Extracto
La mortalidad en la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) es alta debido a la aparición de resistencia a la terapia que se traduce en las recurrencias locales y regionales que pueden tener su origen en células madre cancerosas resistentes (CSC) o células con un fenotipo de transición epitelio-mesenquimal (EMT). En el presente estudio, se investiga la posibilidad de utilizar la expresión en la superficie celular de CD44 y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ambos de los cuales han sido utilizados como marcadores de células madre, para identificar subpoblaciones dentro de las líneas celulares CECC que difieren con respecto al fenotipo y la sensibilidad del tratamiento. Tres subpoblaciones, que consta de CD44
alta /EGFR
baja, CD44
EGFR
pilas de gran altura y /CD44
bajos, respectivamente, fueron recogidos por la clasificación de células activadas por fluorescencia. El CD44
alta /EGFR
baja población mostró una morfología similar a la EMT en forma de huso, mientras que el CD44
baja población estaba dominado por las células en forma de adoquines. El CD44
alta /EGFR
baja población fue enriquecida con células en G0 /G1 y mostró una tasa de proliferación relativamente baja y una alta eficiencia en placas. Usando un sistema de PCR en tiempo real, 27 genes, de los cuales 14 estaban relacionados con un fenotipo EMT y dos con stemness, se comprobó que estaban expresadas diferencialmente en CD44
alta /EGFR
células bajas en comparación con CD44
células de baja. Por otra parte, CD44
alta /EGFR
baja células mostraron una baja sensibilidad a la radiación, cisplatino, cetuximab y gefitinib, y una alta sensibilidad al dasatinib en relación a su CD44
alta /EGFR
alto y CD44
homólogos bajas. En conclusión, nuestros resultados muestran que la combinación de CD44 (alto) y EGFR expresión (baja) de la superficie celular se puede utilizar para identificar una subpoblación resistente al tratamiento con un fenotipo EMT en líneas celulares HNSCC
Visto:. La Fleur L, CA Johansson, Roberg K (2012) un CD44
alta /EGFR
bajo subpoblación en cáncer de cabeza y cuello Líneas celulares Muestra una transición epitelio-mesenquimal fenotipo y la resistencia al tratamiento. PLoS ONE 7 (9): e44071. doi: 10.1371 /journal.pone.0044071
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Abril, 2012; Aceptado: August 1, 2012; Publicado: 25 Septiembre 2012
Copyright: © La Fleur et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación sueca Laryng, la Fundación de Signhild Engkvist, la Fundación de Åke Wiberg, la Sociedad sueca del cáncer (2008/552, 2010/545), el Consejo del Condado de Östergötland y los Fondos de investigación del hospital de la Universidad de Linköping. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello cáncer es un tumor maligno que a pesar de los avances en la terapia todavía se asocia con una mortalidad severa. La mortalidad sigue siendo elevada debido a la aparición de recidivas locales y regionales y el desarrollo de metástasis en los ganglios linfáticos y, en ocasiones, metástasis a distancia. El tratamiento estándar para pacientes cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) de cabeza y es la radioterapia, a menudo en combinación con la cirugía. Chemoradiotherapy ha convertido recientemente en parte del tratamiento de tumores avanzados, y cisplatino es el agente más común en combinación con radiación. En los últimos años, la inhibición del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de señalización mediante el uso de anticuerpos anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab y panitumumab) o inhibidores de la quinasa EGFR de tirosina (por ejemplo, gefitinib y erlotinib) ha emergido como una nueva estrategia de tratamiento; sin embargo, hasta el momento cetuximab es el único fármaco dirigido a EGFR aprobado para el tratamiento de HNSCC. Radio y /o resistencia a la quimioterapia y las recurrencias tumorales son problemas clínicos importantes en el manejo de HNSCCs y la necesidad de estrategias de tratamiento más eficaces es urgente [1].
