A derivadas de seres humanos sobreexpresan ErbB2 o bien, 14-3-3ζ, o ambos ErbB2 y 14-3-3ζ, con el vector vacío como control. ensayos de la motilidad celular mostraron que la sobreexpresión de ErbB2 MECs solo exhibió alta migración notablemente las velocidades cuando se cultivan encima de matrices (2D) de dos dimensiones, mientras que la sobreexpresión de 14-3-3ζ solo la mayor migración suprimida encima de matrices en 2D (en comparación con MECs no transformadas). Nuestros resultados también sugieren que la co-sobreexpresión de la 14-3-3ζ y proteínas ErbB2 facilita capacidad migratoria de células en matrices en 3D, tal como se refleja en la velocidad de la migración celular. Además, 3D matrices de rigidez suficiente pueden obstaculizar significativamente la capacidad migratoria de las células transformadas parcialmente, pero el aumento de la rigidez de la matriz 3D tiene un efecto menor sobre el comportamiento migratorio agresivo exhibido por las células transformadas totalmente que co-sobreexpresan ErbB2 y tanto 14-3-3ζ. Finalmente, este estudio muestra que para MECs que poseen potencial de transformación parcial o total, los que sobreexpresan ErbB2 solo muestran la mayor sensibilidad de la velocidad de migración de las células a la matriz arquitectura, mientras que aquellos que sobreexpresan 14-3-3ζ solo exhiben la menor sensibilidad a la arquitectura de matriz. Teniendo en cuenta el conocimiento actual del mecanobiología cáncer de mama, estos hallazgos sugieren que en general la motilidad celular está gobernada por una compleja interacción entre la mecánica de matrices y potencial de transformación
Visto:. Baker, EL, Srivastava J, Yu D, BONNECAZE RT, Zaman MH migración de células (2011) cáncer: Roles integrado de la mecánica de matrices y potencial de transformación. PLoS ONE 6 (5): e20355. doi: 10.1371 /journal.pone.0020355
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 9 Febrero 2011; Aceptado: April 19, 2011; Publicado: 27 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Baker et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue posible gracias al Fondo United Negro College (UNCF) /Merck Graduados de Ciencias Investigación Disertación de becas para ELB, la Organización para la Educación Filantrópica (PEO) Premio Académico al ELB, el Fondo Semilla Charles Tate Fundación UT a MHZ y DY, y los Institutos nacionales de fondos para la salud (1R01CA132633) para MHZ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La gran mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer de mama resultan de los tumores metastásicos; por lo tanto, la comprensión de la interacción entre el microambiente celular y el potencial metastásico del cáncer de mama es de vital importancia para el desarrollo de tratamientos eficaces para esta enfermedad. un progreso significativo se ha logrado hacia la revelación de los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de mama [1], [2]; Sin embargo, la caracterización cuantitativa de los atributos biofísicos celulares asociadas sigue siendo incompleta. Fundamentalmente, la metástasis procede a través de la migración y la invasión de las células cancerosas a través de matriz variable extracelular (ECM) ambientes, y los estudios han demostrado que la migración celular es de hecho sensible a la matriz propiedades mecánicas [3], [4], [5]. Sin embargo, las relaciones entre los sistemas de nivel de la mecánica de matrices, progresión de la enfermedad, y la motilidad celular en el cáncer de mama no se comprenden bien, especialmente con respecto a (3D) de entornos tridimensionales fisiológicamente relevantes de la matriz.
