Extracto
Objetivo
Nuestro estudio anterior sugiere las posibles implicaciones clínicas de BCAR1 en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) (Mol Diagn Ther 2011. 15 (1).: 31-40). En esto, nuestro objetivo es evaluar el poder predictivo de BCAR1 como un marcador de mal pronóstico en los casos de NSCLC, verificar los papeles cancerígenos de BCAR1 en la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549, y testificar al eje BCAR1 /fosfo-p38.
Métodos
Entre enero de 2006 y junio de 2010, hubo un total de 182 pacientes con NSCLC (151 casos con datos de seguimiento disponibles, y 31 casos perdidos durante el seguimiento debido a la información de contacto no válido). Se inspeccionaron BCAR1, fosfo-BCAR1 (Tyr410), fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) y la expresión de p38 en los tejidos de NSCLC y los tejidos adyacentes normales emparejados por inmunotransferencia y IHC. Después BCAR1 ARN-interferencia en las células A549, inspeccionamos la expresión de la proteína (BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 y p38) y realizado experimentos de biología celular (crecimiento celular, la migración y el ciclo).
Resultados
BCAR1 se sobreexpresa en los tejidos de NSCLC (177/182) y líneas celulares (A549 y Calu-3). Sin embargo, no se detectó en el tejido normal adyacente en 161 de los 182 casos. los niveles más altos BCAR1 se asociaron fuertemente con CPNM más pobremente diferenciado y predijo un peor pronóstico. BCAR1 caída causó la detención del crecimiento celular, la inhibición de la migración celular y la detención del ciclo celular de las células A549. La sobreexpresión de BCAR1 se asoció con la activación de p38 en casos de NSCLC, y BCAR1 caída provocó una reducción de los niveles de fosfo-p38 en las células A549.
Conclusión
La sobreexpresión de BCAR1 es un predictor de mal pronóstico en CPNM y desempeña un importante papel en la carcinogénesis cancerígenos, probablemente a través de la activación de p38 MAPK. Sin embargo, son necesarias nuevas investigaciones inmediatamente
Visto:. Huang W, Deng B, Wang R-W, Q Tan-Y, Y Él, Jiang Y-G, et al. (2012) Protein BCAR1 juega un papel importante en la carcinogénesis y predice un mal pronóstico en no pequeñas de pulmón de células. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10.1371 /journal.pone.0036124
Editor: Keiran Smalley, El Moffitt Cancer Center & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2011; Aceptado: March 26, 2012; Publicado: 27 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF) (Nº 81101782), proyecto SNCF CQ CSTC (núm CSTC2011BB5020), y la Tercera Universidad médica Militar SNCF (núm 2010XQN36). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cada año, hay 1,35 millones de nuevos casos de cáncer de pulmón en el mundo [1]. A nivel mundial, el cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer [2]. Debido a las funciones biológicas intrincados, el pronóstico de cáncer de pulmón sigue siendo muy pobre [1]. Por lo tanto, es vital para dar a conocer las funciones biológicas de la enfermedad en aras de mejorar la eficacia terapéutica [3].
El cáncer de mama antiestrógeno resistencia 1 (BCAR1), p130Cas también con derecho, fue uno de los CAS miembros de proteínas (sustrato asociado-Crk) de la familia. Se identificó originalmente como una proteína celular que migraba a 130 kDa, y que se hiperfosforilada en v-Crk y células transformadas v-Src [4], [5]. Inicialmente, los estudios intensivos se han centrado en la correlación entre el cáncer de mama y BCAR1 [6], [1], [7], [8]. Por ejemplo, Brinkman et al. [7] sugerido BCAR1 sobreexpresión en ZR-75-1 línea celular de cáncer de mama renders resistencia antiestrógeno a las células. Además, Dorssers et al. [8] informó de que la expresión BCAR1 estaba inversamente relacionada con la supervivencia libre de recaída-y el tiempo de supervivencia global del cáncer de mama.
Recientemente, nuestro estudio sugiere que hay una implicación clínica de BCAR1 en el cáncer de pulmón no microcítico ( NSCLC) [9]. Se investigaron los niveles séricos BCAR1 en 80 casos de NSCLC y 80 controles sanos, respectivamente, mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas específico (ELISA) [9]. Curiosamente, se encontró que los niveles de BCAR1 suero fueron significativamente mayores en NSCLC que en el grupo control, aumentaron gradualmente con la progresión de la estadificación del tumor, y disminuyeron después de la eliminación de las lesiones malignas [9]. Sin embargo, los mecanismos oncogénicos de BCAR1 en NSCLC siguen siendo los enigmas.