CECC, entre otros cánceres epiteliales, es una gran heterogeneidad enfermedad [2], [3]. Se ha sabido durante mucho tiempo que hay subpoblaciones de células dentro de un tumor que difieren entre sí con respecto a la tumorigenicidad y potencial metastásico [4] - [6]. Los tumores recurrentes son a menudo resistente a la terapia y pueden tener su origen en las células madre cancerosas resistentes (CSC) o en células tumorales con un fenotipo de transición epitelio-mesenquimal (EMT). EMT es un proceso por el que las células epiteliales pierden su polaridad y célula-célula contacto y adquieren un fenotipo mesenquimal migratoria y se ha demostrado que la EMT podría promover propiedades de células madre. Además, la
in vitro
sensibilidad de líneas de células HNSCC a Anticancer agentes, incluyendo los inhibidores de EGFR y cisplatino, se ha demostrado ser influenciado por la expresión de genes asociados a EMT [7], [8]. En HNSCC [9], así como en muchos otros tipos de cáncer, por ejemplo, [10] del cerebro, próstata, pulmón, colon, páncreas, hígado, melanoma y tumores de la piel - [15], se ha informado de la presencia de células madre cancerosas. Prince et al mostraron que CD44 +, CD44-, pero no, las células aisladas a partir de muestras de HNSCC primarias podría dar lugar a tumores en ratones [16]. Una expresión de la superficie celular elevada de CD44 también se ha utilizado como un marcador de células madre cancerosas en las líneas celulares HNSCC [17], [18]. Recientemente se publicó que el EGFR no estaba presente en la superficie de los queratinocitos normales y cancerosas que satisfacen los criterios de las células madre, tales como la quiescencia, la capacidad de formación de esferas y la expresión de marcadores de células madre, mientras que los queratinocitos presentan EGFR tenía un fenotipo más diferenciado [19 ]. Esto sugiere que una expresión de la superficie celular baja EGFR puede ser utilizado como un marcador de células madre cancerosas en tumores epiteliales
.
La mayoría de tratamientos contra el cáncer tradicionales no tienen en cuenta la posibilidad de que existan subpoblaciones de células cancerosas y que éstas pueden experimentar variando sensibilidad hacia un tratamiento particular. De hecho, las células madre leucémicas se han demostrado ser más resistentes a los tratamientos citotóxicos estándar [20], [21] y las dos células madre glioblastoma y las células iniciadoras del cáncer de mama son más radioresistant [22], [23].
el presente estudio investiga la existencia y las propiedades de las subpoblaciones de células en tres líneas celulares de HNSCC, LK0827, LK0863 y LK0923. Sobre la base de la expresión de la superficie celular de CD44 y EGFR, se identificaron y se analizaron con respecto a las características de CSC y EMT, así como radio-, cisplatino, cetuximab, gefitinib y dasatinib (multi-BCR inhibidor /ABL y Src familia de la tirosina quinasa) tres poblaciones sensibilidad.
Materiales y Métodos
Ética declaración
biopsias tumorales HNSCC frescas se tomaron muestras de la colección del tumor (n 416, la junta nacional de salud y bienestar en Suecia) a el Departamento de ORL - Cirugía de Cabeza y cuello, hospital de la Universidad de Linköping (aprobado por el Consejo regional de Revisión ética de la Universidad de Linköping). Los cultivos utilizados en este estudio (LK0923, LK0827 y LK0863) se derivaron de esta colección y de acuerdo con el comité de ética. Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes involucrados en este estudio. Todos los análisis de los datos asociados a estos cultivos se realizó de forma anónima.
