Extracto
modulación de la autofagia es ahora reconocido como un enfoque terapéutico potencial para el cáncer (incluyendo cáncer colorrectal), sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la autofagia en respuesta al estrés celular están todavía no se entiende bien. Los microARN (miARN) se han encontrado para desempeñar un papel importante en el control de muchas funciones celulares, incluyendo el crecimiento, el metabolismo y la respuesta al estrés. La importancia fisiológica de la interconexión miARN-autofagia sólo se está empezando a ser dilucidado. la tecnología de microarrays Mirna facilita el análisis de la expresión de los genes miARN global en ciertas situaciones. En este estudio, se analizó el perfil de expresión de miRNAs durante la respuesta de las células de cáncer de colon humano (HT29s) para el tratamiento y nutrientes 5-FU hambre mediante el análisis de microarrays miARN. La alteración de la expresión de los genes miARN mostraron el mismo patrón en ambas condiciones se declaró además de QRT-PCR en tres líneas celulares de cáncer de colon humano. Además, se llevaron a cabo la predicción bioinformático de los genes diana, la vía de análisis y análisis de redes de genes para entender mejor las funciones de estos miRNAs en la regulación de la autofagia. Se identificaron y seleccionaron cuatro miRNAs downregulated incluyendo hsa-miR-302a-3p y 27 miRNAs upregulated bajo estas dos condiciones que tiene el potencial para apuntar genes implicados en la regulación de la autofagia en las células de cáncer de colon humano. Tienen el potencial para modular la autofagia en la quimioterapia basada en 5-FU en cáncer colorrectal
Visto:. Hou N, Han J, Li J, Liu Y, Qin Y, Ni L, et al. (2014) Perfiles de microARN en células de cáncer de colon humano durante 5-fluorouracilo inducida por autofagia. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10.1371 /journal.pone.0114779
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de julio de 2014; Aceptado: 13 Noviembre 2014; Publicado: 19 de diciembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Hou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 31.100.969) y la Fundación de Investigación Científica para la devolución de ultramar Los eruditos chinos, Ministerio de Educación del Estado (2013-09) con el Dr. Hou. También fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 81.172.358) con el Dr. Li. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que ningún interés en competencia existe
Introducción
5-fluorouracilo (5-FU) quimioterapia adyuvante con base ha sido ampliamente utilizado como la corriente principal para el tratamiento de cáncer colorrectal (CRC). Sin embargo, debido a la resistencia al 5-FU en muchos pacientes, se están explorando nuevas estrategias terapéuticas [1]. La autofagia es un proceso eucariota evolutivamente conservada que mantiene la homeostasis intracelular mediante la eliminación de proteínas y orgánulos innecesarios dañadas o envejecidas [2]. En las últimas décadas, la acumulación de evidencia ha demostrado que la autofagia es ampliamente asociado con el cáncer [3]. Mediante el mantenimiento de la homeostasis celular en las células sanas, la autofagia impide la transformación tumoral. La autofagia también es importante para la progresión del tumor, permitiendo que las células tumorales sobrevivan estrés o anoikis metabólico, el mantenimiento de su adaptación al metabolismo reprogramado, apoyando el desarrollo de tumores mediante la inducción de la latencia y el mantenimiento de la supervivencia y la auto-renovación de las células madre de cáncer. Además, debido a la autofagia desempeña papeles esenciales en la determinación de cómo las células tumorales responden a la terapia, la modulación de la autofagia es reconocido como un enfoque terapéutico potencial en el cáncer [4], [5]. La autofagia parece representar un mecanismo válido de la resistencia contra la radio y quimioterapia. Nuestros estudios anteriores mostraron que la inhibición de la autofagia por 3-metiladenina (3-MA) o pequeños ARN de interferencia de orientación ATG7 (ATG7 siRNA) aumenta la eficacia de 5-FU mediante la mejora de la apoptosis en el cáncer de colon humano [6], [7]. La autofagia es altamente conservada y bien regulado. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la autofagia en respuesta al estrés celular todavía no se conocen bien.
