Drogas
Extracto
próstata células epiteliales de ambos tejidos normales y cancerosas, cultivadas en tres dimensiones (3D) la cultura como esferoides, representan
in vitro y modelos prometedores en para el estudio de los patrones normales y cancerosas relevantes para la diferenciación del epitelio. Hemos desarrollado el panel más amplio de modelos de cultivos celulares de próstata miniaturizados en 3D hasta la fecha (n = 29), incluyendo muchas líneas celulares de cáncer no transformada y más disponibles en la actualidad clásica de próstata (AEP). El propósito de este estudio fue analizar las propiedades morfogenéticas de modelos PrcA en 3D, para comparar la expresión de genes, fenotipos y el metabolismo entre las culturas en 2D y 3D, y para evaluar su relevancia para el descubrimiento de fármacos pre-clínica, modelado de la enfermedad y la investigación básica. esferoides circulares primarias y células epiteliales prostáticas no transformadas, sino también varias líneas de PRCA, formadas bien diferenciado. Estos mostraron contactos célula-célula epitelial fuertes, la polarización, un lumen hueco y estaban cubiertos por una lámina basal completa (BL). La mayoría de las líneas de PRCA, sin embargo, forman esferoides grandes, poco diferenciados, o estructuras que invaden agresivamente. En las células PC-3M PC-3 y, esferoides formados, que luego se transformaron de forma espontánea en las células altamente invasivos bien diferenciado. Estas líneas celulares pueden haber sido sometidos previamente a un epitelio-a-mesenquimal transición (EMT), el cual se suprime temporalmente en favor de la maduración epitelial por las señales de la matriz extracelular (ECM). La inducción de lípidos y metabolismo de los esteroides, reprogramación epigenética, y la remodelación de ECM representa una adaptación general a la cultura 3D, independientemente de la transformación y el fenotipo. Por el contrario, PI3-quinasa, AKT, STAT /interferón y vías de señalización de la integrina se activaron en particular en las células invasoras. inhibidores de moléculas pequeñas específicas dirigidas contra PI3-quinasa bloquean el crecimiento invasivo de células de manera más eficaz en 3D que en 2D cultivo monocapa, o el crecimiento de las células normales. Nuestro panel de modelos celulares, que abarca un amplio espectro de plasticidad fenotípica, apoya la investigación de los diferentes modos de la migración celular y tumorales morfologías, y será útil para las pruebas de predicción de anti-cáncer y compuestos anti-metastáticos
.
cita: Härmä V, J Virtanen, Mäkelä R, Happonen A, JP Mpindi, Knuuttila M, et al. (2010) Un panel amplio de modelos tridimensionales para los estudios del crecimiento del cáncer de próstata, Invasión y las respuestas de drogas. PLoS ONE 5 (5): e10431. doi: 10.1371 /journal.pone.0010431
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Enero, 2010; Aceptado: March 31, 2010; Publicado: 3 Mayo 2010
Derechos de Autor © 2010 Härmä et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la Academia finlandesa de MN (Nº 111597). Los fondos adicionales a OK y JV fue proporcionado por 6PM y 7PM proyectos integrados y PRIMA Epitron de la Comisión Europea. Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
bidimensional cultivos celulares (2D) monocapa representan modelos altamente reduccionista de células epiteliales y cánceres epiteliales, debido a la pérdida de la matriz fisiológica extracelular (ECM) en las superficies plásticas artificiales, y altas concentraciones séricas. En consecuencia, las células pierden propiedades relevantes, como la diferenciación, la polarización, la comunicación entre células y los contactos de la matriz extracelular, mientras que la cicatrización de heridas, procesos inflamatorios, y la hiper-proliferación se promueven artificialmente. En cultivo en monocapa de cáncer de próstata (AEP) líneas, la homeostasis de las células madre tumorales indiferenciadas a través basal, tránsito-amplificación y, células luminales sensibles a las hormonas terminalmente diferenciadas depende de condiciones de cultivo celular, calcio y concentración en suero [1], [2] , y sólo mal representa la biología de las células tumorales in vivo. La falta de una lámina correspondiente basal (BL), la deposición de ECM defectuoso, y del estroma falta o componentes mioepiteliales [3] contribuyen aún más a la naturaleza artificial. Como resultado, los inhibidores de moléculas pequeñas más eficaces en cultivos monocapa son fármacos quimioterapéuticos que se dirigen a la proliferación y la mitosis. Este desequilibrio contribuye a la pobre valor predictivo de eficacias entre compuestos
in vitro y Hoteles en
in vivo
experimentos. La acción del fármaco que se refiere a la interacción célula-célula, la maduración, transición epitelio mesénquima (EMT) y las células madre del cáncer (CSC) es probable que no se detectan. Tanto la arquitectura 3D y el ECM ejercen importantes efectos sobre la eficacia de los medicamentos [4]. las células cancerosas epiteliales glandulares adaptarse rápidamente a los diferentes microambientes y pueden cambiar dinámicamente entre las vías alternativas que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia.