Células y condiciones de cultivo
Las líneas celulares CECC LK0923 (cáncer de laringe), LK0827 (cáncer de la lengua) y LK0863 (cáncer de laringe), eran establecido a partir de muestras tumorales HNSCC frescas en el Departamento de ORL - Cirugía de Cabeza y cuello, hospital de la Universidad de Linköping, como se describe anteriormente [24]. Inmediatamente después de la escisión, las muestras tumorales se sumergieron en Ca
2 + - y Mg
2 + exento de solución salina tamponada con fosfato (PBS-A). se lavó el tejido, picado en trozos de 1 a 2 mm y se colocaron en frascos de cultivo para la propagación. A partir de entonces, el medio de crecimiento (de queratinocitos-SFM; GIBCO, Invitrogen Corporation, Paisley, UK) suplementado con antibióticos (penicilina 50 UI /ml, estreptomicina 50 mg /ml), fungizona (0,25 g /ml) y suero bovino fetal al 20% (FBS ; todos de GIBCO) se añadió y los explantes tumorales se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 de aire humidificado. Los fibroblastos contaminantes los cultivos se eliminaron continuamente por tripsinización diferencial (0,25% de tripsina + 0,02% de EDTA [ácido etilendiamintetraacético]). culturas celulares establecidas se cultivaron en queratinocitos-SFM complementado con antibióticos y 1% de FBS, dado medios de cultivo fresco dos veces a la semana y se subcultivaron en la confluencia usando 0,25% de tripsina + 0,02% de EDTA con una relación de división semanal de aproximadamente 01:02. Las células fueron examinados periódicamente por la contaminación por micoplasmas mediante DAPI y /o el juego universal de detección de Mycoplasma (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Los cultivos en los pasajes 8 a 15 se utilizaron en los experimentos.
La citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Las células fueron separadas utilizando Accutase (PAA Laboratories, Pasching, Austria) y se sometieron para dirigir la tinción de inmunofluorescencia. Se incubaron las células en 10% de FBS en PBS-A a 4 ° C, se lavaron después en PBS-A con 1% de FBS y se incubaron con anticuerpos hacia CD44 (APC-CD44; Becton Dickinson, San José, CA, EE.UU.; 1:10 ) y EGFR (EGFR-PE; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.; 1:10) o anticuerpos de control de isotipo (APC IgG2b de ratón; Becton Dickinson e IgG2a de rata PE; eBioscience, San Diego, CA, EE.UU., respectivamente). Las células se lavaron, se suspendieron en PBS-A y se pasó a través de 50 micras filtros (Becton Dickinson). Las muestras fueron analizadas en un FACS Aria (Becton Dickinson, FACS Aria sistema de pedido especial) y células con alta CD44 y baja EGFR expresión en la superficie celular (CD44
alta /EGFR
baja), las células con alta expresión de ambos marcadores ( CD44
alta /EGFR
alto), se recogieron las células y con una baja expresión de superficie CD44 (CD44
bajo).
ensayo de proliferación y el tratamiento de sensibilidad
Inmediatamente después clasificación de células por FACS, las subpoblaciones se sembraron en placas de 12 pocillos. Después de 10 días de células de cultivo se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA), se tiñeron con cristal violeta (0,04% en 1% de etanol) y, posteriormente, solubilizado en 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS). La densidad óptica a 550 nm se midió utilizando un lector de placas Victor (EG & amp; G Wallac, Upplands Väsby, Suecia).
Para la determinación de la respuesta al tratamiento, las células fueron sembradas en placas de 12 pocillos y después de 24 h irradiado (4 Gy) con fotones 4MeV generados por un acelerador lineal (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA, EE.UU.) o expuestos a cisplatino (2 mg /ml, 1 h), cetuximab (Erbitux®; 30 nM, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), gefitinib (Iressa, 50 nM, AstraZeneca, Londres, Reino Unido) o dasatinib (Sprycel®, 10 nM, Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY, EE.UU.). Se evaluó el efecto de los tratamientos después de otros 9 días en cultivo utilizando el ensayo de cristal violeta se describe anteriormente.
análisis del ciclo celular
48 h después de la clasificación celular por FACS, las células de las tres subpoblaciones eran individual usando 0,25% de tripsina y 0,02% de EDTA, se lavaron y se resuspendieron en yoduro de propidio (PI) solución (0,4 mg /PI ml, 1 mg /citrato de sodio ml, /base 60 g ml Trizma, 1,7 mg /tetrahidrocloruro de espermina ml y 0,01% Nonidet P40; todos de Sigma). Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo y análisis del ciclo celular se realizó utilizando ModFit (Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.).
eficiencia en placas de ensayo
Inmediatamente después de la clasificación celular por FACS, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y después de 10 días de cultivo las células se fijaron en PFA al 4% y se tiñeron con cristal violeta (0,04% en etanol al 1%). El número de colonias que contienen al menos 32 células se contó en un microscopio de luz.