Aquí, hemos llevado a cabo las investigaciones adicionales para evaluar el poder predictivo de BCAR1 como un biomarcador de mal pronóstico en pacientes con CPNM. Y verificamos los papeles cancerígenos de BCAR1 a través de la interferencia de ARN (ARNi) en la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549. Los experimentos in vivo e in vitro demostraron la correlación entre la expresión cerrada BCAR1 y la activación de p38 que es una rama fundamental de la (activada por mitógenos proteína quinasa) vía MAPK [10], [11].
Materiales y Métodos
los pacientes
el protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Consejo de Ética de la Investigación en el hospital Daping (Ciudad de Chongqing, República Popular de China) [nO. TMMU-DPH /2006-012], y el consentimiento informado fue escrita y obtuvieron de todos los pacientes.
En el estudio realizado entre enero de 2006 y junio de 2010, hubo un total de 182 pacientes con NSCLC. neoplasia pulmonar se diagnostica radiológicamente y confirmado por la patología. Ninguno de los pacientes había recibido tratamiento antes de su inclusión en el estudio. Las características demográficas y clínico-patológicas de los pacientes se muestran en la tabla 1. Todos los pacientes fueron sometidos a lobectomía y linfadenectomía. Ciento treinta y cinco pacientes recibieron quimioterapia adyuvante postoperatoria (paclitaxel más nedaplatino). El seguimiento postoperatorio estaba disponible en 151 casos por teléfono o por carta entrevista, y 31 casos perdidos durante el seguimiento debido a la información de contacto válida.
Cell Culture
A549 y Calu -3 líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en RPMI1640 /FBS al 10%, respectivamente
ARN de interferencia de BCAR1
en primer lugar, se utilizaron los siguientes pares de oligorribonucleótidos.: 5'-CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 'y 5'-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3'. secuencias enteras se derivaron de la secuencia de mRNA BCAR1 humano. Los oligonucleótidos se obtuvieron de SunBio Biotecnología Médica CO., Ltd (la ciudad de Shanghai, P.R.China). Las hebras complementarias dos (cada uno a 20 mM) en 60 l de tampón de hibridación (SunBio Biotecnología Médica CO., Ltd, la ciudad de Shanghai, P.R.China) se calentaron durante 5 minutos a 95 ° C y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A partir de entonces, el vector lentiviral pLVT351.LV BPA de etiquetado para BCAR1 RNAi se construyó mediante la inserción de los nucleótidos de recocido en el sitio Age I + EcoRI de 4,1 pmagic (SunBio Biotecnología Médica CO., Ltd, la ciudad de Shanghai, República Popular China).
en segundo lugar, la línea celular A549 se sembraron con 2,3 × 10
5 células por pocillo de placa de cultivo celular de 24 pocillos y se infectaron con lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células infectadas con pLVT351- LV y CMV-GFP-LV (vector lentiviral en blanco, pmagic 4.1) fue nombrado como el A549-BCAR1 RNAi y el control A549-negativos, respectivamente.
Análisis de transferencia Western de BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 y p38 en tejidos y células de NSCLC
NSCLC y los tejidos adyacentes normales emparejados (al menos 5 cm de distancia de los tumores primarios) se obtuvieron de un total de sesenta (incluyendo 35 adenocarcinomas y 25 carcinomas de células escamosas) casos para el Western Blot . Durante las operaciones, las muestras fueron recogidas por los técnicos con prontitud siguientes mudanzas. Además, también preparamos las líneas de células incluyendo Calu-3, A549, A549, el control negativo y A549-BCAR1 RNAi.
A partir de entonces, se prepararon lisados de tejidos y líneas celulares en un tampón RIPA que comprende 50 mM Tris -HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% de ácido desoxicólico y azida sódica al 0,02%. Las concentraciones de proteína se determinaron con un Kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL).
