Extracto
Selección de cáncer (CRC) de los pacientes colorrectales probabilidades de responder a la terapia sigue siendo un reto clínico. Los objetivos de este estudio fueron establecer qué genes se expresan diferencialmente con respecto a la sensibilidad tratamiento y se relaciona esto con el número de copias en un panel de 15 líneas celulares de CRC. las variaciones del número de copias de los genes identificados fueron evaluados en una cohorte de CRC. IC se midieron
de 50 a 5-fluorouracilo, oxaliplatino y Bez-235, un inhibidor de PI3K /mTOR. Las líneas celulares fueron perfilados usando matriz de hibridación genómica comparativa, el análisis de la expresión de genes Illumina, arrays de proteínas de fase inversa, y la secuencia específica de
KRAS
mutaciones de punto de acceso. Se observaron aumentos frecuentes en 2p, 3q, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q, 17q y las pérdidas y en 2q, 3p, 5q, 8p, 9p, 9q, 14q, 18q y 20p. regiones adquirido con frecuencia contenían
EGFR
,
PIK3CA
,
MYC
,
SMO
,
TRIB1
,
FZD1
y
BRCA2
, mientras que las regiones perdidas con frecuencia contenían
FHIT
y
MACROD2
.
TRIB1
se seleccionó para su posterior estudio. análisis de genes de enriquecimiento mostró que los genes expresados diferencialmente con respecto a la respuesta al tratamiento estaban involucrados en la señalización de Wnt, señalización del receptor de EGF, apoptosis, ciclo celular y la angiogénesis. la integración gradual de número de copias y la expresión génica de datos cedió 47 genes candidatos que se correlacionaron significativamente.
PDCD6
se expresó diferencialmente en las tres respuestas al tratamiento. microarrays de tejidos se construyeron para una cohorte de 118 pacientes con CCR y
TRIB1
y
MYC
amplificaciones se midieron usando fluorescencia
In situ
hibridación.
TRIB1
y
MYC
fueron amplificados en el 14,5% y el 7,4% de la cohorte, respectivamente, y estas amplificaciones se correlacionaron significativamente (p≤0.0001).
TRIB1
expresión de proteínas en la cohorte de pacientes fue significativamente correlacionado con Perk, Akt, y la caspasa 3 de expresión. En conclusión, un conjunto de candidatos biomarcadores predictivos de 5-fluorouracilo, oxaliplatino, y se describen BEZ235 que merecen mayor estudio. La amplificación del oncogen putativo
TRIB1
ha sido descrito por primera vez en una cohorte de pacientes con CRC
Visto:. Briffa R, Um I, Faratian D, Zhou Y, Turnbull AK, Langdon SP, et al. Análisis (2015) Multi-escala genómica, proteómica y Transcriptomic de líneas celulares de cáncer colorrectal para identificar nuevos biomarcadores. PLoS ONE 10 (12): e0144708. doi: 10.1371 /journal.pone.0144708
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 16 Junio, 2015; Aceptado: 23 Noviembre 2015; Publicado: 17 de diciembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Briffa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado en parte por la Beca de itinerarios educativos estratégica (Malta). La beca está en parte financiado por la Unión Europea - Fondo Social Europeo (FSE) en el marco del Programa Operativo II - Política de cohesión 2007-2013, "Capacitar a las personas para más empleos y una mejor calidad de vida". Este proyecto, además, fue financiado por la Investigación Médica Escocia
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) representa el 8 % de todas las muertes por cáncer [1], con la supervivencia de la variable de entre el 39% y el 65% dependiendo de la etapa en el diagnóstico [2]. El riesgo de desarrollar CRC depende de los factores genéticos y estilo de vida relacionados y aumenta marcadamente con la edad [2]. Aunque el tratamiento puede ser curativo, una proporción considerable de pacientes con CRC tiene un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad después de la cirugía y la quimioterapia [3].
