Extracto
carcinoma seroso de alto grado (HGSC) es la forma más común y más mortal de cáncer de ovario. Sin embargo, es generalmente asintomática en sus etapas iniciales. El estudio del origen y evolución temprana de esta enfermedad es por lo tanto crucial en la identificación de marcadores para la detección temprana y fines de selección. espectrometría de masas de imágenes basado en Tissue (MSI) se puede emplear como una forma imparcial de examinar los cambios metabólicos localizadas entre el tejido sano y canceroso directamente, en el inicio de la enfermedad. En este estudio, se describen los resultados de los ratones MSI
Dicer-PTEN
doble knockout (DKO), un modelo de ratón que reproduce fielmente la naturaleza clínica de HGSC humano. Mediante el uso de la factorización de la matriz no negativa (NMF) para el análisis no supervisado de ionización por electrospray desorción (DESI) de datos, las regiones de tejido se segregan con base en los componentes espectrales de una manera imparcial, con alteraciones relacionadas con HGSC resaltado. Los resultados obtenidos mediante la combinación de NMF con DESI-MSI revelaron varias especies metabólicas elevadas en el tejido tumoral y /o alrededor de quiste lleno de sangre incluyendo las ceramidas, esfingomielinas, bilirrubina, sulfato de colesterol, y diversas lisofosfolípidos. Múltiples metabolitos identificados en el estudio de imagen también se detectaron en niveles alterados dentro de suero en un estudio metabolómica anterior del mismo modelo de ratón. Como un ejemplo de flujo de trabajo, características identificadas en este estudio se utilizaron para construir un modelo OPLS-DA capaz de discriminar entre DKO ratones con tumores en fase inicial y controles con hasta un 88% de precisión
Visto:. Paine LMR, Kim J, Bennett RV, Parry RM, la Galia DA, Wang MD, et al. (2016) Todo el sistema reproductor no negativo factorización de la matriz de Espectrometría de Masas de imagen de una etapa temprana del cáncer ovárico-modelo de ratón. PLoS ONE 11 (5): e0154837. doi: 10.1371 /journal.pone.0154837
Editor: Shengtao Zhou, China occidental Segundo Hospital de la Universidad de Sichuan, China
Recibido: 28 Diciembre, 2015; Aceptado: 20 Abril de 2016; Publicado: 9 Mayo 2016
Derechos de Autor © 2016 Paine et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todas las imágenes archivos de datos están disponibles en la base de datos figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3171715.v1)
Financiación:. Fondo de Investigación del cáncer de Ovario subvención (OCRF) Programa de Desarrollo de Proyectos ( http: //http: //www.ocrf.org) y una subvención-desafío de la Fundación Marsha Rivkin (http: //http: //www.marsharivkin.org). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma seroso de alto grado (HGSC), un subtipo de cáncer de ovario también conocido como cáncer de ovario seroso de alto grado, es responsable del 70% de todas las muertes por cáncer de ovario y sin embargo, el origen y la evolución temprana de esta mortal la enfermedad sigue siendo poco conocida. [1-4] pruebas de detección fiables en la práctica clínica no están disponibles actualmente, y el curso asintomático a través de las primeras etapas de la enfermedad hacen que la detección precoz de HGSC extremadamente difícil. En consecuencia, la mayoría de los casos HGSC (& gt; 95%), y por extensión la mayoría de los casos de cáncer de ovario, se diagnostican en estadios avanzados que conducen a tasas -aproximadamente supervivencia a 5 años pobres 44,6% de todos los casos diagnosticados durante 2004-2010 [1. , 5-7] Sin embargo, cuando el cáncer se diagnostica y se limita a la localización del tumor primario, la tasa de supervivencia a 5 años aumenta a más del 90%. [8] Por tanto, es imperativo que los métodos de detección temprana se desarrollan para combatir ovario la mortalidad por cáncer.