El desarrollo de resistencia a los medicamentos o la falta de respuesta a los fármacos quimioterapéuticos también requiere modelos de cultivos celulares apropiados. resistencia a los medicamentos a menudo se atribuye a la hipótesis de las células madre del cáncer (CSC): cáncer de las drogas anti-mitótico sobra la proliferación lenta, las células progenitoras o stem--regeneración tumorales [5] - [7], que finalmente re-constituyen la masa tumoral. Esto puede ser concomitante con EMT [7] - [10] y el aumento de potencial metastásico [8]. La búsqueda de fármacos contra el cáncer ha entrado así una nueva etapa en la que los investigadores utilizan cada vez más sistemas modelo organotípicos para explorar más directamente dianas de medicamentos en organoides multicelulares, a menudo enriquecida para las células madre [11]. Apropiada
in vitro
modelos experimentales adecuados para el análisis de la homeostasis del CSC, EMT, invasión y metástasis, se están convirtiendo cada vez más relevante para el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Estos también deben ser rentables y proporcionan suficiente rendimiento para la selección de alto contenido.
La cultura del epitelio glandular (cáncer) en células ECM purificada, como el colágeno, hidrogeles o Matrigel, se estableció hace más de dos décadas [12 ]. Matrigel representa un reconstituido, membrana basal laminina-rico, que apoya los procesos tales como la polaridad celular, celular por células y la interacción célula-matriz, y re-expresión de marcadores de diferenciación incluso en líneas transformadas [13]. células mamarias y epiteliales de próstata forman esferoides, que se refiere como mammospheres [14] o prostaspheres [15], respectivamente. las células epiteliales normales de la próstata se diferencian en esferoides huecos así polarizadas, una característica de las células epiteliales funcionales, glandulares. El mismo microambiente también es compatible con la migración celular, la ramificación y la formación de acinos característica [16], [17]. En contraste, las células tumorales suelen mostrar un programa de diferenciación defectuosa, y forman esferoides atípicas con la arquitectura desorganizada, como se ha demostrado más prominente de los cánceres de mama [18] - [20]. los patrones de expresión génica de los esferoides se demostraron estar en correlación con los fenotipos característicos formados en 3D culturas [19], [20] y la diferenciación global y el potencial agresivo de los cánceres [21], [22]. Similares a las células epiteliales normales, las células PRCA también pueden invadir activamente el matrigel circundante, aunque su modo de migración es diferente de los patrones de migración de hoja o tubo normales, colectivos observados en la ramificación de las células normales. El fenotipo de la invasión del cáncer depende de la composición y densidad de la ECM, y puede variar de formación de ampollas en ameboide, la motilidad mesenquimales similar a fibroblastos y transmisión multicelular o migración en cadena [23], [24]. Naturalmente, el potencial invasivo también depende de los antecedentes genéticos de las células PRCA y su capacidad de (por lo general comprometida) para participar en estrictas contactos célula-célula epiteliales. Mamaria y otras células epiteliales de cáncer de forma cilíndrica, células de husillo como con el potencial de contraerse y alargarse, apoyar la migración a través de la malla ECM circundante. Mucho menos se sabe acerca de la AEP. Invasion es asistido por procesos proteolíticos y proteasas tales como catepsinas [25], metaloproteinasas de la matriz (MMPs [24]), factores solubles secretados por los fibroblastos o la presencia de fibroblastos sí mismos [26], [27], y otros factores tales como la fibronectina y oxidasas lisilo [26]. En este sentido, los modelos 3D de la invasión de células tumorales [28] representan la dinámica celular y la arquitectura de los tumores mucho mejor que los cultivos en monocapa en 2D en el que las células se propagan y se deslizan por la superficie de plástico. El potencial de experimentar un EMT y adquirir modos de migración mesenquimales es otro parámetro postulado para contribuir a la invasión de mama y PRCA y la motilidad [29].