Los microARN (miARN), 18-25 nucleótidos de longitud, son endógenos pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión de sus genes diana mediante la inhibición de la traducción o la escisión del ARN mensajero (ARNm), principalmente a través de la interacción en las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de los mRNAs diana [8]. MiRNAs puede regular simultáneamente una multiplicidad de objetivos y redes biológicas. Por el contrario, varios miRNAs diferentes pueden unirse y controlar cooperativamente un único ARNm objetivo. MiRNAs se han encontrado para desempeñar papeles importantes en el control de muchas funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la diferenciación, el metabolismo y la respuesta al estrés y proporcionado una clara ventaja desde un punto de vista clínico [9] - [11]. En los últimos años, algunos miRNAs se han estudiado como mediadores de la regulación de la autofagia. Los genes miARN-30a puede sensibilizar a las células de hepatoma con el cisplatino por la orientación autofagia mediada por beclin-1 [12]. Los genes miARN-101 ha demostrado ser como un potente inhibidor de la autofagia inducida por etopósido o rapamicina en células de cáncer de mama [13]. Jegga et al. También se propone que los genes miARN-130, miARN-98, miRNA-124, miRNA-204 y miRNA-142 tiene funciones reguladoras potenciales en el proceso de autofagia en base al análisis computacional [14]. La importancia fisiológica de la interconexión miARN-autofagia sólo se está empezando a ser dilucidado.
Debido al gran número de miRNAs, la tecnología de microarrays miARN se ha aplicado ampliamente para determinar la expresión de los genes miARN global en determinadas situaciones [15]. En este estudio, se analizó el perfil de expresión de miRNAs en la respuesta de las células humanas de cáncer de colon (HT29s) a 5-FU tratamiento utilizando el análisis de microarrays miARN. Dar prioridad a los miRNAs que se correlacionaron con la autofagia, la autofagia también fue inducida por un segundo medio (el hambre de nutrientes), y la expresión de los genes miARN se observó también en ese contexto. La expresión de los genes miARN alterado mostró un mismo patrón en ambas condiciones se declaró además de QRT-PCR en tres líneas celulares de cáncer de colon humano. Además, la predicción bioinformática de genes diana, la vía de análisis y análisis de redes de genes ontología también se llevaron a cabo para entender mejor las funciones de estos miRNAs en la regulación de la autofagia. Se identificaron y seleccionaron cuatro miRNAs downregulated miRNAs upregulated y 27 por tratamiento con 5-FU y el hambre en las células de cáncer de colon humano. Estos 31 miRNAs tienen los genes objetivo previsto de la regulación de la autofagia, incluidos los genes centrales y los reguladores de la autofagia autofagia y tienen el potencial para modular la autofagia en la quimioterapia con 5-FU basado en el CCR.
Materiales y Métodos
Materiales
5-FU fue comprado a Sigma (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). anticuerpo policlonal de LC3 se adquirió de MBL (MBL, Nagoya, Japón). Los anticuerpos anti-p62 y anti-β-actina se obtuvieron de Sigma, y el anticuerpo mTOR fue de Señalización Celular Tecnología (tecnología de señalización celular, Danvers, MA).
Cultivo celular y tratamiento
HT29, HCT116 y DLD1 células de carcinoma colorrectal humano se adquirieron de la American Type Culture Collection, proporcionado amablemente por el Prof. Kuwano y se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2/95% de aire con el medio cambia cada dos días. Las células en fase semilogarítmica se utilizaron en este estudio. Para el tratamiento 5-FU, HT29s se trataron con 5 mM de 5-FU durante 24 h. Para el hambre de nutrientes, HT29s se incubaron en tampón de Krebs-Ringer [16] (120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, mM NaHCO 24
3, glucosa 5,6 mM, CaCl 2 mM
2, pH 7,6) a 37 ° C durante 7 h.