Las principales vías implicadas en la carcinogénesis colorrectal incluyen, pero no se limitan a, la PI3K /mTOR, la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la vía Wnt [4], con la vía JAK /STAT, vía Hedgehog, y la vía NFkB participa también [5]. Estas vías son controlados a través de la diafonía compleja, la retroalimentación negativa, y otros mecanismos de compensación. Si bien la activación de estas vías se produce a través de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores que participan, respectivamente, de las 80 mutaciones somáticas en cualquier CRC individual, sólo 15 o posiblemente menos es probable que sean conductores esenciales de la iniciación del tumor, progresión, y /o de mantenimiento [ ,,,0],6]. Los genes más frecuentemente mutado en el CCR son
APC gratis (70-80%),
TP53 gratis (50%),
KRAS gratis (35-45%),
PIK3CA gratis (25-32%),
BRAF gratis (10-17%) y
PTEN gratis (4-5%) [7-12].
La terapia de primera línea para el CDN es por lo general la monoterapia fluoropyramidine y oxaliplatino o quimioterapia basada en irinotecan [13]. Más recientemente, los anticuerpos monoclonales, como cetuximab, panitumumab y bevacizumab se han autorizado en combinación con quimioterapia para el CCR metastásico (CCRm) [14] agentes anticancerosos selectivos y específicos con un alto índice terapéutico y menor toxicidad que los tratamientos convencionales [15]. Sin embargo, las respuestas al tratamiento son variados, con menos de un tercio de los pacientes que responden al 5-fluorouracilo [16]. Aunque
KRAS
y
BRAF mutaciones
indican resistencia a las terapias dirigidas a EGFR, alrededor de 40-70% de tipo salvaje
KRAS
pacientes con CCRm derivan poco o ningún beneficio de EGFR terapias específicas [17]. Sigue habiendo una falta de marcadores predictivos que permiten a los médicos a seleccionar a los pacientes con más probabilidades de beneficiarse de una terapia específica.
A continuación, hemos tratado de caracterizar sistemáticamente un panel de líneas celulares de CRC, seleccionados para reflejar la diversidad de esta enfermedad , utilizando análisis de alto rendimiento con el fin de identificar los biomarcadores de la resistencia a los tratamientos dirigidos y no dirigidos.
Métodos
CRC línea celular panel de
Quince CRC líneas celulares eran estudiados: las líneas de células diploides cerca de DLD-1, HCT116, HCT116p53 - /-, SW48, y LoVo (todos de ECACC excepto HCT116p53 - /-, que fue un regalo del Dr. G. Smith, Universidad de Dundee, Reino Unido [18]) y las líneas de células aneuploides SW480, SW837, HT29, T84, Colo 201, Colo 320DM, LS411N, SK-CO-1, NCI H508 y NCI H716 (todos de ATCC), aparte de Colo 320DM, T84 y SW837 (todos de ECACC) .
Las líneas de células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco
®, Cat no 31885..) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; PAA, Cat. no. A15-101) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco
®, Cat. No.15140-122). Las líneas celulares se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C que contiene 5% de CO
2. Todas las líneas celulares se ensayaron para micoplasma utilizando el Venor
™ Kit GeM Mycoplasma detección (Sigma-Aldrich, Cat. No. MP0025). Cuando las líneas celulares alcanzaron el 70-80% de confluencia, que se trataron con tripsina usando 0,05% de tripsina-EDTA (1X) con rojo fenol (Gibco
®, Cat.. No 25300).
Las muestras clínicas
, incluido en parafina (FFPE) muestras de tejidos fijados en formalina de archivo se obtuvo a partir de muestras de resección de los pacientes que viven en Escocia que fueron diagnosticados con CRC entre 1996 y 2003 y eran menores de 55 años de edad en el momento del diagnóstico (se refieren a S1 Tabla). Un total de 870 pacientes había sido reclutado como se describe anteriormente [19]. Todos los casos fueron revisados por un histopatólogo gastrointestinal antes de la construcción TMA para asegurar que el tejido se compone principalmente de tumor. Todos los cánceres se llevaron a cabo una de Dukes y el acceso material y clínicos B. cohorte registros fue concedida por el Comité de tejidos, Edimburgo Experimental del Cáncer Medicina (Ref: TR029), Comité de Ética de Investigación Lothian (Ref: 08 /S1101 /41) y el sudeste de Escocia HSS (SAHSC) de bio. (Ref: SR117)
ensayos de sensibilidad de drogas
5-fluorouracilo (5-FU) 50 mg /ml solución inyectable se adquirió de Medac GmbH. El oxaliplatino (L-OHP) 5 mg /ml concentrado para solución para perfusión (Fresenius Kabi Oncología plc, Reino Unido) se obtuvo de la Farmacia del Hospital General Occidental, Edimburgo. El inhibidor dirigido BEZ235 (Cat. No. S1009) se adquirió de Selleck químicos. Cada placa de 96 pocillos constaba de seis pocillos que contenían células en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina, que sirvió como control. Se sembraron las células durante 48 h antes de la adición de los fármacos. Ocho concentraciones diferentes se utilizaron por medicamento oscila entre 5μM a 100μM (5-FU, L-OHP) y entre par de 2,5 Nm y 80 nm, (BEZ235) respectivamente. Las células se incubaron con los fármacos durante 96 h. Para determinar la viabilidad celular, se añadieron 20μL de Alamar Blue en cada pocillo durante 6 h antes de leer las placas utilizando Fluoroskan Ascenso FL. Todos los ensayos de sensibilidad a los fármacos fueron replicados al menos dos veces y seis pocillos se sembraron a cada concentración de fármaco.