Durante las últimas dos décadas , se han identificado los principales biomarcadores de cáncer de mama y vinculado a las etapas específicas de la enfermedad. Dos factores importantes son la ErbB2 (HER2 /neu) y 14-3-3ζ proteínas, tanto de cuya sobreexpresión se ha correlacionado con un pronóstico clínicos pobres de pacientes con cáncer de mama [6], [7]. ErbB2 y 14-3-3ζ se ha demostrado de manera similar para inducir características celulares in vitro que son comparables a las presentaciones clínicas. ErbB2 es una tirosina quinasa receptor transmembrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico de las proteínas y está implicado en múltiples vías de señalización que modulan el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis y otros procesos celulares críticos [8]. Análogamente, MECs que están diseñados para sobreexpresar ErbB2 se han demostrado que presentan hiperplasia luminal y llenado en cultivo 3D, aunque no completa la transformación y la invasión [9], [10]. ErbB2 es, sin duda, una de las moléculas más estudiadas en el campo del cáncer de mama [11] y es un objetivo fundamental para el desarrollo de fármacos. De hecho, dada su capacidad para conferir resistencia a ciertos tipos de terapia del cáncer y su valor pronóstico, la determinación de su situación con respecto a los casos de cáncer de mama recién diagnosticados se ha convertido en una práctica estándar [12]. Sorprendentemente, la proteína ErbB2 se sobreexpresa en más del 50% de los cánceres en etapa inicial no invasivo de mama (carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal in situ) [13]; sin embargo, se sobreexpresa en sólo aproximadamente el 25% de los de fases posteriores cánceres de mama invasivos y metastásicos [7]. Explicación de estos aparentemente contradictorios perfiles de expresión de ErbB2 ha eludido a los investigadores hasta la fecha; Sin embargo, los resultados aquí presentados sugieren que este fenómeno puede explicarse en parte por una células epiteliales mamarias (MEC) sensibilidad a la arquitectura de la matriz.
La proteína 14-3-3ζ pertenece a una gran familia de siete 14- 3-3 proteínas reguladoras que son ampliamente expresan y participan en una variedad de procesos homeostáticos celulares, incluyendo una supervivencia general de la célula /mecanismo de anti-apoptótica [14]. Se ha demostrado que la sobreexpresión de 14-3-3ζ confiere MECs en cultivo 3D con una resistencia significativa a la anoikis [15] (un tipo de apoptosis que se produce cuando las células epiteliales se desprenden de ligandos extracelulares), que promueve relleno luminal y conduce hacia MECs transformación [16]. La sobreexpresión de 14-3-3ζ También se ha demostrado que induce características morfológicas notables de transición epitelial-mesenquimal, que son característicos de la progresión hacia un fenotipo invasivo [9], [15], [17]. Por otra parte, los análisis de biopsias de pacientes indican que más del 40% de los cánceres de mama metastásicos sobreexpresan esta proteína [6]. A pesar de sus capacidades para confieren las células no transformadas con los atributos oncogénicos, la sobreexpresión de ErbB2 ni tampoco 14-3-3ζ por sí sola es suficiente para conferir una completa transformación in vitro. Sin embargo, su sobreexpresión cooperativa se ha demostrado que promover la progresión del carcinoma no invasivo para el cáncer invasivo in vitro y también está asociado con la progresión del carcinoma ductal in situ al cáncer de mama invasivo y metastásico en pacientes [9].
Given previamente establecidos correlaciones entre biomarcadores de cáncer de mama y la progresión metastásica, así como el conocimiento actual de la motilidad celular y célula-matriz interacciones sustrato dependiente, las siguientes preguntas fundamentales siguen sin respuesta para MECs individuales con respecto a la mecánica de la matriz: (1) Es MEC motilidad sensible a la rigidez de la matriz 3D? (2) ¿Es esta capacidad de respuesta relacionada con potencial de transformación? Y (3), ¿existe una relación entre la motilidad celular y potencial de transformación, dada una arquitectura de matriz determinada? En este estudio, hemos cuantitativamente investigó estas preguntas mediante el empleo de la microscopía confocal de tiempo transcurrido para investigar el efecto de la rigidez de la matriz y la arquitectura de la velocidad de la migración y la persistencia de la MEC individuales que se cultivan en la cima matrices 2D y los que están incrustadas en 3D matrices de diferentes elástica módulos. Examinamos MECs humanos derivados de potencial transformador variada con respecto a las matrices formulados a partir de tipo nativo I colágeno, que es el componente estructural primario del estroma mamaria. Nuestros estudios proporcionan nuevos conocimientos sobre mecanobiología cáncer de mama mediante la demostración de que la rigidez de la matriz y la arquitectura pareja con potencial transformador de dirigir las capacidades migratorias de MEC.