se determinó Medición de la viabilidad celular y la apoptosis
La viabilidad celular utilizando Cell Counting Kit 8 (CCK-8). Las células se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10
3 células por pocillo. Después del tratamiento, se añadieron 10 l de la solución de CCK-8 a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 1 h. La absorbancia de la solución se leyó espectrofotométricamente a 450 nm con una referencia a 650 nm utilizando un lector de placas de microtitulación (BIO-TEK ELx800). La viabilidad celular se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = A450 (muestra) /A450 (control) x 100
apoptosis celular se ensayó usando el kit de detección de apoptosis.. En resumen, se recogieron las células y se tiñeron con FITC anexina V (Anexina V) y yoduro de propidio (PI). La apoptosis se define por Anexina V
+ /PI
-. (A principios de la apoptosis) y Anexina V
+ /PI
+ (finales de la apoptosis) según lo determinado por FACScan (Becton Dickinson)
Análisis de la autofagia
Análisis de la autofagia se llevó a cabo principalmente por inmunofluorescencia e inmunotransferencia para la cadena de proteína-1B luz asociada a los microtúbulos 3 (LC3) como se describe anteriormente [7], [16]. Para determinar la inmunofluorescencia de LC3, las células en el portaobjetos de cámara se fijaron con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,05% de Triton X-100. Después del bloqueo, las células se incubaron con un anticuerpo anti-LC3 (1:500 dilución) a 4 ° C durante la noche y, se incubaron con anticuerpo anti-conejo conjugado con 488 Alexa Fluor después del lavado. Los portaobjetos se montaron y se examinaron con un microscopio de fluorescencia (ECLIPSE TE2000-U, Nikon). La tinción con 0,1 mg /ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se realizó para identificar núcleo. Para la inmunotransferencia de LC3, 20 g de lisado de células se separó en un 5-20% Tris-Tricina Ready Gel SDS-PAGE (Bio-Rad) para la transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana. La membrana fue bloqueada sometida a transferencia y se incubó con anti-LC3 (1:1000 dilución). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia avanzada usando el anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:5000). p62 y la inmunotransferencia de mTOR (1:1000 diluciones ambos) también se llevaron a cabo para evaluar el estado de la autofagia.
El aislamiento de ARN y miARN microarrays
El ARN celular total se cosechó utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA ) y una mini kit miRNeasy (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Exiqon LNA MicroARN matriz humana que incluye todos los miRNAs humanos maduros (base de datos 18.0) se utilizó para el perfil de expresión de miRNA y realizada por Kangcheng Bio-Tech Inc. (Shanghai, China). Hicimos la presentación de los datos de microarrays de expresión de genes de Omnibus, y el número de acceso es GSE61943. En resumen, las muestras de ARN (1 g) se marcaron usando un kit de marcaje miRCURY HY3 y se hibridan en la matriz de miRCURY LNA (v.18.0). Después del lavado, las diapositivas fueron escaneados utilizando un escáner GenePix 4000B microarrays Axon, y la cruda intensidad de la imagen fue leídos y analizados utilizando el software GenePix Pro 6.0 (Axon). Se promediaron cuatro puntos replicados de cada sonda en la misma diapositiva. miARN datos expresados se normalizaron usando la mediana de la normalización. Después de la normalización, miRNAs expresados diferencialmente se identificaron a través del cambio de filtrado Fold (& gt; = 2)
Análisis en tiempo real QRT-PCR para la expresión de los genes miARN
reacción de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en cadena (QRT. PCR) se realizó para validar los datos de la matriz miARN. miRNAs maduros se transcribieron de forma inversa en ADNc por tallo-bucle de transcripción inversa utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara Bio, Shiga, Japón) y cebadores específicos de tallo-bucle, como se muestra en la Tabla 1. QRT-PCR para cada miRNAs se realizó utilizando FastStart esencial ADN verde Master (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) en una máquina de lightcycle96 (Roche) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1. Cada muestra se analizó por triplicado. Los niveles de expresión de genes miARN se normalizaron a y cuantificados por U6 ARN. la cuantificación relativa se calculó utilizando la 2
(- ΔΔCt). Método
Objetivo predicción y la función de análisis
Los genes diana de los miRNAs se predijo a partir de la intersección de dos grandes línea miARN algoritmos de predicción de destino, TargetScan (http://www.targetscan.org) [17] y PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de) [18], o TargetScan y miRDB (http: //mirdb .org) [19] si no hay datos de algunos miRNAs en PicTar.
se aplicó DIANA-miRPath v2.0 (http://www.microrna.gr/miRPathv2) para analizar las funciones principales de miRNAs [20]. En general, los genes miARN y la información relacionada con la vía-se obtuvo de miRBase y la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas v58.1 (KEGG), respectivamente. Se utilizó una prueba exacta de Fisher de una cola para identificar las vías KEGG enriquecido con los objetivos de miRNAs específicos, y la tasa de falso descubrimiento (FDR) se calculó para corregir el valor de p. Enriquecimiento proporciona una medida de la importancia de la función; a medida que aumenta el enriquecimiento, la función correspondiente es más significativa.