una lectura promedio RFU fue tomada para cada concentración de fármaco y la viabilidad celular se calculó como un porcentaje del control no tratado. Las barras de error se calcularon utilizando la desviación estándar correlacionada de los medios. El IC
50 años para 5-FU, L-OHP y BEZ235 se determinaron utilizando el paquete de software XLfit 5.0 (Soluciones de Identificación del negocio, Reino Unido). Sin extrapolación se llevó a cabo en la definición de la IC
50 se calcularon los valores y los valores atípicos por tener un nivel de confianza mayor que 0,05.
ADN, ARN y proteínas extracción
Se extrajo el ADN genómico de cada línea celular utilizando DNeasy Tissue Kit de sangre y (Qiagen, Cat.No. 69504) según las instrucciones del fabricante. las concentraciones de ADN se verificaron mediante el espectrofotómetro NanoDrop volumen de micro-2000 (Thermo Scientific). pureza del ADN Satisfactorio fue considerado como mayor o igual a una relación de 260/280 de 1,8, lo que garantiza la contaminación de proteínas mínimo de la muestra. La calidad de las muestras de ADN se ensayó adicionalmente usando electroforesis en gel de agarosa. Después de la electroforesis, el gel se retiró cuidadosamente y las bandas de ADN se visualizaron utilizando el sistema de documentación Gel.
ARN total fue extraído de las líneas de células por duplicado utilizando el Kit de Limpieza RNeasy MinElute (Qiagen, Cat. No. 74204 ) y miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat. no. 217004). La concentración del ARN se verificó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000. Satisfactorio pureza del ARN fue considerada como una relación de 260/230 de aproximadamente 2,0.
Proteína lisados se prepararon en las que las líneas de células fueron aproximadamente 80% de confluencia, como se describe en detalle en otra parte [20]. Se determinó la concentración de proteína de los lisados por medio del ácido bicinconınico (BCA) ensayo (Sigma-Aldrich, cat. no. C2284-25ML, B9643-1L art).
KRAS
se analizó el análisis de mutaciones por secuenciación Sanger
Hotspot mutaciones en el codón 12 y 13. El conjunto de cebadores fue diseñado utilizando Primer Premier
® Software V6.0 (PREMIER Biosoft International). El primer secuencias (5 'a 3') para
KRAS
01 fueron los siguientes: ACT GGT GGT GGA GTA TTT GAT AGT GT (hacia adelante) y TGA ATT AGC TGT ATC GTC AAG GCA CT (hacia atrás).
KRAS
amplificación del exón 2 se llevó a cabo usando el HotStar alta fidelidad de la polimerasa Kit (Qiagen Calidad
®, cat. No. 202602). La reacción de PCR se realizó en el DNA Engine Opticon 2 Real-Time Cycler (GMI, Inc). La longitud esperada del producto de PCR fue confirmada por la presencia de una única banda en el peso molecular apropiado. secuenciación de Sanger se llevó a cabo en la Unidad de Consejo de Investigación Médica Genética Humana (MRC-HGU), Edimburgo. Los productos fueron secuenciados utilizando el ABI Prism
® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) y los datos fueron analizados utilizando el software Mutación Surveyor
® ADN variante Análisis V3.97.
análisis de microarrays
array hibridación genómica comparada.
la hibridación genómica comparada (CGH) se ha realizado mediante el microarray NimbleGen (Roche). etiquetado de la muestra se realizó con el Dual-Color DNA Labeling Kit NimbleGen (Roche, cat. no. 06 370 250 001). La hibridación se realizó en el MRC-HGU, Edinburgh usando una hibridación Kit NimbleGen (Roche, cat. No. 05 583 683 001), NimbleGen Muestra Seguimiento de Control Kit (Roche, cat. No. 05 223 512 001) y dos CGH humano 12 x 135K de todo el genoma de baldosas arrays V3.0 (Roche, cat. no. 05 520 878 001). NimbleScan software se utilizó para generar los archivos de informe de pares utilizados para el análisis del número de copias de datos. Los datos han sido depositadas en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE72296.
perfiles de expresión génica.