Resultados
Con el fin de explorar la relación entre el cáncer de mama la transformación de la motilidad celular y el potencial con respecto a la mecánica de matrices, se analizaron una serie progresión del cáncer bien caracterizado establecida a partir de la línea no transformada, humano derivado de las células MCF10A. Se examinaron cuatro sublíneas MCF10A, cuyo grado de potencial de transformación se caracteriza de acuerdo a sus características de crecimiento y las características morfológicas cuando se forman las estructuras acinares en cultivo 3D [9]. Como se ha descrito anteriormente [9], [17], las sublíneas (Fig. 1
Un
) consistió en [1], una línea de 10A.vec no transformado de células de control, [2] 10A.ErbB2-A hiperplásico, línea celular transformada parcialmente resistentes a la apoptosis que sobreexpresa ErbB2, [3] 10A.14-3-3ζ-a, y la línea celular despolarizado resistentes a la apoptosis morfológicamente anormales parcialmente transformado que sobreexpresa 14-3-3ζ, y [4] 10A.ErbB2.ζ-una línea de células invasoras, totalmente transformado que overepxresses tanto ErbB2 y 14-3-3ζ.
(
un
) ductal /lóbulo vista en corte transversal de una sola mama MCF10A la progresión del cáncer de serie: 10A.vec (no transformadas), 10A.ErbB2 (parcialmente transformado), 10A.14-3-3ζ (parcialmente transformado), y 10A.ErbB2.ζ (completamente transformados). (
B Opiniones) Media & lt velocidad de migración de las células;
S Hotel & gt; lo alto de matrices 2D; p-valores son con respecto a & lt;
S Hotel & gt; de las células 10A.vec. (
C
) tiempo de persistencia de la población celular
P
lo alto de matrices 2D (promedio
R
= 0,87). Todos los valores de p. (*, P = 0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) determinados a partir de
t
-pruebas para muestras no apareadas
Efecto de la transformación de potencial sobre la motilidad celular encima de 2D matrices
motilidad celular se examinó en primer lugar con respecto a la arquitectura de matriz 2D, que es análoga a la capa de MEC que recubre la superficie interna de la membrana ductal sótano en la etapa inicial de la invasión en el estroma-I colágeno rico que subyace en vivo (Fig. 1
Un
). En este entorno, la sobreexpresión de ErbB2 MEC solo emigrado con la velocidad media más rápida migración & lt;
S Hotel & gt; (Fig. 1
B Opiniones). células no transformadas mostraron el segundo más alto grado de motilidad, seguido por sublíneas que sobreexpresan 14-3-3ζ (Fig. 1
B
). patrones de motilidad bidimensionales de parcialmente transformadas y las células transformadas totalmente también son consistentes con el comportamiento de la motilidad transwell que se ha informado anteriormente: las células 10A.ErbB2 movían con las velocidades más altas, seguido de 10A.ErbB2.ζ y luego por 10A.14-3 -3ζ [9]. tiempo de persistencia
P
(obtenido de ajuste de la curva con el modelo persistente paseo aleatorio [18], véase Materiales y Métodos) de las células no transformadas era mayor que el de todas las sublíneas que poseen la transformación de potencial (Fig. 1
C
).
Efecto de la transformación de potencial sobre la motilidad celular en 3D matrices
a continuación, la motilidad celular se evaluó con respecto a la arquitectura de la matriz en 3D, que es análoga a la in vivo entorno en el que las células genéticamente alterada (transformadas parcial o totalmente) han invadido su membrana basal local y penetrado en el estroma subyacente (fig. 1
Un
). ensayos de movilidad celular mostró que el potencial de transformación tuvo un efecto notable en la velocidad de migración & lt;
S Hotel & gt; en 3D matrices relativamente conformes (Fig. 2
A, España rigidez
G
'
c
= 104 Pa). MEC no transformadas (10A.vec) exhibieron la velocidad media más baja, mientras que MEC totalmente transformadas (10A.ErbB2.ζ) emigraron con la velocidad más rápida (Fig. 2
B Opiniones). MEC que sobreexpresan ErbB2 o 14-3-3ζ solo, aunque parcialmente transformado, no mostraron un cambio notable en la motilidad relación con las células 10A.vec (Fig. 2
B Opiniones) en matrices 3D compatibles. Por otra parte, la velocidad de migración de & lt;
S Hotel & gt; en matrices compatibles con una correlación negativa con el índice de esfericidad de la morfología celular
Ψ Windows que se informó anteriormente de estas sublíneas cuando se cultivan en las mismas matrices 3D [17]. Como se muestra en la Fig. 2
B Opiniones (recuadro) [17],
Ψ
disminuye a medida que & lt;
S Hotel & gt; aumenta, de acuerdo con el perfil MEC transformación. En las matrices compatibles, tiempo de persistencia de la población de células
P
era más bajo para las células invasoras completamente (Fig. 2
E
).