ontología de genes (GO) de análisis de red también se utilizó para analizar la función principal de los genes objetivo previsto y descubrir la red de regulación de los genes miARN-gen sobre la base de procesos biológicos y moleculares funciones. El plug-in CyTargetLinker en Cytoscape (http://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) se utilizó para construir una red integradora de las interacciones de los genes miARN objetivo para las seis miRNAs identificados en nuestro estudio [21], [22]. Los objetivos validados para cada miARN se obtuvieron de mirTarBase, y los objetivos previsto se obtuvieron de TargetScan.
El análisis estadístico
se expresaron todos los datos como media ± desviación estándar (SD). Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 17.0. p. & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
5-FU disminuyó la viabilidad de las células de cáncer de colon humano HT29, España
El efecto principal de la quimioterapia CRC, 5-FU, en células de cáncer de colon humano HT29 se confirmó mediante un ensayo de CCK-8. 5-FU (0~500 mu M) produjo una inhibición de la dosis y dependiente del tiempo de la viabilidad celular que alcanzó 64,20% y 42,20% después de 5 tratamiento mu M 5-FU para 24 h y 48 h, respectivamente (Fig. 1). 5-FU podría tener muchos efectos sobre las células HT29. La citometría de flujo de Anexina V y tinción PI se utilizó para detectar la apoptosis en nuestro experimento. No tienen poca apoptosis en las células HT29 por 5 tratamiento mu M 5-FU durante 24 h (S1 Fig.).
Células
HT29 fueron incubadas con diferentes concentraciones (5 mM y 25 mM) de 5-FU para 12, 24, y 48 h. La viabilidad celular se midió por CCK-8 ensayo. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar.
5-FU inducida por la activación de la autofagia en las células HT29
La activación de la autofagia por 5-FU en células HT29 se detectó mediante inmunofluorescencia LC3 . En las células de control, la distribución de LC3 mostró un patrón difuso (citoplasma, LC3- I). tratamiento con 5-FU altera la distribución LC3 a muchos puntos gruesos y tinción punteada (Fig. 2A), y como el aumento del tiempo, los puntos se hizo más intensa. Los puntúa LC3-positivo (LC3-II) representan autofagosomas. inmunotransferencia LC3 también se utilizó para observar la autofagia (Fig. 2C). LC3-II (16 kDa) fue inducida por 5 tratamiento mu M 5-FU durante 24 h. Como mecanismo de característica de inducir la inducción de la autofagia, el hambre de nutrientes también se realizó (Fig. 2B). El hambre hizo la tinción LC3 más intenso, y en 7 h, había algunas manchas puntúan. Además, la intensidad de LC3 se aumentó por inanición durante 7 h. A medida que el indicador de flujo de la autofagia, p62 se redujo tanto por el tratamiento con 5-FU y el hambre (Fig. 2C). Después de 5 tratamiento mu M 5-FU durante 24 h, se inhibió la viabilidad celular de las células HT29, la autofagia se activó, y casi no había apoptosis. A continuación, se realizó el perfil de expresión global mediante ensayos de microarrays miARN en ambos HT29 células de hambre durante 7 h las células HT29 y tratados con 5 mM 5-FU durante 24 h.
HT29 células fueron tratadas con 5 M de 5-FU o no. La activación de la autofagia se observó por LC3 inmunofluorescencia (A). células HT29 se mueren de inanición en tampón Krebs-Ringer o no. La activación de la autofagia se observó por LC3 inmunofluorescencia (B). DAPI tinción se realizó para identificar núcleo. LC3, p62 y la inmunotransferencia mTOR se realizó utilizando los lisados de las células HT29 tratadas con 5 M de 5-FU durante 24 h o no, y en ayunas durante 7 h o no (C). Los datos son los representativos de tres experimentos independientes. Bar, 20 micras.