La identificación de los cambios bioquímicos en los tejidos de los comienzos y finales de etapas HGSC podría proporcionar un medio para seleccionar los marcadores que podrían ser monitoreados en sangre u orina para la detección y el diagnóstico precoz. Un reto importante asociado con este enfoque, sin embargo, es la dificultad de encontrar pacientes con cáncer de ovario en estadio temprano, como primeras etapas son asintomáticos. los últimos modelos de ratón de cáncer de ovario, con HGSC originarios de la trompa de Falopio u ovario, presentan una oportunidad única para superar este desafío. [9-11] Cuando dos genes críticos están desactivadas de forma condicional (
Dicer
Flox /Flox
PTEN
flox /flox
Amhr2
cre /+), estos (DKO) los ratones knock-out que se desarrollan HGSCs tubo originados de Falopio, que luego se extendió al ovario antes de metástasis en toda la cavidad abdominal, causando ascitis y conduce a la muerte. [9] como alternativa, doble ratones mutantes que llevan p53 mutante y
PTEN
eliminación producen HGSCs-ovario de origen, así como no HGSCs en el ovario con las trompas de Falopio normales. [10] Además, los ratones mutantes de triple, (
p53
LSL-R172H /+
Dicer
flox /flox
PTEN
flox /flox
Amhr2
cre /+) que incluyen p53 mutante, las mutaciones más frecuentemente observadas en HGSC humana (~ 97%), también desarrollar Falopio tubo originados HGSC con el patrón idéntico de metástasis como DKO ratones. Aunque ambos modelos DKO y TKO duplican igualmente bien la naturaleza clínica de HGSC humano, el modelo DKO también se ha caracterizado a nivel molecular, con DKO HGSC que exhibe similitud molecular a HGSC humano. Por lo tanto, en este estudio se seleccionaron ratones DKO para una mayor investigación utilizando imágenes basada en espectrometría de masas análisis.
En imágenes espectrometría de masas (MSI), los espectros de masas se registran en puntos espaciales discretos a través de la muestra de tejido, dando lugar a un cubo de datos con un espectro de masas para cada (x, y) de píxeles. Bidimensionales imágenes en falso color que mapean la distribución espacial de analitos específicos son creados a partir de estos datos. [12] Dos métodos MSI bien establecidas que se han aplicado a los estudios de cáncer son láser asistida por matriz de desorción /ionización (MALDI), [ ,,,0],13-18] y la ionización de desorción electrospray (DESI). [19-25] Específicamente para el cáncer de ovario, varios estudios MALDI MSI se han publicado se centra en la proteína y péptido de identificación de biomarcadores. [26-29] Sólo un informe por Liu et al ha investigado el papel potencial de los metabolitos utilizando MSI. [30] en este estudio, los experimentos de MALDI fueron dirigidas por el análisis de transcriptómica y se centró específicamente en la detección de sulfátidos, una subclase de los glicoesfingolípidos. DESI MSI, por el contrario, sólo se ha aplicado al estudio de los cambios a nivel molecular observadas entre antes y después de la ovulación, pero no a la detección de biomarcadores de cáncer temprano. [31]
Dada la gran cantidad de información química generada en MSI, la extracción de la información biológicamente relevante relacionada con un factor específico puede no ser sencillo, que requiere una inspección visual y la comparación de cientos e incluso miles de imágenes para cada experimento. Para simplificar el análisis de datos de MSI, la comparación de los espectros de varias regiones o múltiples muestras es posible usando selección de región de interés (ROI). [32] comparaciones ROI son sencillos, con un promedio de espectros obtenidos en cada píxel de una región seleccionada, y son los mejores adecuado para los análisis histológicos donde los límites están bien definidos. Sin embargo, en los casos en los límites histológicos son menos claros o cuando se están generando nuevas hipótesis biológica, definiendo manualmente de retorno de la inversión puede ser un reto. En la investigación de la progresión de la enfermedad en secciones de tejido de gran tamaño, por ejemplo, marcadores químicos pueden ser escasamente distribuidas y al poco abundantes, por lo que su detección mediante la selección de ROI difícil.