(
Un
) Escaneo micrografías electrónicas de conformes (104 Pa) y rígidos (391 Pa) 3D matrices; barra de escala es de 2 micras. (
B Opiniones) Media & lt velocidad de migración de las células;
S Hotel & gt; en matrices 3D compatibles. (Recuadro) esfericidad celular
Ψ
como tomado de Baker et al. [17]; p-valores son con respecto a & lt;
S Hotel & gt; (Y
Ψ
) de las células 10A.vec. (
C
) Media & lt velocidad de migración de las células;
S Hotel & gt; en 3D matrices rígidas; p-valores son con respecto a & lt;
S Hotel & gt; de las células 10A.vec. (
D
) Porcentaje de disminución de & lt;
S Hotel & gt; de células dentro de matrices compatibles relativos a las células en matrices rígidas. El p-valores que se muestran en negro corresponden a la diferencia en & lt;
S Hotel & gt; entre las células dentro de las matrices compatibles y las mismas células dentro de las matrices de rigidez; los p-valores que se muestran en rojo corresponden a la diferencia en% de disminución en & lt;
S Hotel & gt; entre las sublíneas. (
E
) tiempo de persistencia de la población celular
P Hoteles en 3D matrices conformes y rígidos (promedio
R
= 0,87). (
F
) Porcentaje de disminución en & lt;
S Hotel & gt; de células encima de 2D matrices con respecto a las células dentro de matrices 3D compatibles. El p-valores que se muestran en negro corresponden a la diferencia en & lt;
S Hotel & gt; entre las células encima de matrices 2D y las mismas células en 3D matrices compatibles; los p-valores que se muestran en rojo corresponden a la diferencia en% de disminución en & lt;
S Hotel & gt; entre las sublíneas. Todos los valores de p. (*, P = 0.05; **, p≤0.01; ***, p≤0.001) determinados a partir de
t
-pruebas para muestras no apareadas
efecto de la matriz de rigidez en 3D sobre la motilidad celular
en 3D matrices relativamente más rígidos (Fig. 2
Un
, rigidez
G
'
c
= 391 Pa ), los ensayos de la motilidad celular revelaron un comportamiento significativamente diferente de la observada en matrices conformes. En el entorno de la matriz rígida, MEC totalmente transformadas migran más rápido que todas las otras sublíneas (Fig. 2
C
). Sin embargo, las células parcialmente transformadas (10A.ErbB2 y 10A.14-3-3ζ) migraron notablemente más lento que tanto las células no transformadas y completamente transformadas. El cambio en la motilidad celular entre las matrices conformes y rígidos se muestra más como un porcentaje de disminución de la velocidad de migración, de acuerdo con el perfil de transformación (Figura 2
D
.); esta representación muestra que entre las sublíneas cuya velocidad de migración fue sensible a la rigidez de la matriz 3D, la motilidad de las células completamente transformadas se menos afectada por el aumento de la rigidez de la matriz. En comparación con las células en matrices 3D compatibles, tiempo de persistencia de células
P
en 3D matrices rígidas (Fig. 2
E
) fue menor para las células que poseen el potencial de transformación parcial o total, pero notablemente superior para células no transformadas (10A.vec).
efectos integrados de la arquitectura de la matriz, la rigidez de la matriz, y la transformación de potencial sobre la motilidad celular
La comparación de las velocidades de migración de células encima de 2D matrices a las incluidas dentro similares matrices 3D muestra que la arquitectura de la matriz tiene un efecto significativo en la motilidad celular. Figura 2
F
representa este cambio en la motilidad como un porcentaje de disminución en la velocidad de las células encima de matrices en 2D como en comparación con aquellos dentro compatibles (104 Pa) matrices en 3D. De hecho, la motilidad en 3D matrices se reduce significativamente para todos los sublíneas de células examinadas; sin embargo, de las sublíneas que poseen potencial de transformación parcial o total, las células que sobreexpresan ErbB2 solo (10A.ErbB2) mostró la mayor sensibilidad a la arquitectura de matriz. La sublínea 10A.ErbB2 experimentó un significativo 94% de disminución (reducción de 15 veces) en la velocidad de migración de las células cuando en matrices en 3D en comparación con que cuando se unen a estas células a matrices en 2D.