La identificación de los genes miARN expresión alterada por 5-FU y el hambre en las células HT29
Después de la exploración y la normalización de microarrays, 124 de cada 1.900 miRNAs humanos maduros fueron identificados como upregulated por inanición durante 7 h en células HT29, y 56 miRNAs se downregulated. Con 5 tratamiento mu M 5-FU durante 24 h, había 302 miRNAs upregulated y 86 miRNAs downregulated en las células HT29. Dar prioridad a los miRNAs correlacionados con los cambios en la autofagia, los miRNAs que muestran el mismo patrón alterado bajo tratamiento con 5-FU y el hambre (un segundo medio estándar de inducción de la autofagia) fueron considerados más probabilidades de estar involucrados en la regulación de la autofagia. El miRNAs que muestran el mismo patrón alterado bajo estas dos condiciones eran 94 miRNAs upregulated y 22 downregulated miRNAs (S1 Tabla). La predicción de los objetivos de genes miARN-regulada es un paso necesario para entender las funciones de un determinado miARN. Se informó de la intersección de dos programas diferentes (algoritmos) el aumento de la sensibilidad de la predicción. TargetScan identifica objetivos con complementariedad conservada a la semilla (nucleótidos 2-7) de los genes miARN [23]. Se utilizó la intersección de TargetScan y PicTar para predecir los genes diana de los miRNAs alterados. Si no había datos en PicTar, miRDB se utiliza en lugar de PicTar. En general, se identificaron y seleccionaron cuatro miRNAs downregulated, hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-548ah-5p, hsa-miR-133b y hsa-miR-323a-3p, y 27 miRNAs upregulated, hsa-miR-203a , hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-miR-320d, hsa-miR-301a-3p, vmiR-30e-5p, hsa-miR-374C -5p, hsa-miR-181-5p, hsa-let-7 g-5p, hsa-miR-513b-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-19a-3p , hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-30a-5p, HSA -miR-23a-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p y HSA-mir -320c, como tener los genes objetivo previsto implicadas en la regulación de la autofagia, que incluyen genes autofagia centrales y los reguladores de la autofagia (Tabla 2).
Validación de datos de microarrays utilizando QRT-PCR en HT29, HCT11 , y las células DLD1
Para validar los datos de microarrays, hemos realizado QRT-PCR en dos downregulated (HSA-miR-302a-3p y tiene-miR-548ah-5p) y cuatro miRNAs upregulated (HSA-miR 30a-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-195-5p y hsa-let-7c-5p) en el 5-FU tratadas o células HT29 de hambre. Dado que el cáncer de colon es heterogénea, la expresión alterada de estos miRNAs se determinó también en otras líneas celulares de cáncer derivadas de dos de colon humano, HCT116 y DLD1. Se encontró que de acuerdo con los resultados de análisis de microarrays miARN la expresión de estos miRNAs cambiado significativamente en función de sus lecturas QRT-PCR (Fig. 3).
Existen tres tipos de líneas celulares de cáncer de colon humano, HT29 (A ), DLD1 (B) y HCT116 (C), se trató como se describe en la Fig. 2. QRT-PCR se realizó para validar la alteración de la expresión de HSA-miR-302a-3p, hsa-miR-548ah-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-23-3p, HSA-mir -195a-5p y hsa-let-7c-5p bajo tratamiento con 5-FU (5-FU) y la inanición. Los datos se muestran como la media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados reproducibles.
Pathway análisis IR y análisis de redes reveló la autofagia-miRNAs interconexión
Para obtener una perspectiva de las funciones de estos miRNAs, DIANA-miRPath era utilizado para analizar KEGG vías influenciados por estos 31 miRNAs (Fig. 4). Como resultado, las altas vías de enriquecimiento significativos de las cuatro miRNAs downregulated incluyen la vía de señalización de MAPK, que se informó a participar positivamente en la regulación de la autofagia [24] (Fig. 4A). Más interesante, entre las altas vías enriquecimiento significativo de los 27 miRNAs upregulated, la vía de señalización mTOR se identificó de manera significativa por estos miRNAs (Fig. 4B, 4C y 4D). En consonancia, el nivel de proteína de mTOR se redujo en estas dos condiciones (Fig. 2C). Además, el análisis de redes de genes miARN-mRNA integra estos miRNAs y OG por descripción de las interacciones de los genes miARN y GO-relacionados que utilizan el software Cytoscape (Fig. 5).