Las proteínas fueron desnaturalizados a 95 ° C durante 5 min, y 50 g de proteína por carril se resolvió por dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) utilizando 10% de gel de poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Thermo), que luego se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente. Las proteínas se inmunotransfirieron utilizando anticuerpo anti-BCAR1 (BD Transduction Laboratories, EE.UU., 1:1000), BCAR1-anti-fosfo anticuerpo (Tyr410) (Abcam, EE.UU., 1:1000), anti-p38 (material de BD Transduction Laboratories, EE.UU. , 1:1000) y anti-fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) anticuerpo (señalización celular Transduction Laboratories, EE.UU., 1:1000). Un anti-β-actina (Sigma) o anticuerpo GAPDH (Sigma) sirvió como control.
escalas de grises de inmunotransferencia de NSCLC y tejidos normales adyacentes emparejados fueron analizados cuantitativamente mediante el uso de la adquisición de imágenes y el software de análisis (Lab Image software, Bio-Rad, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
construcción de microarrays de tejido y el ensayo de inmunohistoquímica (IHC) de BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 y p38 en fosfo-NSCLC tejidos
la hematoxilina y eosina (H & amp; e) teñidas diapositivas de los 182 casos fueron inspeccionados. Para cada caso, el diagnóstico anatomopatológico fue identificado en el H & amp; E-deslizante manchada y luego en círculos. Una diapositiva correspondiente de tejido normal adyacente también fue marcado. microarray de tejido se construyó de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente [9]. La corredera marcado se alinea con la superficie del bloque donante correspondiente. A partir de entonces, el área fue marcada en los bloques de tejido en parafina. De cada muestra, núcleos de tejido con un diámetro de 1,5 mm se perforaron y entonces dispuestos en un bloque de parafina receptor. Se cortaron secciones (4 mm) de estos bloques de microarrays y luego se utilizaron para el análisis IHC
.
Las secciones fueron incubadas con anticuerpos primarios solución y que incluye anticuerpo anti-BCAR1 (BD Transducción Laboratories, EE.UU. suero de bloqueo, 1: 100), anti-fosfo-BCAR1 (Tyr410) de anticuerpos (Abcam, EE.UU., 1:100), anticuerpo anti-p38 (BD Transduction Laboratories, EE.UU., 01:50) y anti-fosfo-p38 (/Tyr182) anticuerpo Thr180 ( señalización celular transducción Laboratories, EE.UU., 1:10), anticuerpo secundario biotinilado y estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. solución de diaminobencidina se utilizó como cromógeno. Las diapositivas fueron counterstained en una solución de hematoxilina. Los resultados de IHC en la abundancia de proteínas se clasifican en función de los porcentajes de células positivas de la siguiente manera: -, tinción negativa; +, Posición débil (& lt; 25%); ++, Posición moderada (& lt; 50%); +++, Posición fuerte (≥50%). "& Lt; 25%" se clasificó como baja expresión, de otra manera como alta expresión Tres observadores llevan a cabo para marcar las diapositivas y los valores medios se obtuvieron finalmente
TDT mediada por dUTP nick ensayo de fin de etiquetado (TUNEL) de.. tejidos de NSCLC
se realizó el ensayo de TUNEL en secciones de tejido de todos los 182 casos. la apoptosis en el tumor se inspeccionaron in situ con el kit de detección de muerte celular, POD (Roche, Alemania). las secciones de tejido fueron Desparafinar en xileno, y hidratado a través de etanol graduado y previamente con la recuperación de antígenos de microondas (tampón de citrato, pH 7,5). la peroxidasa endógena fue bloqueada por 0,3% H
2O
2 en metanol durante 15 min. Después de ello, las secciones de tejido se trataron con 3% de bovino albúmina de suero durante 30 min y se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL. (TDT: dUTP, 01:20) durante 45 min a 37 ° C Las secciones de tejido se combinaron con el convertidor-POD, seguido de lavado y DAB reacción de color (Zhong Shong, china) . Durante el procedimiento de TUNEL, las secciones se lavaron en tampón fosfato salino (PBS). Muestras de tejido fueron contrastados por hematoxilina, se deshidrataron a través de etanol clasificado, despejado en xileno y se montaron. Para los controles negativos, se utilizó agua desionizada en lugar de TDT. Los controles positivos consisten en la amígdala humana inflamada. Las células se consideraron positivas cuando se detectó reactividad marrón intenso en los núcleos. índice apoptótico se calculó el porcentaje de tinción positiva nuclear en 1000 células en cinco sitios diferentes de cada sección con un aumento de 400 ×.