inmunofluorescencia tinción
El fenotipo epitelial se verificó mediante tinción de inmunofluorescencia de citoqueratinas como se describe anteriormente [25]. Las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas en 4% PFA, se incubaron con 0,1% de saponina y de suero de ternera fetal al 5% en PBS-A seguido de incubación en un anticuerpo primario hacia pan-citoqueratina (1:50; Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, Reino Unido) en 0,1% de saponina y de suero de ternera fetal al 5% en PBS-a durante la noche. Como anticuerpo secundario un anticuerpo de cabra anti-ratón AlexaFluor 488 anticuerpo conjugado (1:400; Invitrogen, Paisley, Reino Unido; Molecular Probes) fue usado. Las células fueron montadas en medio Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y se examinaron en un microscopio de fluorescencia Olympus Vanox AHBS3. Las imágenes fueron recolectados a través de una cámara Olympus DP50.
Custom RT
2 Profiler ™ PCR matriz
Se analizó la expresión de 87 genes asociados principalmente con la EMT, stemness, y la apoptosis utilizando una costumbre -hecha matriz placa de PCR a partir de SABiosciences (Frederick, MD, EE.UU.). La reacción PCR se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.
ARN total fue extraído con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Solna, Suecia) y el ADNc fue adquirido usando el RT
2 Primera Strand Kit (SABiosciences) . la contaminación de ADN y ARN se evaluó mediante un control de ADN genómico y un control positivo de PCR, respectivamente. El promedio de cinco genes de limpieza (beta-2-microglobulina [B2M], hipoxantina phosphribosyltransferase [HPRT1], proteína ribosomal L13a [RPL13A], gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa [GAPDH], y beta-actina 1 [ACTB]) se utilizó para normalizar los valores de Ct. Los datos se calculan utilizando el método comparativo Ct para presentar los datos como una diferencia de pliegue en el nivel de expresión en relación con una muestra de control [26].
Quantitative PCR en tiempo real (qPCR)
ARN total se extrajo con el Mini Kit RNeasy (Qiagen, Solna, Suecia) o de alta Kit Aislamiento de ARN Pure (Roche, Mannheim, Alemania), y el ADNc se obtuvo utilizando la alta capacidad de RNA a cDNA Kit (Applied Biosystems, Estocolmo, Suecia). La expresión de mRNA CDH1, CDH2, NANOG, SOX1, TWIST1, FOXC2, FN1 y MMP7 se analizó utilizando un rápido sistema de PCR en tiempo real 7 500 y FAM /sondas MGB (Applied Biosystems). Todas las reacciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. GAPDH fue amplificado como un estándar interno y los datos se calcularon utilizando el método comparativo Ct.
Análisis de transferencia Western
Las alícuotas de 50 g de proteína se sometieron a análisis de transferencia de Western como se describe en otro lugar [27] . Los anticuerpos utilizados fueron: anti-ratón NANOG (1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-SOX1 ratón (1:10000; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), anti-ratón vimentina (1:200; Santa Cruz), de conejo anti-N-cadherina (1:1000; Abcam), de conejo anti-fibronectin1 (1:200; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.), de ratón anti-CD44 ( 1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA, EE.UU.) y de conejo anti-EGFR (1:1000; Santa Cruz) seguido de un HRP (peroxidasa de rábano picante) anticuerpo anti-conejo de cabra conjugada (1:1500; Santa Cruz) o un anticuerpo de cabra HRP conjugado anti-ratón (1:1500; Santa Cruz). La igualdad de carga fue verificada por reprobing las membranas con un anticuerpo conjugado con HRP anti-actina (1:2000; Santa Cruz).
El análisis estadístico
Los datos se evaluaron estadísticamente mediante ANOVA de una vía seguida mediante la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. El nivel de significación se fijó en p = 0.05.