métodos semi-supervisado que emplean algoritmos de agrupamiento que asignan automáticamente la segmentación Los mapas de acuerdo a los patrones de moléculas co-localizados se pueden emplear en tales escenarios. Sin embargo, estos métodos aún dividen los datos en segmentos espaciales discretas y requieren que el usuario inspeccionar muchas imágenes de iones individuales para confirmar que coinciden con el segmento correspondiente. [33] Los métodos sin supervisión en base a algoritmos estadísticos se prefiere por lo tanto para la minería de datos de amplia y heterogénea muestras de tejido, lo que requiere una mínima intervención humana. [34, 35] Tales algoritmos han sido investigadas para el análisis de conjuntos de datos MSI incluyendo análisis de componentes Principales (PCA) [36], máximo autocorrelación factorización [37], K-medias [38] y Fuzzy C -Medios [39] agrupación, Probabilístico análisis semántico latente [40], y la factorización no negativo matriz (NMF) [41]. La comparación de la correlación de Pearson de imágenes componentes de salida contra los verdaderos imágenes de la muestra mostró que de todos estos métodos, NMF tuvo la mayor correlación media de la imagen. [35] Además, debido a la incorporada en el no-negatividad, imágenes componentes NMF se interpretan con facilidad y más adecuado para los datos de espectrometría de masas que otros métodos estadísticos multivariados, tales como PCA. [42, 43]
en esto seguimos arriba en nuestro estudio metabolómica suero de los ratones
Dicer-PTEN
DKO con un estudio DESI MSI del sistema reproductivo completo del mismo modelo de ratón [44]. DESI MSI análisis multivariante de datos se llevó a cabo con una nueva versión de omniSpect [45], ahora capaz de manejar grandes (~ TB) MSI conjuntos de datos. Al separar los datos de MSI en múltiples componentes NMF a través omniSpect, características que representan cambios metabolómicos entre tejido sano y canceroso se visualizaron fácilmente. a continuación, se estudiaron los correspondientes NMF "espectros componente" que describe estas imágenes, la identificación de las especies químicas alteradas en el microambiente tumoral HGSC, varios de los cuales también habían sido detectados anteriormente en el nivel sérico. [44]
Materiales y Métodos
Dicer-PTEN doble golpe de gracia (Dicer-PTEN DKO) Ratones
Dicer-PTEN
DKO (
Dicer
flox /flox
PTEN
flox /flox
Amhr2
cre se generaron en el apareamiento de los machos (
Dicer
flox /flox
PTEN
flox /flox
Amhr2
cre /+) con las hembras (
Dicer
flox /flox
PTEN
/Flox Flox). Mujer
Dicer
flox /flox
PTEN
flox /flox (un genotipo no llevar
Amhr2
+ /CRE) los ratones fueron utilizados como controles. Todos los ratones fueron obtenidos de la cría en el local en el Colegio Baylor de Medicina y fueron alojados en un vivero con una temperatura controlada de 21 ° C. Fueron alimentados 5053 irradiado PicoLab 20 Dieta de roedores y tenían acceso a agua potable suministrada en botellas.
Dicer
flox /flox
PTEN
flox /flox
Amhr2
cre /+ ratones DKO utilizados en este estudio se desarrollan ascitis como tumores metastatizan . Una vez que los ratones comenzaron a mostrar signos de ascitis, que fueron controlados diariamente. Los ratones se recomiendan para la eutanasia cuando el volumen de ascitis llegó a 10% del peso corporal del animal. Todos los ratones utilizados en este estudio (10 en total) fueron sacrificados antes de alcanzar el límite de la eutanasia a través de una inhalación sobredosis de dióxido de carbono para evitar el dolor innecesario y sufrimiento, de acuerdo con el protocolo de animales (AN716) aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional (IACUC) en el Colegio Baylor de Medicina.
Preparación de muestras
el sistema reproductivo totalidad de los ratones DKO (incluyendo el útero, las trompas de Falopio y los ovarios fueron extirpados) y el flash se congeló a -80 ° DO. El tejido extirpado intacto se ha incrustado en una solución acuosa de gelatina (10% w /v) y carboximetil celulosa (5% w /v) y se congelaron a -80 ° C. bloques de tejido embebidos se colocaron en la cámara de un criostato Cryostar NX70 (Thermo Scientific Inc., San José, CA, EE.UU.) durante 30 minutos y luego se seccionaron a 20 micras de espesor tanto con el bloque de corte y el bloque de muestra mantenida a -20 ° C . Muestras de tejido fueron descongelar montados en Superfrost Plus Micro diapositivas (VWR International LLC., Radnor, PA, EE.UU.) y se mantuvieron a -80 ° C hasta su análisis.