DIANA-miRPath v2.0 se aplicó para analizar la principales funciones de los 31 seleccionados miRNAs (a, los cuatro miRNAs downregulated; B, miRNAs upregulated más de cuatro veces en tratamiento y la inanición 5-FU; C, miRNAs upregulated entre dos y cuatro veces en dos condiciones; D, miRNAs upregulated más de cuatro veces y entre dos y cuatro veces). El eje vertical es la categoría KEGG vía, y el eje horizontal es el logaritmo negativo de la
p
valor (-Log
p
), que representa la importancia de las vías.
Las redes integradoras fueron creados utilizando el software Cytoscape. Cada red incluye dos tipos de nodos, miRNAs individuales (círculos rojos) y sus mRNA objetivos previstos (hexagonales de color rosa), obtenidos a partir de dos diferentes bases de datos públicas (miRTarBase y TargetScan). El gráfico muestra que los objetivos de mRNA aparecen en dos bases de datos, que se identifican por el color de las flechas que conectan, miRTarBase (rojo) y TargetScan (negro).
Discusión
5 quimioterapia basada en -FU es la corriente principal del tratamiento adyuvante del CRC. modulación autofagia se ha considerado como una estrategia potencial para poner en práctica la quimioterapia en la terapia de tumores [4]. MiRNAs juegan un papel importante en el control de funciones celulares y se ha informado de estar involucrados en la regulación de la autofagia en los últimos años [25]. En nuestro experimento, la inducción de la autofagia se confirmó en células HT29 por tanto el tratamiento 5-FU y el hambre de nutrientes. Utilizando el análisis de miARN microarrays, QRT-PCR, y la bioinformática, se identificaron y seleccionaron cuatro miRNAs downregulated incluyendo hsa-miR-302a-3p y 27 miRNAs upregulated incluyendo hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-23a-3p, HSA miR-195a-5p, hsa-miR-99b-5p y hsa-let-7c-5p bajo estas dos condiciones como tener el potencial para apuntar genes implicados en la regulación de la autofagia (Tabla 2). más análisis funcionales de estos miRNAs necesita ser realizado.
La evidencia acumulada sugiere que la autofagia juega un papel importante en la terapia de tumores y la tumorigénesis [3]. Se puede inhibir o promover la tumorigénesis dependiendo de la etapa del tumor. En cuanto a la terapia de tumores, la autofagia parece mediar el efecto de los agentes contra el cáncer como la inhibición de la autofagia suprime su eficacia terapéutica. La autofagia puede activarse también como una respuesta a favor de la supervivencia para promover la resistencia terapéutica a la terapia citotóxica. Y la inhibición de la autofagia mejora la muerte celular de drogas o inducida por la radiación como hemos informado [6], [7]. Moléculas implicadas en la regulación del proceso de autofagia han surgido como objetivos prometedores para terapias contra el cáncer innovadoras [4].
La autofagia (principalmente macroautofagia) es un proceso catabólico estrictamente regulados, conservada. Después de la inducción, las partes del citoplasma son secuestradas en característicos vesículas de doble membrana conocida como autofagosomas (nucleación vesícula, vesícula de elongación y recuperación). Posteriormente, autofagosomas se fusionan con los endosomas tardíos o lisosomas, que forman el autolysosome (fusión). La exposición del compartimiento interior para hidrolasas lisosomales causa la degradación de la carga citoplásmica, y los productos de degradación resultantes se libera en el citosol para su reciclaje. El control estricto de la autofagia es esencial para la homeostasis celular y la respuesta al estrés celular. Una gran familia de reguladores centrales autofagia, la autofagia (ATG) relacionadas con los genes, sirve para regular de manera coordinada la progresión gradual de la autofagia de la inducción de la autofagia para la nucleación de la vesícula, el alargamiento de la vesícula, la recuperación y la fusión [26]. Además, una red de vías de señalización aguas arriba diverso y complejo contribuye a la regulación de la autofagia incluyendo la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), las vías de la proteína activada por AMP quinasa (AMPK) RAS-proto-oncogén y, muchos de los cuales convergen en el objetivo de mamíferos complejo de rapamicina 1 (mTORC1), un regulador clave negativa de la autofagia de señalización [27].