Real-time RT-PCR
Para evaluar la eficacia de ARNi de BCAR1, hemos realizado cuantitativa en tiempo real RT-PCR en las células de control A549-A549-negativo BCAR1 RNAi y. Cualquiera de las células se sembraron a una concentración de 1 x 10
5cells /pocillo en placas de 6 pocillos. Después de dos días de la siembra, el ARN total fue extraído de las células usando el reactivo Trizol (Invitrogen). Primera línea de cDNA fue sintetizado con M-MLV transcriptasa (Promega) y oligo dT. PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green PCR master mix (TAKARA) y el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de PCR se utilizaron como siguientes: 5'-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 'y 5'-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3'. La especificidad de las señales detectadas se confirmó por una curva de disociación que consiste en un único pico. Todas las muestras se realizaron por duplicado en cada experimento. Los valores se normalizaron por β-actina humana.
Cell Growth Ensayo
Para la evaluación del crecimiento de células, las células de control negativo y A549-A549-BCAR1-RNAi se colocaron en placas a 2,0 x 10
2 células por pocillo en placas de seis pocillos, respectivamente. Y cualquiera de las células fue inspeccionada y se fotografiaron después de la tinción Giemsa, once días después de la siembra.
Migración Celular Ensayo
Para la evaluación de la motilidad celular, ensayos de migración de cámara se realizaron utilizando un inserto de cultivo celular ( 8 micras de tamaño de poro, el formato de 24 pocillos; invasión celular Kit de ensayo gato CHEMICON, Nº ECM550).. células A549-negativo de control y A549-BCAR1-RNAi se sembraron por duplicado a una densidad de 3,0 × 10
5 células /cámara. Después de 48 horas, las células que no se habían movido a los pocillos inferiores se eliminaron de la cara superior de los filtros usando hisopos de algodón, y las células que se habían movido a la superficie inferior del filtro se tiñeron mediante el uso de una célula Invasion Assay Kit Cat. (Chemicon, No. ECM550). La migración celular se cuantificó mediante recuento visual después de haber sido fotografiado. Los experimentos se realizaron por duplicado. Los valores medios de tres campos al azar fueron obtenidos para cada pozo.
Ensayos de Ciclo Celular
Para la determinación de citometría de flujo de ciclos celulares, 2,0 × 10
6 de control de las células A549-A549 negativa y células -BCAR1-RNAi se fijaron en etanol al 70% y se tiñeron con yoduro de propidio, respectivamente. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan de ciclos celulares relativos. Los experimentos se realizaron por duplicado.
Ensayos de apoptosis de las células
Se evaluó la apoptosis celular utilizando citómetro de flujo FACScan. 2.0 × 10
6 de las células A549-negativo de control (48 h después de la transfección transitoria), control de las células A549-negativas (transfección estable), células A549-BCAR1-RNAi (48 h después de la transfección transitoria) y A549-BCAR1 RNAi células (transfección estable) se fijaron en etanol al 70% y se tiñeron con yoduro de propidio, respectivamente. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACScan de la apoptosis de células relativo. Los experimentos se realizaron por duplicado.
Análisis de Datos
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, prueba de Kruskal-Wallis,
X
2 de prueba y rho de Spearman, respectivamente. Muerte por cualquier causa se incluyó en el cálculo de la supervivencia postoperatoria. La supervivencia específica de la enfermedad se calculó por el método de Kaplan-Meier y se analizó mediante la prueba de log-rank. Los factores pronósticos fueron examinados por análisis univariados y multivariados utilizando un modelo de riesgos proporcionales de Cox. Todos los cálculos antes mencionados se realizaron con el programa SPSS versión 11.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU.). Un valor de p & lt; 0,05 (dos caras) se consideró estadísticamente significativo
Resultados
BCAR1 se sobreexpresa en los tejidos y líneas celulares de NSCLC
Se detectó la expresión BCAR1 (tampoco. en el núcleo, el citoplasma, o ambos) en 57 de los casos de NSCLC 60 mediante el uso de inmunotransferencia (Figura 1a), y 177 de los 182 casos de NSCLC mediante el uso de ensayo de IHC (Figura 1c), respectivamente. Sin embargo, no se detectó en el tejido normal adyacente en 53 de los 60 casos mediante el uso de inmunotransferencia (Figura 1a), y 161 de los 182 casos mediante el uso de ensayo de IHC (figura no mostrada), respectivamente. El análisis de escalas de grises de inmunotransferencia también sugirió BCAR1 niveles fueron significativamente mayores en el CPNM que en el tejido normal adyacente (prueba t de Student 48,2 ± 24,7 vs 11,0 ± 9,8,,
P Hotel & lt; 0,001, Figura 1b).