desorción ionización por electrospray-espectrometría de masas Imaging
imágenes DESI-MS fueron adquiridos utilizando una fuente de iones a la medida que consiste en un aerosol Omni DESI pulverizador (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) capaz de ajustes finos utilizando etapas manuales y plataformas de varios ejes (Thorlabs, Inc., Newton, NUEVA JERSEY). Las siguientes variables geométricas y experimentales DESI-MS se optimizaron para el experimento de imágenes: altura del rociador de la punta por encima de la superficie (5 mm), el ángulo de incidencia (55 °), distancia del pulverizador con punta de MS entrada (15 mm), altura de entrada por encima de superficie (& lt; 1 mm), spray disolvente (metanol), la tasa de flujo de disolvente (5 l min
-1), gas (nitrógeno), nebulización de presión de gas (100 psi), y el voltaje de pulverización (-5 kV) nebulización . La entrada de espectrómetro de masas utilizado fue diseñado específicamente para obtener imágenes de DESI-MS y sobresale 18 cm desde la parte frontal del instrumento, permitiendo el acceso a las superficies de muestra más grandes
.
Mientras que el pulverizador de DESI y MS de entrada se mantiene estacionario, la muestra en ser fotografiado fue trasladado en un "peine" en forma de vía, permitiendo que el pulverizador DESI a raster toda la superficie de la muestra en 2-dimensiones usando un OptiScan II motorizado platina del microscopio (Prior Scientific Inc., Rockland, MA) controlado por un programa Labview VI . se describe anteriormente [19, 45] la etapa de velocidad se fijó a 160 micras s
-1 en el
x
-Dimension con un paso de la línea de 200 micras en el
y CD - dimensión. Los espectros de masas de iones negativos se adquirieron en un espectrómetro de masas Exactive Plus Orbitrap (Thermo Scientific, San Jose, CA) en el rango de
m /z 400-1000
en el modo de centro de gravedad después de optimizar las siguientes variables experimentales: masa resolución (17.500 a
m /z
200), diana control automático de ganancia (1e
6 iones), microscans por escaneo (2), tensión s-lente (75 V), el tiempo máximo de inyección (100 ms), y la temperatura del capilar (250 ° C).
Tratamiento de datos
el archivo de datos de imagen de MS como una sola adquisición, continua, junto con el tiempo Labview y archivos posición de salida se carga en el omniSpect servidor basado en web (http://cs.appstate.edu/omnispect).[45] a partir de la posición de fase generada Labview y la información de temporización, omniSpect crea un cubo de la imagen línea por línea usando espectros de masa recogida en el primer pasar a lo largo de la ruta en forma de peine. Los espectros de masas originales se interpolan linealmente sobre una rejilla regularmente espaciados a lo largo del eje x. [46]
Para espectros recogidos, omniSpect estima primero un perfil completo utilizando una común logarítmicamente espaciados
m /z
escala para todos los análisis y la aplicación de una pequeña ventana gaussiana alrededor de cada pico. Se utilizó una desviación estándar de
m /z
0,001 y un cubo de ancho de
m /z
0,0005 a
m /z 850
para estos datos. En general, la reducción de la papelera de ancho permite que el centro de Gauss para representar con mayor precisión el centro del pico de datos centroide (
i
.
e
., El experimental
m /z
valor) con los compartimientos circundantes siendo llenado para dar cabida a los cambios de masa en el transcurso del experimento. Por tanto, la desviación estándar corresponde a la varianza tolerada de este cambio de masa y representa la anchura de pico esperado si se recogieron los datos en modo de perfil. La precisión de los datos centroided se puede configurar en la versión más reciente de omniSpect (http://cs.appstate.edu/omnispect/) con tres ajustes predefinidos:
m /z
± 0,1, 0,01 y 0,001. En la más alta precisión, este enfoque genera cubos de datos con dimensiones muy grandes, pero los datos muy dispersos. Por ejemplo, los datos MSI típico de ratón producen un cubo de imagen de tamaño [805 × 59 × 2556741] lo que requeriría 904 GB si se almacenan como valores de precisión doble. Debido a que sólo el 0,06% de los elementos son distintos de cero, utilizando un escaso resultados de representación de la matriz en los archivos que requieren menos de 2 GB en la memoria.