Resultados
Identificación de las subpoblaciones de células en líneas celulares HNSCC
Con el fin de identificar las subpoblaciones con diferentes fenotipos, la superficie expresión de CD44 se investigó en tres líneas celulares HNSCC (LK0923, LK0827 y LK0863) por citometría de flujo. En las líneas celulares LK0923 y LK0827, dos subgrupos distintos de células, que tienen ya sea alta o baja expresión de la superficie celular CD44, fueron identificados; sin embargo, no hay tales poblaciones se pudieron observar en la línea celular LK0863 (Figura 1A). El CD44
baja subgrupo fue más abundante en comparación con el CD44
alta subgrupo (72,3% ± 9,1 vs 23,6 ± 9,2% en LK0923; 68,9% ± 9,6 vs 27,6 ± 9,3 en LK0827).
análisis gráfico de puntos de células LK0923, LK0827 y LK0863 co-tiñó con un anticuerpo APC conjugado con anti-CD44 y un anticuerpo conjugado con PE receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR). Las áreas de color rojo representan los CD44
pilas de gran, y los tres cuadros muestran la compuerta de las diferentes subpoblaciones de las cuales se aislaron las células para experimentos adicionales. B: La luz imágenes de microscopio de CD44
baja, CD44
alta EGFR
alto y CD44
EGFR
poblaciones altas /bajas (3 días después de la clasificación) y LK0923 sin clasificar, celular /LK0827 y LK0863 culturas.
a medida que la falta de expresión en la superficie celular de EGFR se ha asociado con stemness [19], las células fueron co-tiñeron con anticuerpos anti-EGFR anti-CD44 y CD44 después de lo cual el
alto y CD44
bajas poblaciones se analizaron con respecto a su expresión de EGFR. Curiosamente, una parte de la LK0923 y LK0827 CD44
alta población mostró una expresión de EGFR menor en comparación con las células en el CD44
baja población (Figura 1A). Por lo tanto, el CD44
alta subpoblaciones se dividió en dos grupos, en función de su expresión de EGFR, lo que resulta en tres subpoblaciones; CD44
baja, CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
baja. Estas subpoblaciones, definidos por el gating en la Figura 1A, se recogieron por FACS para el análisis adicional. La proporción de cada población ordenados en cada línea celular se describe en la Tabla S1. En las líneas celulares LK0923 y LK0827, las tres poblaciones diferían el uno del otro con respecto a la morfología celular (Figura 1B). Mientras que las células de la CD44
alta /EGFR
población de bajos mostraron una morfología similar a la EMT en forma de huso, el CD44
baja población estaba dominado por las células en forma de adoquines. En consecuencia, el CD44
alta /EGFR
alta población contenía tanto células en forma de huso y cobblestone-. En la línea celular LK0863, en el que no hay poblaciones distintas se observó basan en la expresión de superficie CD44, las células de la CD44
baja, CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
poblaciones bajas no fueron diferentes entre sí morfológicamente (Figura 1B).
Caracterización de la CD44
baja, CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
subpoblaciones bajas
Para caracterizar mejor las poblaciones clasificadas de la línea celular LK0923, que mostró el mayor distinta CD44
de población, se utilizó. La expresión total de EGFR y CD44 de los tres subgrupos se analizó por transferencia de western. CD44
alta /EGFR
baja células tenían una muy baja expresión de EGFR totales en comparación con los otros dos subgrupos y en el CD44
baja población no se detectó expresión de CD44 (Figura 2A).
a: Expresión de CD44 y del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en subpoblaciones ordenados (β-actina se utilizó como control de carga). B: tasa de proliferación de las subpoblaciones. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos por triplicado, * p = 0.05. Comparación de la distribución del ciclo celular entre CD44
baja y CD44
células baja alta /EGFR
: C. Se muestran datos de un experimento representativo de dos. D: Plating eficiencia, según la evaluación de la formación de colonias en subpoblaciones ordenados. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos por duplicado, * p = 0.05.
Para estudiar el fenotipo epitelial de las poblaciones clasificadas se realizó una tinción de inmunofluorescencia de pan-citoqueratina. Este análisis mostró una coloración más intensa que los
baja células CD44 en comparación con los dos CD44
altas poblaciones seis días después del aislamiento, pero después de 30 días adicionales en cultivo la diferencia no era tan prominente, lo que indica que los dos más poblaciones EMT-como cambiaron en células con un fenotipo más epitelial con el tiempo (Figura S1).