Tres conjuntos de muestras de ARN se prepararon para Illumina
® Genoma perfiles de expresión génica, donde se generaron 48.804 transcripciones por muestra. Los tres conjuntos consistieron en dos series de repeticiones biológica y un conjunto de repeticiones técnica. Todas las muestras de ARN se diluyeron a una concentración de 500 ng /11μl. El Illumina
® TotalPrep
™ kit de amplificación del ARN (Ambion
®, cat. No. AMIL1791) se utilizó para generar biotina, ARN amplificado por hibridación con la iluminación
® humano HT-12 v4. 0 BeadChip. Antes de avanzar con la preparación de las muestras de ARN para el análisis de microarrays, la integridad del ARN fue evaluado con el Agilent
® 2100 Bioanalyzer Agilent utilizando el
® RNA 6000 Nano Kit (Agilent, cat. No. 5067 a 1511) . Las muestras con un número de integridad del ARN (RIN) de 7 o más se consideraron aceptables para la hibridación
.
Las muestras fueron analizadas en el Centro de Investigación Clínica del Wellcome Trust, Edimburgo (Expresión génica Proyecto CRF-E11960), donde estaban diluido a una concentración de 150 ng /l y se hibridaron en tres HT-12 arrays BeadChip v4 expresión humana. Dos repeticiones técnica se hibridaron en cada matriz para servir como un control de calidad interno. Las muestras se hibridó al azar a lo largo de los tres Illumina
® HumanHT-12V4 arrays de expresión BeadChip.
Post-hibridación, los arreglos fueron escaneados utilizando el Illumina HiScan
® Plataforma (Illumina
®, cat. no. SY-103-1001). Los archivos de datos BeadArray fueron exportados de software de exploración de la iluminación e importados en el módulo de la expresión génica del software GenomeStudio (Illumina
®), donde posteriormente los archivos de datos se transformaron a los archivos delimitados por tabuladores. Los datos han sido depositadas en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE72544 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72544).
arrays de proteínas de fase inversa
fase inversa arrays de proteínas (RPPA) son una técnica de rendimiento medio que permite la proyección de las muestras con un gran grupo de proteínas de interés en un tiempo relativamente corto , durante el uso de cantidades mínimas de muestra y tanto los anticuerpos [21]. Las muestras de proteínas desnaturalizadas y reducidas de las 15 muestras de CRC fueron vistos por triplicado en cada almohadilla de un 2-Pad RÁPIDO
® recubierto de nitrocelulosa portaobjetos de vidrio (Whatman Ltd., cat. No. 10485317) utilizando un biorobótica MicroGrid II MG Biobanco (Isogen Life Science). Posteriormente, se probaron con éxito con un panel de 31 optimizada, en la casa validado, total y anticuerpos fosfolípidos como se describe anteriormente (Tabla S2) [20]. Se seleccionaron estos anticuerpos a proteínas diana clave involucrados en la proliferación celular y la supervivencia, la invasión, metástasis, la angiogénesis, el daño del ADN, y la apoptosis se optimizaron y validados por medio de transferencia Western. Las manchas se cuantificaron utilizando RPPA MicroVigene
™ software Módulo de Análisis de RPPA (VigeneTech Inc.). Los datos se analizaron como se ha descrito anteriormente [22].