Dado un cubo de datos MSI, modelos NMF cada componente del espectro como la combinación lineal no negativa de cada imagen ion componente como la combinación lineal no negativo de imágenes fuente espectros fuente y. Por ejemplo, los espectros de la fuente en una muestra de tejido dado puede pertenecer a diferentes iones combinaciones o "componentes", que se produce en varios tipos de tejidos, cada una ocupando diferentes pero posiblemente correlacionados distribuciones espaciales. NMF recupera las distribuciones componente espectros no negativo y espaciales reduciendo al mínimo la diferencia entre los datos observados y modelado.
Primero, el cubo de datos 3-D se convierte en una matriz 2-D por vectorización de las coordenadas de píxeles en una sola dimensión. El usuario selecciona el número de componentes para extraer y NMF ellos estima. Entre los muchos algoritmos para NMF, usamos el enfoque de mínimos cuadrados (ALS) alterna a minimizar la norma de Frobenius [47]: en la que V representa la matriz de datos, W representa las imágenes de componentes, y H representa los espectros de masas de los componentes. Cada columna de la fila W y correspondiente de H representa la distribución espacial y espectros de masa de un componente, respectivamente. Su producto, WH, representa la combinación lineal de los componentes que se aproxima a los datos. El algoritmo comienza inicializando H con valores positivos. A continuación, se resuelve para el W que minimiza
D Opiniones de H fijo utilizando la solución de mínimos cuadrados: donde#representa el pseudoinverse Moore-Penrose. Cualquier valores negativos en W se sustituyen con ceros y el proceso se repite para H. Específicamente,
D
se minimiza para el nuevo valor de W:
Una vez más, los valores negativos se sustituyen con ceros, y el proceso se repite, alternando entre W y H hasta la convergencia. Después de la estimación, imágenes componentes están representados como 2-dimensionales parcelas falso color y la abundancia relativa de los iones dentro de los espectros se normalizan a la base de pico dentro del conjunto de componentes NMF. [47]
Análisis de Datos
características espectrales de masas desde el cuarto componente NMF fueron una referencia cruzada con la lista extraída y curada de características espectrales obtenidos tras el análisis UPLC-MS de suero de 14 tumores en estadio temprano ratones (ET) DKO y 11 controles. [ ,,,0],44] las características espectrales UPLC-MS se extrajeron de los datos utilizando el software MZmine 2,0 [48] y la alineación cromatograma involucrados, la identificación y la integración de picos, la extracción de área del pico, y la normalización de curación después de la matriz de datos. Curación de los datos consistió en la eliminación de señales que estaban presentes en las muestras en blanco, el disolvente, o no estaban presentes en al menos 50% de las muestras de suero. características espectrales de masas se superponen entre el componente NMF seleccionado y la lista UPLC-MS curada se utilizaron para construir un modelo para la discriminación de clase de la muestra a través de mínimos cuadrados parciales ortogonales análisis discriminante (OPL-DA) utilizando MATLAB (MATLAB versión 7.13.0, The MathWorks, Natick, MA con PLS_Toolbox v.6.71, Vector Propio de Investigación, Wenatchee, WA).
resultados
Cuatro
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DKO ratones a la edad de 8 meses se sacrificaron y el se recogieron los órganos reproductores intactas. Un ratón muestra un gran tumor primario con un quiste lleno de sangre al final de un cuerno uterino y un ovario sano con una pre- o quiste no canceroso en el otro cuerno uterino (Fig 1A). Esta muestra fue seleccionada para el análisis de MSI como se planteó la hipótesis de que la formación de imágenes por el ovario sano, quiste pre- o no cancerosos, y el tumor madura juntos, comparaciones espectrales directos podrían hacerse entre las diferentes regiones de tejido. Diferentes componentes espectrales detectadas, en particular los localizada dentro de la región del tumor /quiste, a continuación, podría caracterizarse y evaluados por su papel biológico o como potenciales marcadores de la enfermedad.