Además, las poblaciones clasificadas se cultivaron durante 30 días y posteriormente se analizaron con respecto a la heterogeneidad de la cultura. Culturas procedentes de la CD44
alta /EGFR
alta población consistió en 51% de CD44
CD44
pilas de gran bajos y el 42%, mientras que el CD44
alta /EGFR
baja población consistía 10% CD44
baja y el 82% CD44
pilas de gran. Por el contrario, el CD44
baja población contenía sólo CD44
células de baja 30 días después de la clasificación. Tomados en conjunto, tanto el CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
bajas poblaciones tenían la capacidad para recapitular la heterogeneidad de la cultura, pero en un grado variable.
a continuación, la tasa de proliferación y el ciclo celular distribución de las tres subpoblaciones se investigaron. Se encontró que las células de la CD44
alta población de tener una tasa de proliferación menor en comparación con CD44
baja células (Figura 2B). Además, hubo un mayor número de células en la fase G0 /G1 en el CD44
alta EGFR
Población /baja en comparación con el CD44
población de bajos (60% y 40%, respectivamente; Figura 2C ).
Para evaluar la eficiencia de plaqueo de las tres subpoblaciones investigadas las células se sembraron a baja densidad y después de 10 días se determinó el número de colonias formadas. El CD44
baja población mostró una significativa menor eficiencia en placas en comparación con las otras dos subpoblaciones (Figura 2D).
En su conjunto, el CD44
alta /EGFR
baja población se compone de más células en G0 /G1, lo que resulta en una menor tasa de proliferación, pero tiene una mayor eficiencia en placas y probablemente un potencial clonogénico superior.
El CD44
alta /EGFR
baja población muestra la regulación positiva de EMT- genes asociados
con el fin de detectar diferencias entre subpoblaciones clasificadas dentro de la línea celular LK0923 la expresión de una selección de genes implicados en la troncalidad, EMT y la apoptosis se investigó el uso de una matriz de PCR en tiempo real. Para analizar las diferencias entre los subgrupos se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico (TIGR Multiexperiment visor 4) que revelaron diferencias en 28 genes (Figura S2). Se encontró que la mayor diferencia en la expresión génica entre el CD44
alta /EGFR
baja y los CD44
subpoblaciones bajos, mientras que el CD44
alta /EGFR
pilas de gran, en concordancia con las características morfológicas análisis, mostró similitudes con ambos de los otros dos subgrupos. Al comparar el CD44
alta /EGFR
baja población a la CD44
población de bajos, las diferencias en el nivel de ARNm se pudieron observar en 27 genes, de los cuales 20 fueron upregulated y downregulated 7 (Tabla 1). De estos 27 genes expresados diferencialmente 14 pueden estar relacionados con un fenotipo EMT (VIM, MMP2, MMP7, TIMP1, TWIST1, COL3A1, CDH1, CDH2, ITGA5, FN1, FOXC2, WNT5A, WNT5B y SPARC). Curiosamente, CD44
alta /EGFR
baja células también mostraron una regulación al alza de dos genes de células madre, NANOG y SOX1.
El tiempo real de datos de la matriz de PCR se verificó mediante el análisis del ARNm expresión de CDH1 (e-cadherina), CDH2 (N-cadherina), VIM (vimentina), FN1 (fibronectina 1), TWIST1, FOXC2 y MMP7 por qPCR (Figura 3A). El nivel de expresión de ARNm de los factores antes mencionados también se determinó en LK0827 y LK0863 poblaciones. De manera similar a lo que se encontró en LK0923, el CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
bajas poblaciones de la línea celular LK0827 mostraron un fenotipo distinto EMT (Figura 3B). Por otra parte, en la línea celular LK0863 no se observaron diferencias en la expresión de mRNA entre las poblaciones según (Figura 3C). Por otra parte, la diferencia en la expresión de N-cadherina, vimentina y fibronectina 1 se verificó a nivel de proteínas en LK0923 por Western blot (Figura 3D)
A-C:. Relativa de los niveles de expresión de ARNm de epitelio-mesenquimal genes asociados con la transición; E-cadherina, N-cadherina, vimentina, fibronectin1, TWIST1, FOXC2 y metaloproteinasa de matriz 7 (MMP7) en (A) LK0923, (B) LK0827 y (C) LK0863 subpoblaciones. Los niveles de expresión de la CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
poblaciones bajas se muestran aquí como veces de diferencia con respecto a la CD44
baja población (GAPDH se utilizó como una patrón interno). D: Western blot de N-cadherina, vimentina y fibronectin1 en LK0923 poblaciones (β-actina se utilizó como control de carga) guía empresas
La regulación al alza de la CSC marcadores NANOG (LK0923) y SOX1 (LK0923. y LK0827) en CD44
alta EGFR
baja células se confirmó en el ARNm (Figura 4), pero no pudieron ser verificados a nivel de proteínas (datos no mostrados).