a: inmunotransferencia indicó ya sea BCAR1 o fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) niveles en tres tejidos de NSCLC (C) fueron significativamente mayores que en los tejidos normales adyacentes (N). Pero fosfo-BCAR1 (Tyr410) y p38 niveles en NSCLC y los tejidos normales adyacentes fueron similares. BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 y p38 expresiones fosfo-También se detectaron en A549 y Calu-3 línea celular de NSCLC mediante ensayo de inmunotransferencia. BCAR1 caída provoca la disminución sensible de los niveles de fosfo-BCAR1 y fosfo-p38 en las células A549. B: Gris escalas de análisis de inmunotransferencia también sugirió BCAR1 y fosfo-p38 (/Tyr182 Thr180) los niveles fueron significativamente mayores en el CPNM que en el tejido normal adyacente (48,18 ± 24,7 vs 10,97 ± 9,8,
P Hotel & lt; 0,001 ; 16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,
P Hotel & lt; 0,001). Sin embargo, fosfo-BCAR1 (Tyr410) y p38 no tenían la tendencia (20,72 ± 24,37 vs 6,4 ± 7,5,
P
= 0,22; 25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,
P = 0,476
). C: IHC sugirió las expresiones de BCAR1 (ya sea en el núcleo, el citoplasma), fosfo BCAR1 (propenso a localizar en el citoplasma), fosfo-p38 (propenso a localizar en el núcleo), p38 (propenso a localizar en el citoplasma ) y los cuerpos apoptóticos. Nota: N (tejido normal adyacente); C (tejido NSCLC); ** (
P Hotel & lt; 0,001);#(
P Hotel & gt; 0,05).
Sin embargo, se detectó fosfo-BCAR1 (Tyr410) en el citoplasma en 29 de los 60 NSCLC mediante inmunotransferencia (Figura 1a), y 32 casos de los 182 casos de NSCLC mediante el uso de ensayo de IHC (Figura 1c), respectivamente. Sin embargo, también se detectó en el tejido normal adyacente en 30 de los 60 casos mediante el uso de inmunotransferencia (Figura 1a), y 34 de los 182 casos mediante el uso de ensayo de IHC (figura no se muestra), respectivamente. El análisis de escalas de grises de inmunotransferencia sugirió que no había una diferencia apreciable de los niveles de BCAR1 entre NSCLC y el tejido normal adyacente (25,3 ± 11,2 vs 27,8 ± 15,2,
P = 0,476
, la prueba t de Student, la figura 1b) .
BCAR1 y fosfo-BCAR1 (Tyr410) se detectó en A549 y Calu-3 células de NSCLC mediante ensayo de inmunotransferencia (Figura 1a).
Superior BCAR1 niveles están fuertemente correlacionados con más pobremente diferenciado tumores y predice peor pronóstico
mediante el uso de IHC ensayo en los casos de NSCLC 182, se encontró que los niveles más altos BCAR1 se correlaciona fuertemente con una mayor diferenciación mal. (Prueba de Kruskal-Wallis,
P
= 0,01; Tabla 1). Sin embargo, no hubo correlación apreciable entre BCAR1 y otras características clínico-patológicos, incluyendo la edad, el sexo, la histología, estadio TNM, el tamaño del tumor y la metástasis linfonodos (Tabla 1). A pesar de expresión se detectó BCAR1 ya sea en el citoplasma, núcleo, o ambos, en NSCLC, no hubo correlación apreciable entre la localización de proteínas y los parámetros clínico-patológicos (datos no mostrados). Además, no hubo correlación significativa entre fosfo-BCAR1 y las características clínico-patológica (datos no mostrados).