Las manchas se cuantificaron utilizando RPPA MicroVigene
™ software Módulo de Análisis de RPPA (VigeneTech Inc.).
análisis
Datos
análisis de datos genómicos.
se analizaron los datos de secuenciación de Sanger utilizando mutación Surveyor
® ADN Variant Analysis Software V3.97 (Soft Genética
®, EE.UU.). Los archivos de datos brutos generados por el .ab1 ABI Prism
® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Hitachi) fueron importados en el software y se aplicaron los ajustes predeterminados de análisis. Los archivos de anotación GenBank se descargan automáticamente y los archivos de referencia utilizados para la detección de mutaciones fueron sintetizados de forma automática. Se analizaron
aCGH datos utilizando Partek
® Suite de Genómica
™ versión 6.6 (Partek Inc.). Los datos se normalizaron inicialmente usando loess normalización y la segmentación algoritmo genómico fueron usados para analizar las amplificaciones y deleciones de número de copias. La costumbre parámetros de segmentación fueron los siguientes: los marcadores genómicos mínimo era de 10, el valor de p fue 0,001, y la relación señal-ruido era 0,03. Se informó una región que pierde si la relación de número de copias log2 estaba por debajo de -0.3 y ganado si la relación log 2 número de copias estaba por encima de 0,15. Se crearon tres listas diferentes de región: (1) las regiones que fueron ganados en siete o más líneas celulares; (2) regiones eliminarán en siete o más líneas celulares; (3) los que contienen los más altos amplificaciones, es decir, la relación de log2 igual o mayor a 1,0 (equivalente a un número de copias de 2). Además, la agrupación de segmentación genómico se realizó utilizando la distancia euclídea y media de vinculación. El análisis del número de copias se llevó a cabo en el cromosoma 1 en el cromosoma 22 y excluye los dos cromosomas sexuales.
Transcriptomic análisis de datos.
El archivo de perfil genético de la muestra generada a partir del análisis de la expresión génica fue cuantil normalizado y filtrada para aquellas sondas de detección donde el valor de p ≤ 0,05. Los datos fueron transformados y log2 significan centran en la obtención valores relativos entre las líneas celulares. a continuación, el archivo de perfil de genes muestra fue anotado utilizando HG18 antes de realizar el análisis de expresión diferencial de genes (DGEA)
.
La DGEA se realizó utilizando ArrayMining, un microarray de datos software de minería de paquete en línea [23]. La expresión génica diferencial se llevó a cabo utilizando el análisis de SAM a la lista de genes expresados diferencialmente con respecto a la respuesta al tratamiento. Tres análisis se llevaron a cabo diferentes: (1) 5-FU altamente líneas celulares sensibles
vs
. 5-FU líneas celulares menos sensibles, donde se definieron las líneas celulares altamente sensibles como tener un CI
50 ≤ 30 micras; (2) L-OHP altamente líneas celulares sensibles
vs
. L-OHP líneas celulares menos sensibles, donde se definieron las líneas celulares altamente sensibles como tener un CI
50 ≤ 10μM; (3) líneas de células sensibles BEZ235
vs
. líneas de células insensibles BEZ235, donde se definieron las líneas celulares sensibles como tener un CI
50 & lt; 80nm.
Interpretación de los datos se llevó a cabo mediante la agrupación de anotación funcional de los recursos bioinformáticos DAVID [24].
Integración de las regiones amplificadas con frecuencia con los datos de expresión de genes.
La expresión génica datos para los genes localizados en las regiones obtenidas con frecuencia se separó por filtración. Utilizando los coeficientes de correlación de Pearson con corrección de Bonferroni, se generó una lista de genes que tenía una correlación significativa entre el valor de número de copias log2 y la expresión génica. Los datos de expresión génica de las líneas celulares fueron analizados con respecto a la respuesta al tratamiento mediante la prueba de Mann-Whitney utilizando GraphPad Prism 6.
Proteómica análisis de datos.
Los datos generados a partir RPPA se normalizaron utilizando Cluster 3.0 , una herramienta de agrupación de código abierto [25]. Los datos fueron log-transformados, significan centran en Cluster 3.0, y agrupados por la correlación de centrado y el promedio de vinculación utilizando MeV 4.8 [26]. RPPA resultados para el panel 15 CRC se analizaron con respecto a la respuesta al tratamiento mediante la prueba U de Mann Whitney utilizando GraphPad Prism 6.
Tejido de microarrays (TMA), el análisis cuantitativo automatizado (AQUA), y Fish &
hematoxilina Cinco micras y se desliza eosina se prepararon a partir de los bloques FFPE y áreas tumorales fueron marcados por un patólogo y un técnico capacitado de investigación. Tras el examen histopatológico, 118 casos fueron elegidos fuera de la cohorte original y un microarray tisular (TMA) fue construido por un técnico cualificado. Cuatro réplicas biológicas (TMA000034A-D) se construyeron como se describe en detalle en otra parte [27] y se cortaron en secciones de 5μm utilizando un microtomo y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los parámetros clínicos y patológicos de esta cohorte se resumen en la Tabla S1.