ARNm /relativa los niveles de expresión de los genes stemness NANOG y SOX1 en LK0923, LK0827 y LK0863 subpoblaciones, aquí muestran como veces de diferencia con respecto a la CD44
población bajo (GAPDH se utilizó como estándar interno).
subpoblaciones según muestran diferencias en la sensibilidad de tratamiento
para evaluar si existen diferencias en la sensibilidad de trato entre los tres subpoblaciones, las células clasificadas se exponen a radiaciones ionizantes γ-irradiación (4 Gy), cisplatino (2 mg /ml, 1 h) , cetuximab (30 nM), gefitinib (50 nM) o dasatinib (10 nM).
El LK0923 CD44
alta /EGFR
baja células demostrado ser altamente resistentes al tratamiento con cisplatino en comparación con tanto CD44
baja y CD44
EGFR
pilas de gran /altas (Figura 5A). El CD44
alta /EGFR
baja población de células LK0827 y LK0923 muestra una resistencia significativamente mayor frente a la radioterapia en comparación con las otras dos subpoblaciones mientras que en LK0863 no se encontraron diferencias (Figuras 5A, 5B y 5C). Por otra parte, cuando se añadió cetuximab a CD44
/EGFR
células bajos altos de LK0827 y LK0923 resultaron ser resistentes. En LK0923 no se observaron diferencias entre subpoblaciones después de la exposición a gefitinib, pero en el LK0827 CD44
baja células fueron significativamente más sensibles a gefitinib en comparación con CD44
células baja alta /EGFR
.
sensibilidad tratamiento de CD44
baja, CD44
alta /EGFR
alto y CD44
alta /EGFR
baja células, aisladas a partir de (A) LK0923, (B) LK0827 o (C) LK0863 , y expuesto a la radiación (4 Gy), cisplatino (2 mg /ml, 1 h), cetuximab (30 nM), gefitinib (50 nM) o dasatinib (10 nM). Los datos representan la media ± SD de tres experimentos por triplicado, * p = 0.05.
En su conjunto, en general, el LK0827 y LK0923 CD44
alta /EGFR
baja células mostró una baja sensibilidad a la radiación, cisplatino, cetuximab y gefitinib en relación con su CD44
alta /EGFR
alto y CD44
bajos homólogos (Figura 5A y 5B). Por otro lado, se encontró que eran más sensibles al tratamiento con la tirosina quinasa de la familia dasatinib inhibidor multi-BCR /ABL y Src.
Discusión
En el presente estudio se investigó la posibilidad de la utilización de la expresión superficial de EGFR y CD44 para encontrar las poblaciones de células dentro de las líneas celulares HNSCC que difieren unos de otros con respecto a fenotipo y el tratamiento de sensibilidad. Tres poblaciones, que consta de CD44
baja, CD44
EGFR
EGFR
pilas de gran altura y /CD44
alto /bajo, respectivamente, fueron analizados después de la clasificación celular por FACS. El CD44
alta /EGFR
población baja alberga un mayor número de células en G0 /G1, muestra una tasa de proliferación más baja y una mayor eficiencia en placas en comparación con el CD44
alta /EGFR
alto y CD44
poblaciones bajas. De acuerdo con estos resultados, Le Roy et al mostraron una conexión entre el destino normal y queratinocitos cáncer y la distribución asimétrica de EGFR durante la mitosis. Por otra parte, se identificaron tres poblaciones en cultivos normales y queratinocitos del cáncer: una pequeña pero constante de la piscina de Rh123
- (rodamina 123, un marcador de lado la población) y EGFR
- células en reposo, un pequeño pero variables en tamaño entre culturas normales y células de cáncer de piscina Rh123
- /EGFR
+ (células madre tal vez activadas), y una tercera piscina principal de Rh123
+ /EGFR
+ células amplificadoras transitorias. El Rh123
- /EGFR
-. De cultivo consistió en más células en G0 /G1 y células con mayor capacidad de clonogénico [19]
En dos de cada tres líneas celulares investigadas, CD44
/EGFR
células bajo altas muestran un fenotipo distinto EMT-como con morfología en forma de huso, así como la regulación positiva de los marcadores de EMT. Sin embargo, no aparente fenotipo CSC se puede observar en estas células. Estos resultados sugieren que la expresión superficial de CD44 (alto) y EGFR (bajo) identificar una población de células con un fenotipo EMT. Esta población está enriquecida con células madre cancerosas; Sin embargo, se requieren marcadores adicionales para la selección específica de células madre cancerosas.