(a) Fotografía de una sección de tejido fina de un DKO ratón del sistema reproductivo deshielo montado en un portaobjetos de vidrio. (B) Una imagen de un solo componente NMF que representa los datos del modo de iones negativos DESI-MS para el sistema reproductivo DKO ratón y (c) el espectro NMF correspondiente. La imagen actual de iones totales (TIC) para los datos del modo de iones negativos DESI-MS y (e) el espectro correspondiente TIC.
Una imagen DESI-MS modo de ión negativo fue adquirida (d) a partir de una sección gruesa 20 mM del sistema reproductivo completa escindió del ratón DKO antes mencionado. La figura 1 muestra una imagen óptica de la muestra de tejido junto con la imagen en falso color y los espectros correspondiente, tanto para el cronograma de iones total (TIC) y de un solo componente del resultado NMF. La comparación de las dos imágenes y espectros ilustran hasta qué punto el algoritmo ALS puede aproximar los factores cubo de datos y por lo tanto qué tan bien los resultados NMF representar los datos verdaderos. Las imágenes presentadas en la figura 1B y 1D son similares pero no idénticos, como NMF se aproxima a cada espectro en esta imagen como una versión a escala de un espectro de componente. Regiones de la imagen componente NMF que no coinciden con la imagen TIC indicar aquellas regiones tienen espectros que difieren de espectro TIC. Por ejemplo, la región del tumor /quiste de la derecha muestra una mayor intensidad en la escala de falso color de la imagen en TIC pero el espectro promedio para esa región no se modela así por el espectro de "medio" para toda la imagen. Por lo tanto, en comparación, la región /quiste tumor está representado con una menor intensidad relativa en la escala de color falso en la imagen de un solo componente NMF en. Sin embargo, los espectros en la figura 1C y 1E son casi idénticas con las listas de pico y las abundancias relativas conservadas. Progresivamente la segmentación de los datos en dos o más componentes usando NMF por lo tanto, podría proporcionar resultados significativos con respecto a las diferencias biológicas relacionadas con la progresión de la enfermedad mediante la revelación de estas diferencias espectrales. Determinar el número óptimo de componentes NMF con el fin de modelar la verdadera diferencia biológica al tiempo que rechaza el ruido no deseado, la variación técnica, y los artefactos es, pues, fundamental para comprender el nivel de información útil contenida en estos datos.
La figura 2A y 2C muestran los resultados de la división del cubo de datos en dos componentes NMF. La imagen de la figura 2A se asemeja a la de la figura 1B con el pico base a
m /z 885,5436
que domina el espectro correspondiente a las dos imágenes. La masa exacta de este pico sugiere que corresponde a la [MH]
- ion de un fosfatidilinositol (PI) con 38 átomos de carbono totales y 4 dobles enlaces totales en las cadenas de acilo (theo [MH]
-;.
m /z 885,5499
). Esta especie de lípidos es una de las especies de lípidos ácidos más abundantes presentes en las membranas celulares de mamíferos y se detecta de forma rutinaria al realizar MSI de tejidos de mamíferos. [49] La diferencia más notable entre las figuras 2A y 1B es la intensidad de la señal reducida en la figura 2A en el región /quiste tumoral. Fig 2C muestra la segunda componente NMF y revela un marcado contraste con la primera componente NMF, con un aumento de la intensidad de señal en la región de tumor /quiste y la disminución de la intensidad en la región de ovario sano. Figura 2D representa el espectro correspondiente a la imagen en la figura 2C, revelando las especies que contribuyen a la intensidad de la señal aumentado dentro de la región del tumor /quiste. Se observaron tres especies principales en la figura 2D a
m /z
572.483, 682.589, y 684.595. Para las especies a
m /z
572.483 y 684.595, se observó un pico + 2 M a una relación de abundancia relativa de 3: 1, lo que sugiere la presencia de un átomo de cloro dentro de cada especie. Para
m /z
682.589, la señal de M + 2 se superpone con la especie a
m /z
684.595. Las especies a
m /z 684,595
tiene una abundancia relativa mucho mayor que el esperado para el
37Cl isótopo de
m /z
682.589. Por lo tanto, los iones a
m /z
684.595 se atribuyen a una especie química por separado con la posible contribución de un
isótopo 37Cl. Curiosamente, estos tres iones se detectaron también en un estudio que investigó extractos de lípidos celulares de líneas de células tumorales murinas por ESI-MS y se identificaron como el [M + Cl]
- iones de C16, C24: 1 y C24: 0 ceramidas (teo.