El examen de parcelas 3D Windrose ( la Fig. 3) proporciona un amplio campo de visibilidad resumen de la naturaleza migratoria exhibida por esta serie progresión MCF10A (filas representan la condición de matriz, mientras que las columnas representan sublínea).
XY
un plano confocal de imágenes (Fig. 4) también muestran células representativas típicas y características morfológicas exhibidas por cada uno de los cuatro sublíneas, que podrán llevar a alguna asociación de datos migratorios que aquí se presentan, así como los resultados de rigidez celular que hemos informado anteriormente [17]. MEC sobreexpresan 14-3-3ζ salientes de forma tubular sola expuestas (Fig. 4, las flechas verdes) [19] en todas las condiciones de la matriz, mientras que, extensiones similares a varillas delgadas co-sobreexpresión de ErbB2 y tanto 14-3-3ζ exhibido ( La Fig. 4, quilates amarillo) para todas las condiciones de la matriz. Sobreexpresan ErbB2 células solas mostraron extensiones mínimas en forma de barra y sólo cuando se inserta en (391 Pa) matrices relativamente rígidas, mientras que las sublíneas MEC restantes muestran un grado similar de protuberancia en ambas matrices conformes y rígidas. Las células que migran más rápido en las matrices 2D (10A.vec y 10A.ErbB2) exhibieron los procesos celulares en forma de hoja en este entorno (figura 4, los soportes azules.) Guía
Top línea celular listas de fila.; columna de la izquierda enumera la condición de matriz. Las células en matrices 2D exhiben el más alto grado de movilidad, seguido por las células dentro compatible (104 Pa) 3D matrices y luego por las células dentro rígido (391 Pa) 3D matrices
Top línea celular listas de fila.; columna de la izquierda enumera la condición de matriz. quilates amarillo indican los procesos celulares delgadas, similares a barras. Las flechas verdes indican protuberancias celulares de forma tubular. soportes azules indican protuberancias celulares en forma de hoja.
Discusión
motilidad celular puede estar influenciada por una serie de parámetros, incluyendo gradientes químicos extracelulares [20], las propiedades mecánicas de la matriz [4] , matriz de degradación de [21], la contractilidad intracelular [5], y adhesividad celular [22]. Cada vez más, las células cancerosas se han convertido en el foco de estudios que exploran el efecto del medio extracelular en la homeostasis celular [4], [23], la viscoelasticidad celular [24], [25], y la motilidad celular. Si bien se han logrado avances significativos en el descubrimiento de algunos de los mecanismos moleculares y las vías de señalización que son la base de mama y otros cánceres [8], [14], que se conoce acerca de los atributos biofísicos celulares asociados mucho menos. Durante mucho tiempo se ha establecido que la metástasis del cáncer de mama se ejecuta fundamentalmente por la migración de células de una masa tumoral primaria a través de la estroma subyacente y que la densidad de colágeno de mama se correlaciona con la progresión del cáncer de mama [26]. Por otra parte, la capacidad migratoria de células de cáncer puede ser influenciada por la rigidez de la ECM [5]. Sin embargo, la relación entre el entorno mecánico celular externa y la motilidad de las células de cáncer de mama no se entiende. La interacción entre estos parámetros se confunde además por la etapa de progresión del cáncer de mama y también puede guardar relación con propiedades mecánicas intracelulares [17]. Con el fin de investigar la interacción entre la mecánica de matrices, la motilidad celular, y potencial de transformación en cáncer de mama, hemos utilizado la microscopía confocal de tiempo transcurrido para medir la velocidad de migración y la persistencia de MECs que están unidos a matrices en 2D y los que se inserta dentro de 3D matrices, ambos compuestos por colágeno tipo I nativa. Mediante el examen de un cáncer de mama progresión serie de sublíneas que se derivan de una única línea parental MEC, somos capaces de comparar directamente kinesis de células que poseen distintas potencial transformador.