La expresión proteica de TRIB1 se evaluó con anti-TRIB1 anticuerpo policlonal de conejo en la CDN TMA usando análisis automatizado cuantitativa (AQUA), se describe en detalle en otra parte [28 , 29]. expresión TRIB1 tanto en el citoplasmáticas y nucleares compartimentos se correlacionó posteriormente con otras proteínas medidos anteriormente en esta cohorte. TRIB1 expresión también fue investigado con respecto a la supervivencia del paciente, tal como se describe a continuación.
TRIB1
y
MYC
amplificación en la cohorte de pacientes de CRC se investigaron mediante fluorescencia
In situ
hibridación (FISH). Una sonda /CEN8p MYC se adquirió de Abnova (cat. No. FG0065) y la sonda /CEN8p TRIB1 fue diseñado a medida por Abnova. El tiempo de tratamiento con proteasa se varió para optimizar la digestión y asegurar la hibridación de buena calidad. La visualización se realizó con DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol-2-ona (Abnova) para teñir los núcleos.
Listo para el uso de doble etiquetado sondas para
Opiniones y MYC
TRIB1
fueron adquiridos de Abnova. La sonda FISH MYC /CEN8p consistió en un 160kb ~
sonda MYC
situado en 8q24.12-q24.13 con un fluoróforo Texas Red, junto con un ~ 520KB CEN8p sonda situada en 8p11.21 con un fluoróforo FITC. La sonda FISH TRIB1 /CEN8p consistió en un 260kb ~
TRIB1
sonda situada en 8q24.13 con un fluoróforo Texas Red, junto con una sonda CEN8p 520KB situada en ~ 8p11.21 con un fluoróforo FITC.
la puntuación se lleva a cabo por un técnico capacitado y un patólogo consultor. Los portaobjetos se obtuvieron usando un microscopio de fluorescencia Leica DMLB usando lente de inmersión en aceite de 100X. se utilizaron los criterios de puntuación de Colorado [ ,,,0],30] para marcar los TMA diapositivas. un máximo de veinte núcleos por núcleo se anotó en la mayoría de los casos, aunque en algunos casos un mínimo de diez núcleos se obtuvo debido a no tener veinte núcleos puntuables. La suma de los fluoróforos rojos y verdes fue observada para cada núcleo, y la puntuación final consistió en la relación entre el fluoróforo rojo al fluoróforo verde. puntuaciones de pescado menos de 1,8 fueron interpretados como negativos [31].
Estadística
analiza
proteínas TRIB1 datos de expresión generados a partir del análisis AQUA se correlacionaron con AKT, caspasa 3, la ciclina B1, ERK, Ki67, MYC, S6, PTEN, pAKT, Perk, pHistone H3, pMEK, y ps6 expresión de la proteína. El análisis estadístico se realizó mediante correlaciones de Pearson, y los valores de p se ajustaron para múltiples pruebas utilizando la corrección de Bonferroni. Se utilizó un programa de código abierto TMA Navigator (http://www.tmanavigator.org/) para el análisis estadístico. El análisis de supervivencia para
TRIB1
y
MYC
amplificación en la cohorte CRC se realizó utilizando GraphPad Prism 6.
Resultados
análisis mutacional del gen individual es insuficiente para la estratificación de los tumores con respecto a la terapia
Después del tratamiento con 5-fluorouracilo (5-FU) para 96 h, trece líneas celulares de CRC mostraron diversos grados de sensibilidad cuando se tratan con concentraciones de fármaco que van desde 2.5μM a 100μM ( Fig 1A). Dos líneas celulares de CRC (Colo320DM, T84) eran insensibles a 5-FU a una concentración de 100μM. El IC
50 valores para el 5-FU variaron de 3,1 a & gt; 100μM con una mediana de 19.6μM. Las líneas celulares más sensibles eran HT29, LS411N, y HCT116. DLD-1, HCT116, HCT116p53 - /-, SW48, y LoVo se informó a ser deficiente reparación de genes [32]. Este perfil de estado de reparación de genes no se correlacionó con 5-FU sensibilidad (p = 0,713; prueba de Mann-Whitney U). Contrariamente a un estudio realizado por Bracht y colegas [33]
A. diagrama de cascada para los valores de 5-fluorouracilo IC
50 (M). parcela B. Cascada por los valores de CI oxaliplatino
50 (M). parcela C de la cascada por los valores
50 (nM) BEZ235 IC. D. Agrupación jerárquica sin supervisión de los IC
50 valores para el 5-FU, L-OHP y BEZ235 mediante la correlación de Pearson con vinculación completa.