La tasa de supervivencia del grupo de alto BCAR1 expresión fue significativamente inferior a la del grupo de baja expresión (
P
= 0,001, Figura 2a). El análisis multivariado reveló que los niveles de BCAR1 (cociente de riesgos instantáneos 1.777,
P = 0,028
), metástasis linfonodos (cociente de riesgos instantáneos 1.277,
P = 0,040
) y el estadio TNM (cociente de riesgos instantáneos 1.298,
P
= 0,007) fueron indicadores de pronóstico importante e independiente para casos de NSCLC (Tabla 2) guía
A:. La tasa de supervivencia de BCAR1 grupo de alto expresado fue significativamente más baja que de bajo expresado grupo (
P
= 0,001). B: células positivas de fosfo-p38 fue significativa y positivamente correlacionada con porcentajes de células positivas BCAR1, en los 182 tejidos de NSCLC (rho de Spearman, coeficiente de correlación = 0,811, p & lt; 0,001). Y los porcentajes de células positivas de fosfo-p38 en tejidos BCAR1 alta expresó fueron significativamente mayores que en los tejidos bajos expresó (Mann-Whitney U test z = -3,689
P Hotel & lt; 0,001). C: Las secciones secuenciales se tiñeron para BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 y p38, lo que demuestra que las células que sobreexpresan BCAR1 también tienen un mayor nivel de fosfo-p38 (× 200). Cualquiera de fosfo-p38 o BCAR1 fue ligeramente positivo.
BCAR1 caída provoca la detención del crecimiento celular, la inhibición de la migración celular y la detención del ciclo celular de las células A549
Hemos establecido el cáncer de células A549 NSCLC humanas que de forma estable expresado pLVT351-LV (células A549-BCAR1-RNAi) y CMV-GFP-L.V. (Células de control negativo A549-) a través del uso de un sistema de lentivirus. Al menos una reducción del 80% en los niveles de mRNA de BCAR1 en las células A549-BCAR1-RNAi fue confirmada por tiempo real de RT-PCR (Figura 3a) y Western Blot análisis (Figura 1a), respectivamente. Al mismo tiempo, podemos ver la inhibición de la fosfo-BCAR1 junto con BCAR1 desmontables (Figura 1a)
A:. Al menos una reducción del 80% en el ARNm de BCAR1 en las células A549-BCAR1-RNAi fue confirmado por real tiempo de RT-PCR. B: unidades formadoras de colonias de A549-BCAR1-RNAi eran detectable menos de de control de las células A549-negativas, once días después de la siembra. C: ensayo de migración celular sugirió BCAR1 nocaut impidió la migración celular de las células A549-BCAR1-RNAi. D: citometría de flujo indicó BCAR1 nocaut también causó la detención del ciclo celular de las células A549-BCAR1-RNAi. E:. El flujo nocaut BCAR1 citometría indicada no aumentó la tasa de apoptosis después de la transfección transitoria o bien (39,1% vs 42,1%) o estable (0,33% frente a 0,4%) en las células A549
Figura 3b sugeridas unidades formadoras de colonias de células A549-BCAR1-RNAi eran detectable menos de de control de las células A549-negativas, once días después de la siembra (Figura 3b). ensayo de migración de células sugirió BCAR1 caída impidió la migración celular de las células A549-BCAR1-RNAi (Figura 3c). Y citometría de flujo indicó BCAR1 desmontables también causó la detención del ciclo celular de las células A549-BCAR1-RNAi (Figura 3d).
BCAR1 se correlaciona negativamente al índice de apoptosis en los tejidos de NSCLC. Sin embargo, BCAR1 caída no puede aumentar la apoptosis en las células A549
Los cuerpos apoptóticos se detectaron en todos los tejidos de NSCLC 182 (Figura 1c). Entre los tejidos, hubo una correlación significativa e inversa entre BCAR1 y el índice de apoptosis (rho de Spearman, coeficiente de correlación = -0,183;
P = 0,013
). índice de apoptosis en los tejidos BCAR1 alta expresó fue sustancialmente menor que en los tejidos BCAR1 bajos expresó (prueba t de Student t = 2.312
P = 0,022)
.