Recientemente, Biddle
et al
proporcionó evidencia de que dentro de los tumores HNSCC existen dos fenotipos distintos CSC, uno CD44
alta /específico epitelial antígeno (ESA)
alta y uno CD44
alta /ESA
baja [28]. El CD44
alta /ESA
baja población muestra un EMT-fenotipo y parece tener propiedades similares a la CD44
EGFR
población de alto /bajo se describe en este estudio. Ambas poblaciones CSC descritos por Biddle
et al
podría cambiar sus epiteliales o mesenquimales rasgos para reconstituir la heterogeneidad celular, pero el CD44
alta /ESA
baja población, en menor medida (contiene un 50% de las células bipotentes en comparación con las células bipotentes 100% en el CD44
alta /ESA
alta población). De acuerdo con sus resultados, 30 días después de su clasificación CD44
alta /EGFR
pilas de gran muestran una mayor capacidad para reconstituir la heterogeneidad celular en comparación con CD44
EGFR
células de alta /baja.
la conexión entre células madre cancerosas y EMT ha hecho más evidente en el último par de años. En 2008, Mani et al describieron que la inducción de la EMT en las células epiteliales mamarias dado lugar a células que ganan propiedades de células madre [29], un fenómeno que también se observa en las células de cáncer de páncreas [30]. En HNSCC se ha demostrado que las células obtenidas de cultivos de esferoides, lo que demuestra propiedades de células madre, también tenía un fenotipo de EMT con vimentina elevada y niveles de actina del músculo liso alfa-[31].
La importancia de EMT en el tratamiento resistencia ha sido recientemente específica para la investigación en diferentes tipos de cáncer [32]. Tanto en cáncer de páncreas y HNSCC se ha demostrado que las células con un fenotipo EMT son más resistentes al tratamiento con cisplatino [7], [33], y se observó el mismo patrón cuando el estudio de la respuesta a la radiación [34], [35] y cetuximab [35]. Las subpoblaciones dentro de las líneas celulares LK0923 y LK0827 difieren con respecto a la respuesta al tratamiento. Los CD44
alta /EGFR
baja células muestran una sensibilidad significativamente inferior al cisplatino (LK0923) y radioterapia (LK0923 y LK0827) en comparación con el CD44
baja y CD44
alta /EGFR
pilas de gran. En uno de nuestros estudios anteriores, en los que radioresistant y líneas celulares radiosensibles HNSCC se compararon mediante análisis de microarrays, muchos de los genes reguladores clave identificadas se asociaron con la EMT [36]. Uno de estos reguladores clave, FN1, se upregulated significativamente en las células tumorales radiorresistentes tanto en el nivel de ARNm y proteína. En un estudio similar, la comparación de las líneas de células resistentes y HNSCC sensible cisplatino cisplatino, MMP7 se demostró que era un biomarcador para la resistencia a cisplatino [37]. De acuerdo con estos datos, el CD44 resistentes
alta /EGFR
baja población de tratamiento dentro de las líneas celulares LK0923 y LK0827 mostró niveles tanto de FN1 y MMP-7 aumentó. Una conexión entre EMT y la regulación positiva de la MMP-7 expresión se ha descrito anteriormente.