m /z 572,4815
,
m /z 682,5911
, y
m /z 684,6067
, respectivamente). [50] La elevación de estos tres metabolitos se ha informado de estar involucrado en la apoptosis de células dendríticas inducida por tumor por vía abajo de la regulación de la fosfoinositida-3-quinasa (PI3K). [50] por la liberación de estos compuestos de señalización inmunosupresor, el tumor crea un microambiente favorable por el que puede evadir el anfitrión de respuesta inmune y proliferar. [51]
las imágenes componentes NMF resultantes (a) y (c), y correspondiente espectros (b) y (d) a partir de la división de la adquisición de modo de ion negativo DESI-MS en dos componentes NMF. (E) La imagen de TIC a partir del mismo conjunto de datos que muestra la región de interés (ROI) seleccionada manualmente por el tumor en estadio temprano y áreas de quistes llenos de sangre (óvalo rojo) y (f) el correspondiente espectro promediado desde el retorno de la inversión. (G) La imagen de TIC que muestra la región de interés (ROI) seleccionada para el sitio del tumor en estadio temprano solamente (óvalo rojo) y (f) el correspondiente espectro promediado desde el retorno de la inversión.
región de interés (ROI) espectros del tumor combinado en fase inicial y la región quiste lleno de sangre (figura 2E) y el tumor en estadio temprano por sí mismo (figura 2G) se extrae del cubo de datos utilizando una secuencia de comandos de MATLAB para la comparación a la imagen de componentes NMF correspondiente. Al seleccionar manualmente una ROI para una región específica de tejido, un espectro promediado se genera a partir de los espectros para cada píxel dentro de la región seleccionada. El segundo espectro NMF componente (Fig 2D) y el espectro de ROI (Fig 2F) comparten un alto grado de similitud, con todos los principales iones detectados en el espectro de ROI también presentes en el espectro de componente NMF, aunque con ligeras diferencias en las abundancias relativas . Las principales diferencias observadas entre la figura 2D y 2F surgen debido a NMF poniendo mayor énfasis en combinaciones de especies detectadas con mayor grado de variación de otras regiones de la imagen. Para confirmar que los picos principales identificados en la figura 2D y 2F son realmente presente en la región del tumor y no están simplemente asociados a las diferencias biológicas entre sangre y tejido sólido, un espectro de ROI del tumor en estadio temprano sin el quiste lleno de sangre es se muestra en la Fig 2H. El espectro de retorno de la inversión correspondiente contiene todos los picos presentes por encima del 5% abundancia relativa dentro de la figura 2D. Sin embargo, en la figura 2H estos mismos picos están presentes mucho más bajas abundancias relativas debido a los lípidos de membrana muy abundantes,
i
e
, PI.. (38: 4) a
m /z 885,54
. El método ROI proporciona una representación más exacta de todas las especies presentes en la región seleccionada; sin embargo, NMF puede aislar especies que distinguen entre las regiones, potencialmente ayudar en el descubrimiento de especies con abundancias relativamente bajas que pueden ser alterados. Este atributo es crítico para tratar de identificar progresión de la enfermedad a través del tejido sin la intervención del usuario supervisado para definir los límites entre el tejido enfermo y sano
.