En nuestro experimento, se encontraron 27 miRNAs que potencialmente se dirigen a los genes que regulan la autofagia que se upregulated después del tratamiento con 5-FU o el hambre. Pathway análisis sugiere que la vía de señalización mTOR se identificó de manera significativa por estos miRNAs. Se demostró anteriormente en células de cáncer de mama que nutriente resultados de hambre en un aumento de la autofagia través de la inhibición de mTOR [28]. Nuestros resultados también apoyan firmemente este efecto durante la autofagia inducida por 5-FU en las células de cáncer de colon. Entre estos miRNAs, los genes objetivo previsto de hsa-miR-99b-5p incluyen mTOR. Y el aumento de este miARN en dos tipos de inducción autofagia (tratamiento 5-FU y la inanición) fue significativa, 5.624 y 6.243 veces mayor que el control. Hsa-miR-99b-5p requiere investigación adicional en la regulación de la autofagia en tratamiento con 5-FU en cáncer de colon humano. Además de la red de mTOR, también se informó de la red beclin1 para regular la autofagia en el cáncer de mama [29]. El Bcl2 bloques familia inanición inducida por la autofagia mediante la interacción con el dominio BH3 de Beclin1 y son reguladores negativos de la autofagia. En nuestro experimento, hsa-let-7c-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-98-5p, y hsa-miR-181 -5p se predice que los genes objetivo en la familia Bcl2 y también justifican una investigación adicional. Aunque estos 27 miRNAs mostraron una expresión regulada positivamente en estas dos métodos de inducciones autofagia, se predice que los genes objetivo de núcleo autofagia; hsa-miR-30a-5p focalización de BECN1 y ATG5 se ha demostrado en los informes anteriores [30]. La función de estos miRNAs necesita de mayor investigación. Además, sólo había cuatro miRNAs Downregulated con objetivos previsto implicados en la regulación de la autofagia, menos de la cantidad de miRNAs upregulated. También demostró la importancia de la vía de señalización mTOR en la regulación de la autofagia. Por otra parte, predijeron genes diana incluyen genes centrales autofagia; hsa-miR-302a-3p objetivos ULK1 y hsa-miR-548ah-5p dirige ATG16L1, lo que sugiere que estos cuatro miRNAs participar en el proceso de autofagia en 5-FU tratamiento y tienen el potencial de ser utilizado para manipular la autofagia en 5-FU basado la quimioterapia en el CCR
.
el papel de la autofagia en el cáncer dependen del tipo de cáncer, el contexto y la ubicación [4]. En este estudio, nos centramos en la autofagia inducida por 5-FU en cáncer de colon humano sobre la base de nuestro y otros informes anteriores. Tenía 4 miRNAs regulan a la baja, incluyendo hsa-miR-302a-3p y hsa-miR-548ah-5p; y 27 miRNAs hasta reguladas incluyendo hsa-let-7c-5p y hsa-miR-30a-5p tras el tratamiento con 5-FU y el hambre en las células de cáncer de colon humano. Estos 31 miRNAs tienen los genes objetivo previsto de la regulación de la autofagia, incluidos los genes centrales y los reguladores de la autofagia y la autofagia son prometedores objetivos para la modulación de la autofagia en la quimioterapia basada en 5-FU en el CCR. Estos datos también podrían arrojar luz sobre miRNA-autofagia interacciones en otros tipos de cáncer, así como proporcionar un mecanismo para regular la autofagia potencialmente en la práctica clínica.
Apoyo a la Información
S1 Fig. página 5-FU induce la apoptosis en células poco HT29. células HT29 se incubaron con 5-FU durante 24 h. La citometría de flujo utilizando anexina V y PI se realizó para detectar la apoptosis en nuestro experimento. Hubo poca apoptosis de las células HT29 después del tratamiento con 5-FU durante 24 h
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
expresión diferencial de los genes miARN en la inanición (Starv) frente al control (Ctrl) y 5-FU frente al control (DMSO) en HT29
doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
agradecemos al Prof. Kuwano H y el Prof. Torii S (Facultad de medicina, Universidad de Gunma, Maebashi, Japón) por su amable ayuda. También se agradece a Aiying Wang y Lin Yu por su apoyo técnico.