El microambiente extracelular in vivo es un medio heterogéneo que consiste de varios componentes, con el equilibrio relativo y la importancia de estos componentes dependiendo de la extensión de la progresión del cáncer. En este estudio, hemos investigado la motilidad de los MECs que tienen la capacidad de navegar libremente su ECM. Para el caso de matrices en 3D, esto es fisiológicamente más comparable a MECs individuales que han invadido su membrana ductal sótano local y pueden migrar dentro del estroma subyacente (Fig 1
A
.); para el caso de matrices en 2D, esto es más análoga a células de cáncer de etapa temprana que pueden exhibir una mayor motilidad a lo largo de la membrana ductal sótano interior en la etapa inicial de la invasión en el colágeno subyacente I-rico estoma (Fig. 1
A
). Examinamos células individuales que son totalmente acoplado con la matriz (pero sin ataduras a otras células) con el fin de controlar experimentalmente el grado y tipo de unión de la superficie celular; por lo tanto, los MECs examinados aquí de forma adjuntos célula-matriz a través de las integrinas beta 1 [27].
El examen de la migración de células con respecto a ambas matrices 2D y 3D ofrece una amplia perspectiva de la motilidad MEC (Fig. 3). La sobreexpresión de ErbB2 se ha demostrado previamente para otorgar MECs con una mayor capacidad de proliferación [10], y también se ha asociado clínicamente con cáncer de mama en estadio temprano (DCIS) [9]. De hecho, el entorno de la matriz de las primeras etapas de cáncer de mama (CDIS) se asemeja más a la de una arquitectura de matriz 2D de lo que hace un entorno 3D de la matriz (Fig. 1
Un
). Cuando se cultiva la cima de matrices 2D, que sobreexpresan ErbB2 MEC solo emigrado con la velocidad más rápida (Figura 1
B Opiniones.); células no transformadas mostraron el segundo más alto grado de motilidad, seguido por sublíneas que sobreexpresan 14-3-3ζ (Fig. 1
B
). La velocidad de migración significativamente menor de sublíneas que sobreexpresan 14-3-3ζ relativos a las dos sublíneas restantes sugiere que la regulación a la baja de E-cadherina [9], [15] se puede producir un efecto menor sobre la motilidad celular mediada por encima de 14-3-3ζ matrices 2D que en MECs que tienen la tarea de navegar por un entorno 3D de la matriz. De nuevo, esto pone de manifiesto la compleja interacción entre la transformación de potenciales y la mecánica de la matriz en el gobierno de la motilidad celular. Alta persistencia de las células no transformadas en relación con las restantes sublíneas genéticamente alterados (Fig. 1
C
) indica que el potencial de transformar podrá conceder MEC con una mayor sensibilidad a la topografía 2D matriz, que se reflejaría en la celda cambiando al azar trayectorias en comparación con los movimientos de la célula más dirigida de células no transformadas. Un aumento de la sensibilidad a la matriz señales topográficas debería ser ventajoso para las células que tratan de invadir su membrana basal locales
.