Dividir el conjunto de datos en tres, cuatro y cinco componentes NMF (S1 y S2 higos, y Fig 3, respectivamente) segrega progresivamente las señales que son claramente asociados con la región del tumor /quiste del resto del tejido sano. Lo que emerge es una imagen que representa principalmente el ovario sano, una o más imágenes (dependiendo del número de componentes seleccionado) que presenta diferentes distribuciones de iones a lo largo del útero y ovario sano, y una imagen que muestra las especies elevadas en la región del tumor /quiste. Los espectros correspondiente a la imagen sana componente ovario (figura 3C) que actúa como la muestra de control de seudo para este experimento es dominado por el ion a
m /z 885,5436
con todos los otros iones observados en una abundancia relativa de 5% o menos. La factorización NMF progresiva de las señales que contribuyen al útero (Figura 3A, 3E y 3I) muestran una menor abundancia relativa de los iones a
m /z 885,5436
de la figura 3C. Además, se observa una mayor contribución relativa de otros iones en estos espectros, en particular los de la región de lípidos entre los
m /z 600-1000
de fosfatidiletanolaminas potenciales (PE;
m /z
716.5247, 722.5070, 746.5053, 766.5324 y 794.5395), fosfatidilserinas (PS;
m /z 788,5369
, 810.5229, 834.5229), fosfatidilgliceroles (PG;
m /z 747,5108
), y fosfatidilinositoles (PI;
m /z 833,5120
, 857.5111, 909.5489). [49]
de los cinco imágenes componentes NMF, la figura 3A exhibe la más alta intensidad en la región del tumor. Sin embargo, la figura 3A muestra también una correlación relativamente alta para el componente espectros NMF (Fig 3B) a lo largo de la mayor parte de la sección de tejido. Aunque los picos en la figura 3B se encuentra elevado en la región del tumor, no son necesariamente los biomarcadores ideales para diferenciar entre tumor y de los tejidos sanos. Esto es apoyado por la mayoría de los picos identificados en la figura 3B ser lípidos de membrana de células de mamíferos comunes que se sabe que ser elevado debido a un aumento de la tasa de la síntesis de lípidos en los tejidos cancerosos. [52] Por el contrario, la figura 3G muestra una mucho mayor relativa diferencia entre la región del tumor /quiste y el resto de la sección de tejido. Es cierto que las más altas intensidades y la mayoría de las más intensas píxeles se observan en el quiste, pero todavía hay un número significativo de pixeles con intensidades elevadas en la región del tumor. Como la imagen de componentes en la figura 3G muestra casi exclusivamente la región del tumor /quiste con contribuciones mínimas de otras áreas de tejido, este componente debe ser muy representativo de los cambios metabólicos en el microentorno del tumor. Los tres componentes del NMF restantes describen regiones presumiblemente no cancerosas del tejido (
i
.
e
., Ovario sano y la mayoría del útero). Por lo tanto, se espera que la imagen de componentes en la figura 3G para contener contribuciones mínimas de las especies químicas no específicos de la biología del cáncer, con el espectro correspondiente se muestra en la Fig 3H
.
El rendimiento de NMF como un algoritmo de segmentación sin supervisión aplicado a datos de MSI se evaluó mediante la comparación con un algoritmo de agrupamiento más típica, tal como K-means clustering. Los resultados de K-medias de segmentar el conjunto de datos de MSI en
k = 5
grupos se muestran en la figura S3. Cuatro de los cinco grupos de K-medias eran espacial y espectral muy similar a los resultados observados NMF en la figura 3, con el quiste lleno de sangre, ovario sano, y el tejido restante todo segmentados en grupos separados. Para el análisis de K-medias, uno de los grupos contenían grandes contribuciones de la señal de fondo química y por lo tanto ese clúster correlacionados espacialmente con la región fuera del tejido biológico. Segmentación de esta región de fondo no se observó en los resultados de NMF, en lugar del útero se divide en tres segmentos (en comparación con los dos con la agrupación K-medias). Es evidente que NMF es más adecuado para el análisis de datos MSI como NMF proporciona el grado de correlación de cada pixel a la aproximación espectral establecido para cada componente, mientras que K-medias sólo da una indicación binaria para cada pixels inclusión a ese grupo específico. Así, las imágenes NMF proporcionan un descriptor más informativo para los datos de MSI que K-means clustering.
Para ilustrar el poder selectivo de la NMF, iones detectados dentro del espectro de tumores en una gran cantidad de ≥ 5% con respecto al pico de base son