A pesar de una serie de
in vitro
estudios han sugerido que
TP53
deficiencia contribuye a la resistencia a los medicamentos [34], pero no hemos podido ver una asociación (p = 0,238; prueba de Mann-Whitney U). HT29, LS411N, p53 HCT116 - /-, SW837, NCI H508, NCI H716 son todos
TP53
deficiente (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/), pero eran todavía sensibles a 5-FU en este estudio. Mariadason et al., Sin embargo, no informó diferencias en la apoptosis inducida por 5-FU en líneas celulares de p53 de tipo salvaje y mutantes [35]
.
Después del tratamiento con oxaliplatino (L-OHP) durante 96 h, la CRC líneas celulares mostraron diversos grados de sensibilidad cuando se tratan con concentraciones crecientes de L-OHP que van desde 2.5μM a 100μM (Fig 1B). El IC
50 valores para L-OHP variaron de 3,0 a 31.1μM, con una mediana de 8,0 M, lo que demuestra un rango de diez veces de la sensibilidad. Las líneas celulares más sensibles eran HT29, LS411N, y SW837, mientras que los menos sensibles eran Colo320DM, NCI H716, y COLO201. se observó al comparar L-OHP IC valores
50 entre las líneas celulares y líneas celulares dMMR GMANS, que está de acuerdo con un estudio similar de Fink et al; sin significación estadística (prueba U de Mann-Whitney p = 0,462). . [36]
No hubo asociación entre el estado de p53 y L-OHP IC
50 valores (p = 0,187; prueba U de Mann-Whitney), en contraste con un informe anterior [37]. Sin embargo, un estudio reciente llevado a cabo en 51 pacientes con CCR avanzado concluido que
TP53
estado mutacional no se asoció con beneficios de primera línea basada en oxaliplatino tratamiento [38].
Siete líneas celulares de CRC eran sensibles y ocho líneas celulares de CRC fueron insensibles al tratamiento con diversas concentraciones (par de 2,5 Nm y 80 nm) de BEZ235 para 96 h (Fig 1C). El IC
50 valores para BEZ235 variaron de 13,4 a & gt; 80 nm, con las líneas celulares sensibles que tiene una concentración sensible mediana de 23.6nM. Las líneas celulares más sensibles eran HT29, COLO201, y NCI H716, mientras NCI H508, T84, SW48, SW480, Colo320DM, HCT116, p53 HCT116 - /-, y LoVo fueron insensibles a una concentración de 80 nm. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (p = 0,346; la prueba de Mann-Whitney) entre la IC valores
50 para el tratamiento y BEZ235
PIK3CA
grupos mutante y de tipo salvaje. Todos los
PI3KCA
líneas celulares mutantes tenían ya sea un
BRAF
o un
KRAS
co-mutación. No hay datos de COSMIC estaba disponible para
mTOR
mutaciones en estas líneas celulares (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). Serra et al. estableció que BEZ235 proliferación en todas las líneas celulares del cáncer de 21 empleados en su estudio, detenido independiente del estado de la mutación de PI3K vía [39], y que las líneas celulares con un
BRAF
o
KRAS
mutación o
EGFR
amplificación fueron ligeramente menos sensible a BEZ235 en comparación con las otras líneas celulares [39].
de las líneas celulares de CRC 15, ocho líneas de células poseían
KRAS
exón 2 mutaciones . El DLD-1, HCT116, p53 HCT116 - /-, y las líneas celulares LoVo tenían un 5574 G & gt; A sustitución consistente con una mutación G13D missense; Las líneas de células SW480 SK-CO-1 y tenían un 5571 G & gt; T sustitución consistente con una mutación de sentido erróneo G12V; SW837 tenía un 5570 G & gt; T sustitución consistente con una mutación G12C; y T84 tenía una 5574 G & gt; A sustitución consistente con una mutación G13D. Esto está de acuerdo con los datos de secuenciación publicados y los datos en la base de datos cósmicos (http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/). No hubo diferencias estadísticamente significativas en la respuesta a 5-FU, L-OHP y BEZ235 con respecto a
KRAS
estado mutacional (p = 0,98, p = 0,60, p = 0,17 y, respectivamente).