Nuestros resultados sugieren que dentro de las matrices relativamente compatibles con 3D (104 Pa), transformando potencial en relación con características morfológicas son la dominar los factores que influyen en la motilidad celular. Como se muestra en la Fig. 2
B Opiniones, células transformadas totalmente (10A.ErbB2.ζ) emigraron con la velocidad más rápida de & lt;
S Hotel & gt; en este ambiente, seguido por las células que sobreexpresan 14-3-3ζ morfológicamente alterados, y luego
La comparación de la motilidad MEC en matrices compatibles con el de MEC en matrices más rígidos sugiere que las células capacidad migratoria no es simplemente un efecto de transformar potencial; más bien, se rige por un equilibrio de atributos biofísicos de células intrínseca, junto con la mecánica de matrices. La ligera mejora de las extensiones delgadas, similares a barras exhibido por 10A.ErbB2 células en matrices más rígidos (Fig. 4), aunque sutil, puede llevar a la asociación de capacidad de detección de alta rigidez que hemos informado anteriormente de esta sublínea [17]. Sin embargo, aunque las características morfológicas de una sublínea dado fueron similares en 3D matrices de diferente rigidez (Fig. 4), los perfiles de velocidad de migración de todo el sistema muestran distintos patrones en relación con la matriz de rigidez (Fig. 2
B
y
C
y la Fig. 3). En ambos entornos de matriz, MEC no transformadas migran más lentamente que MEC totalmente transformadas, que migraron con las velocidades más rápidas. células Sin embargo, en las matrices más rígidos (391 Pa), parcialmente transformadas (10A.ErbB2 y 10A.14-3-3ζ) migran significativamente más lento que las células no transformadas. El aumento de la rigidez de la matriz dio lugar a una disminución de la capacidad migratoria de las células completamente transformadas, pero este efecto fue aún más pronunciada para las células transformadas parcialmente (Fig. 2
D
). Estos resultados sugieren que una rigidez suficiente de la matriz 3D dependiente de la densidad puede jugar un papel en obstaculizar significativamente la capacidad migratoria de células parcialmente transformadas; sin embargo, este aumento de la rigidez de la matriz en 3D no puede ser suficiente para superar el comportamiento agresivo exhibido por células completamente invasivos, como se evidencia por la única reducción moderada en la velocidad de migración de las células 10A.ErbB2.ζ (Fig. 2
D
). Los resultados de nuestro estudio previo de estas sublíneas mostraron que en las matrices más rígidos, las células 10A.ErbB2 exhiben el más alto rigidez intracelular, mientras que las células 10A.ErbB2.ζ completamente transformadas presentan una rigidez moderada, y las células 10A.14-3-3ζ exhiben una rigidez relativamente baja [17]. En total, teniendo en cuenta los datos de la motilidad actuales junto con los resultados de nuestras investigaciones previas sugieren que la migración MEC en 3D los entornos de producto en un equilibrio óptimo entre el perfil genético transformación, rigidez intracelular, características morfológicas ventajosas, y la rigidez de la matriz. Por lo tanto, un aumento en la velocidad de células migratorias que de lo contrario puede resultar de transformación parcial o total puede ser mitigado en parte por la rigidez de la matriz dependiente de la densidad.
El análisis final de este estudio (Fig. 2
F
) presenta un resultado muy provocativa, dado que el oncogén ErbB2 se detecta con menor frecuencia en los cánceres de mama invasivos y metastásicos que en los cánceres de mama en fase inicial. De hecho, la prevalencia de la sobreexpresión de ErbB2 en el cáncer de mama invasivo y metastásico es solamente
Windows que la mitad de los cánceres en fase inicial [9], que ha sido un fenómeno desconcertante. Los resultados de nuestros ensayos de movilidad sugieren que un cambio en la arquitectura de la matriz puede estar asociada con este comportamiento. Cuando MECs transición de un cáncer en etapa temprana no invasivo para un cáncer invasivo y luego metastásico, migran desde lo alto de una superficie de la membrana basal de 2D a dentro de un estroma 3D circundante y por lo tanto experimentar un cambio en la arquitectura de la matriz (Fig. 1
A
). En este estudio, la motilidad de las células 10A.ErbB2 muestra la mayor sensibilidad a un cambio en la arquitectura de la matriz, en comparación con las otras sublíneas que poseen potencial de transformación parcial o total (Fig. 2
F
). De ello se desprende que las células que presentan una capacidad migratoria del estroma disminuido significativamente pueden ser menos propensos a invadir completamente sus fronteras locales y atravesar aún más el estroma que rodea a manifestarse más tarde como el cáncer de mama metastásico. También hay que señalar que la sobreexpresión de 14-3-3ζ migración 2D suprimió de forma significativa (Fig. 1
B
), al tiempo que mejora de forma sinérgica la migración 3D cuando ErbB2 también se sobreexpresa (Fig. 2
B
y
C
). Por lo tanto, la motilidad de las células que sobreexpresan 14-3-3ζ solo exhibió la menor sensibilidad a la arquitectura de la matriz, en comparación con 10A.ErbB2 y 10A. ErbB2.ζ células (Fig. 2
F
).