Sin embargo, en comparación con el control negativo células, nocaut BCAR1 no aumentaron tasa de apoptosis después de la transfección transitoria o bien (39,1% vs 42,1%) o estable (0,33% frente a 0,4%) en las células A549 (Figura 3e).
la sobreexpresión de BCAR1 se correlaciona con la activación de p38 en casos de NSCLC y desmontables BCAR1 provoca la reducción de fosfo-p38 en células A549
No se detectó expresión en 31 de los casos de NSCLC 60 mediante inmunotransferencia (Figura 1a) fosfato p38, y 91 de los 182 NSCLC casos (con tendencia a localizarse en el núcleo) mediante el uso de IHC ensayo (Figura 1c). Similar a la tendencia de los niveles de BCAR1, análisis de escalas de grises reveló niveles de fosfo-p38 fueron significativamente mayores en NSCLC que en los tejidos adyacentes normales (16,03 ± 5,8 vs 28,82 ± 8,0,
P
& lt; 0,001; Figura 1b) . Sin embargo, p38 no tenía la tendencia (20,72 ± 24,37 vs 6,4 ± 7,5,
P
= 0,22) (Figura 1b). Además, IHC sugirió tasa positiva de cualquiera de BCAR1 o fosfo-p38 fue sustancialmente más alta en NSCLC que en el tejido normal (
P
& lt; 0,001 y P & lt; 0,001, respectivamente) (tabla 1). Sin embargo, p38 no tuvo tal tendencia (
P
= 0,62).
Nos encontramos porcentajes de células positivas de fosfo-p38 fue significativa y positivamente correlacionado con los de las células BCAR1 positivos, en todos los 182 tejidos de NSCLC (rho de Spearman, coeficiente de correlación = 0,811, P & lt; 0,001; Figura 2b). Y los porcentajes de células positivas de fosfo-p38 en tejidos BCAR1 alta expresó fueron significativamente más altos que en los tejidos BCAR1 bajos expresó (test de la U de Mann-Whitney z = -3,689
P Hotel & lt; 0,001; Figura 2b). Sin embargo, no había ninguna correlación entre fosfo-BCAR1 y los niveles de fosfo-p38 (p = 0,892).
En un intento de representar la fuerte correlación entre las células positivas BCAR1 positivos y fosfo-p38, presentamos el secuencial las secciones teñidas en un caso de BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 y p38, lo que demuestra que las células que sobre-expresan BCAR1 también tienen un mayor nivel de fosfo-p38 (Figura 2c).
niveles
BCAR1 en Calu-3 células fueron detectablemente mayor en comparación con las células A549 (Figura 1a). Curiosamente, la figura 1a sugerido niveles de fosfo-p38 también tenía la misma tendencia. Por otra parte, BCAR1 caída también provoca la disminución sensible de la abundancia fosfo-p38 en células A549 (Figura 1a).
Discusión
BCAR1 como una proteína adaptadora se localiza en el cromosoma 16q22-q23
7 , y consiste principalmente en cuatro porciones funcionales que incluyen una homología Src amino-terminal 3 (SH3) de dominio, un dominio Src de unión (SBD), un dominio grande de sustrato (SD) y un dominio de hélice-bucle-hélice (HLH) [12 ], [13]. BCAR1 localiza ubicua in vitro e in vivo [14], [15], [16], y está implicado en diversos procesos celulares, incluyendo la migración, la quimiotaxis, apoptosis, ciclo celular, la diferenciación y así sucesivamente [17], [18].
Hasta ahora, muy pocos estudios se centraron en la carcinogénesis de BCAR1 en cáncer de pulmón. Wei et al. [19] sugiere que la fosforilación independiente de anclaje de BCAR1 protegida células de adenocarcinoma de pulmón de anoikis. Recientemente, nuestro estudio sugirió que los niveles de BCAR1 suero fueron significativamente mayores en NSCLC que en el grupo control, aumentaron gradualmente con la progresión de la estadificación del tumor, y disminuyeron después de la eliminación de las lesiones malignas [9]. Como resultado, nos supondrá un nuevo papel oncogénico de BCAR1 en el CPNM. En este documento, que tuvo como objetivo verificar las implicaciones clínicas de BCAR1 sobreexpresión y CPNM, y para dilucidar los mecanismos de carcinogenéticas BCAR1 en el CPNM. Como era de esperar, encontramos proteínas BCAR1 es especialmente abundante en las células y tejidos de NSCLC. Y nuestros estudios in vivo e in vitro han demostrado la estrecha correlación entre la expresión BCAR1 y la activación de p38 MAPK. Aunque estudios previos han demostrado que la fosforilación de la tirosina de BCAR1 puede ser crítica para la señalización corriente abajo [20], nuestro estudio indicó que se detectó fosfo-BCAR1 (Tyr410) en solamente 34 de los 182 casos, y no correlacionada con características clínico-patológicas. Hasta el momento, numerosos sitios de fosforilación BCAR1 humano se encuentran como: tirosina aa residuos 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666; serina aa 134, 139, 292, 437, 639 residuos; y treonina aa 269, 326, 385. residuos Partimos de que algunos sitios específicos de fosforilación son críticos para las cascadas de señales de BCAR1 en NSCLC. Curiosamente, los tejidos normales adyacentes muestran niveles mucho más altos de fosfo-BCAR1 que de BCAR1 proteínas (Figura 1a). También confirmó la inhibición de la fosfo-BCAR1 junto con BCAR1 caída en un intento de verificar la eficacia de este anticuerpo. Partimos de que una enzima especial en los tejidos pulmonares se descompone específicamente para no fosfo-BCAR1, sin embargo, fosfo-BCAR1 puede sobrevivir. Y todas las hipótesis antes mencionadas merecen más más investigaciones.