agrupación jerárquica sin supervisión para el IC
50 valores para el 5-FU, L-OHP y BEZ235 utilizando correlaciones de Pearson con vinculación completa mostró que las líneas celulares no se agrupan de acuerdo con cualquier mutación particular. Hubo variabilidad en la respuesta a los tres tratamientos diferentes (Figura 1D).
regiones cromosómicas con frecuencia ganado y perdido en el cáncer colorrectal líneas celulares
El panel de líneas celulares fueron evaluados por aCGH próxima a identificar regiones cromosómicas comunes de la ganancia y la pérdida. Veinticuatro regiones se obtuvieron con frecuencia en al menos 7/15 líneas celulares de CRC. Se observaron aumentos frecuentes en 2p, 3q, 5p, 7p, 7q, 8q, 12p, 13q, 14q, 17q y (Figura 2) (Tabla 1). Por otra parte, un total de 14 regiones se perdieron en al menos 7/15 líneas celulares de CRC (Tabla 2). No se observaron pérdidas frecuentes en 2q, 3p, 5q, 8p, 9p, 14q, 18q y 20p (figura 2). Estas regiones de ganancia y la pérdida fueron similares a los reportados previamente [32, 40-44].
La agrupación jerárquica de los datos de número de copia segmentados utilizando el promedio de vinculación distancia euclídea dio lugar a dos grupos principales: un racimo contenida NCI H716 mientras que el otro grupo contenía los otros 14 líneas celulares (figura 3). Uno de los sub-grupos contenían HT29, SW48, LS411N, LoVo, HCT116 y HCT116p53 - /-. HCT116, HCT116p53 - /-, SW48, y LoVo-son diploides y cerca sabe que tienen mutaciones en los genes MMR
MLH1
y
MSH2
[45, 46]. La otra línea celular casi diploide, DLD-1, también se agrupan por separado. Esta línea celular es deficiente en MMR MSH6 [47].
Expresión
génica diferencial con respecto a la sensibilidad a los fármacos
Los genes expresados diferencialmente con respecto a 5-FU sensibilidad se enumeran en la Tabla S3 y se representa en un mapa de calor en la figura 4A. anotación funcional utilizando DAVID [24] reveló que estos genes eran principalmente implicados en el ciclo celular (
TAF2
,
CHFR
,
CCND2
,
OSGIN2
,
TERF1
,
TBRG4
), adhesión focal (
ABCB1
,
SH3KBP1
,
EBAG9
), la apoptosis (
SHRKBP1
,
EBAG9
,
TERF1
,
TBRG4
), y la regulación de la transcripción (
LASS2
,
LMCD1
,
Maf1
,
TAF2
,
THAP11
,
CHURC1
,
med14
,
PIAS3
,
purB
,
TERF1
,
ZNF239
,
ZNF7
). KEGG vías importantes asociados con el modo 5-FU de acción y posteriormente enriquecidas en la lista procedente de este estudio incluyen el metabolismo de las purinas (
NT5C2
,
POLR2J2
), el metabolismo de la pirimidina (
NT5C2
,
POLR2J2
), el metabolismo de fármacos (
GSTO2
), los transportadores ABC (
ABCB1
), y la fosforilación oxidativa (
NDUFA9
).
A. Un mapa de calor que representa el SAM análisis de los genes expresados diferencialmente entre 5-FU CRC líneas celulares sensibles y menos sensibles; B. Un mapa de calor que representa el SAM análisis de los genes expresados diferencialmente entre las líneas celulares de CRC sensibles y menos sensibles L-OHP; C. Un mapa de calor que representa el SAM análisis de los genes expresados diferencialmente entre las líneas celulares de CRC sensibles y menos sensibles BEZ235.
Los genes expresados diferencialmente con respecto a la sensibilidad L-OHP estaban involucrados con la unión de ADN (
GLI2
,
GLI4
,
SETDB2
,
NFXL1
,
POLE4
,
PURA
,
TSNAX <