En resumen, el presente estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la motilidad del cáncer de mama mediante la demostración de que la transformación de las parejas potenciales con la rigidez de la matriz y la arquitectura para influir en el velocidad de la migración y la persistencia de la MEC. Numerosas investigaciones anteriores han contribuido significativamente a la comprensión actual mediante el examen de ErbB2 y efectos 14-3-3ζ-mediada sobre la rigidez intracelular [17], la motilidad MEC en gradientes químicos solubles [20], la migración de las células cancerosas con respecto a la disponibilidad de ligando [5] , y la motilidad inducida por matriz remodelación [28]. Mediante el empleo de imágenes en tiempo-caducado, hemos añadido a este conocimiento mediante la medición directa de la velocidad de migración del MEC, tanto cultivadas encima de matrices 2D y 3D incrustados en matrices. Las relaciones entre las características de la motilidad de células de cáncer de mama y de sustrato son complejos; una mayor clarificación de estas conexiones puede surgir de futuros estudios adicionales que examinan los efectos de la rigidez de la matriz y 2D constitución proteína de la matriz sobre la motilidad de las sublíneas que se examinan aquí. Una comprensión más clara de las interacciones MEC-matriz posee amplia promesa de que en última instancia puede dirigir el desarrollo de terapias dirigidas y la investigación traslacional enfocada cáncer.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
ensayos de movilidad se realizaron en sublíneas estables que se establecieron como se ha descrito anteriormente [9] de la línea MCF10A MEC derivada de humanos no cancerosos (proporcionado por el Dr. Robert Pauley del Instituto de cáncer Karmonos, Detroit, MI). Las líneas celulares se mantuvieron en cultivo monocapa 2D en medio DMEM /F12 de crecimiento [29] dentro de un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO
2 hasta el tiempo de experimentación.
Preparación de la matriz de colágeno y caracterización
Las matrices bidimensionales fueron creados mediante la dilución de alta concentración de Tipo 1 a 2 mg de colágeno /ml utilizando 20 l de 2,0 micras carboxilados, perlas de poliestireno fluorescentes trazadores de color verde amarillo con etanol dializa (Molecular Probes, Carlsbad, CA) (aproximadamente 2% de sólidos) y un equilibrio de M HCl 0,01; 1,5 ml de la solución se depositan entonces en el pozo de un plato de cristal inferior 35 mm y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Después de este período, la solución se aspiró, dejando sólo la capa de colágeno bead-impregnado que se había adherido a la parte inferior de vidrio (véase la Fig. S1
A
). Los platos se enjuagaron después dos veces con PBS y se almacenaron a 37 ° C, 5% de CO
2 de 45 min hasta que las células marcadas con fluorescencia se depositaron en el plato.
matrices tridimensionales se formularon de alta concentración Tipo I colágeno (BD Biosciences, San Jose, CA), que se diluyó a dos concentraciones de 2 y 4 mg /mL. colágeno partes iguales y solución neutralizante (mM Hepes 100 en 2X PBS a pH 7,3) se mezclaron con 20 l de la suspensión de perlas y un equilibrio de 5 × 10
5 células marcadas fluorescentemente en suspensión en medio de crecimiento para lograr la concentración final [ ,,,0],30] (ver Fig. S1
B Opiniones). A continuación, cada solución de matriz (1 ml) se depositó sobre la superficie de un plato inferior 35 mm de vidrio (MatTek, Ashland, MA). soluciones de matriz se deja gelificar durante 90 min a 37 ° C, 5% de CO
2, en la que 1,5 ml de medio de crecimiento se deposita encima de las matrices en 3D para proporcionar células con nutrientes adecuados durante un período de incubación de 4,5 h posterior al 37 ° C, 5% de CO
2. la rigidez de la matriz se midió usando reometría de cono y placa y se cuantifica en términos de la cizalla mayor módulo de elasticidad del gel de colágeno
G
'
c
, que se registra como 104 y 391 Pa para el Tipo 3D I colágeno geles de concentración 2 y 4 mg /ml, respectivamente, como se describe anteriormente [17]. En este manuscrito, matrices de módulo 104 Pa se conocen como relativamente compatible, mientras que las de módulo 391 Pa se describen como relativamente rígido.