Nuestros experimentos in vitro demostraron que BCAR1 caída en células A549 causó la detención del crecimiento celular, la detención del ciclo celular y la inhibición de la migración celular. Aunque BCAR1 caída en células A549 no causó apoptosis de las células, hubo una correlación inversa entre apreciable y BCAR1 y el índice de apoptosis en los tejidos de NSCLC. No sabemos las razones de la discrepancia entre las células y el tejido NSCLC. Además, nuestro estudio in vivo demostró que los niveles fueron significativamente BCAR1 e inversamente correlacionada con la diferenciación del tumor, ya sea por porcentajes positivos de conteo de células (prueba de Kruskal-Wallis,
P
= 0,010) o la evaluación de la intensidad de colores (achromasy = 0 , stramineous = 1, Buffy = 2, marrón = 3; prueba de Kruskal-Wallis,
P = 0,014
). Curva de Kaplan-Meier indicó también que los niveles más altos de BCAR1 predijeron peor pronóstico en 151 casos con datos válidos de seguimiento. Todos los experimentos antes mencionados sugerido BCAR1 tuvo un papel crucial en la carcinogénesis. Además, BCAR1 se conoce como sustrato Src, y Src AZD0530 inhibidor también puede dar lugar a una inhibición significativa de la migración celular y la invasión de matrigel en células de cáncer de pulmón [21], lo que potencialmente apoya la carcinogénesis de eje Src /BCAR1.
Utilizando inmunotransferencia, Greenberg et al. [22] encontró que sólo activado MAPK p38 se aumentó consistentemente en NSCLC en comparación con el tejido normal, lo que sugiere una función adicional para esta vía en crecimiento de células malignas o transformación. De hecho, numerosos estudios han dado a conocer las actividades carcinogenéticas de p38, incluyendo la estimulación de la proliferación y la migración [1], [23], [24]. Matsuda K et al. [23] encontró que el EGF promueve la proliferación a través de cascadas de señalización de p38 en líneas celulares de cáncer de páncreas ASPC-1, PANC-1 y T3M4 MAPK y p38 MAPK SB203580 inhibidor puede inhibir la mitogénesis estimulada por EGF. Además, la vía MAPK p38 se ha implicado a desempeñar un papel importante en la migración de células endoteliales, porque la inhibición de la actividad de p38MAPK regula a la baja la migración estimulada por VEGF [24]. Recientemente, Wendt et del al. Estudio [25] demostraron que el aumento de expresión de cualquiera de los de longitud completa o sólo el extremo carboxilo de BCAR1 en células epiteliales mamarias aumento de la activación de p38. Curiosamente, en 182 tejidos de NSCLC, nos pareció que había una estrecha correlación entre la expresión de BCAR1 y fosfo-p38. Mediante la evaluación de la intensidad de colores de fosfo-p38 y BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, Buffy = 2, marrón = 3, "& lt; 2 puntuaciones" se clasificaron como de baja expresión, si tan alta expresión), encontramos la abundancia de fosfo-p38 también fue significativa y positivamente correlacionado con el de BCAR1 (rho de Spearman, p & lt; 0,001). además, BCAR1 desmontables también causó la disminución sensible de los niveles de fosfo-p38 en las células A549 Sin embargo, los mecanismos subyacentes merecen más investigaciones además..