Además, no está claro si esferoides PRCA, sobre todo si se cultivan en lrECM , espectáculo de enriquecimiento de poblaciones CSC (que a menudo se asocia con un EMT), o desarrollar resistencia a los agentes quimioterapéuticos y radiaciones ionizantes [30], [31]. Al menos, se esperaría que la participación de la CSC de EMT o para mostrar una dinámica muy diferente en la diferenciación de las culturas 3D en LrECM, en comparación con prostaspheres flotantes y condiciones monocapa 2D [32]. Durante todo ello, modelos de cultivo celular para la invasión de células tumorales están actualmente restringidos a unos pocos, ensayos potencialmente artificiales ampliamente utilizados (transwell ensayos de invasión; ensayos de migración a los arañazos de la herida). Desde la invasión es fundamentalmente diferente en condiciones 3D, los modelos 3D de invasión representativos representan una verdadera novedad [26, 28, y 33].
Se presenta aquí el desarrollo y caracterización morfológica de los sistemas de cultivo celular modelo 3D miniaturizados, utilizando un panel de líneas celulares de próstata 29. Una selección de las líneas más representativas fueron luego caracteriza además por todo el genoma análisis del transcriptoma y la biología de sistemas para identificar las vías principales, las moléculas de señalización, redes de genes, y los objetivos de fármacos putativos críticos para el crecimiento y la invasión de las células malignas APCR. Además, las herramientas bioinformáticas de análisis de imágenes para cuantificar características fenotípicas dinámicos como estructuras invasoras, la forma esferoidal o las respuestas de drogas se han desarrollado.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivos monocapa
las líneas celulares se adquirieron de ATCC o solicitarse a los laboratorios originales (Tabla S1). células epiteliales normales y derivados (PrEC, EP156T, RWPE-1, RWPE-2, RWPE-2 /W99, WPE1-NB14, PWR-1E, PZ-HPV-7 y CA-HPV-10) se cultivaron en queratinocitos Serum- libre Medio (KSFM, Gibco), suplementado con 12,5 mg /l de extracto de pituitaria bovina y 1,25 g /l EGF. Para los cultivos en 3D, se añadieron 2% de suero fetal bovino (FBS, Gibco). La mayoría de líneas PRCA se cultivaron en RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), complementado con 10% de FBS. células MDA-PCa-2b y NCI-H660 se cultivaron en medio F12 de Ham (Gibco) con 20% de FBS, 25 ng /ml choleratoxin, 10 ng /ml EGF, fosfoetanolamina 5 M, 0,1 ng /ml de hidrocortisona, 45 nM de ácido selénico y 5 mg /ml de insulina (todos de Sigma). Todas las células se propagan a 37 ° C en condiciones de cultivo celular estándar (5% de CO2, 95% de humedad). Identidad de líneas de células fue confirmada por arrayCGH (hibridación genómica comparada) en Agilent 244 k matrices genoma humano, después de 10-15 pasajes se suspendieron las células.
culturas miniaturizada 3D.
Las células fueron incrustadas entre dos capas de Matrigel en la angiogénesis sin recubrimiento mu-slides (ibidi GmbH, Alemania): parte inferior de pozos se llenaron con 10 l de Matrigel medio /cultura (01:01; 50%) y se polimerizan a 37 ° C durante 30 minutos. Las células fueron sembradas a 20.000 células /ml de densidad (aproximadamente 1000 células /pocillo). Después de la unión (1-2 horas a 37 ° C), las células se cubren con una segunda capa de Matrigel medio /cultivo (01:04, 25%), se dejó polimerizar durante la noche a 37 ° C. Medio de cultivo celular se cambió cada dos días.
3D cultivos a granel para la extracción de RNA.
Prostaspheres se cultivaron en cultivo celular colgando Millicell inserta con 1,0 micras membranas transparentes de PET (Millipore) de 6 pocillos placas (Costar). Las membranas se pre-recubiertas con Matrigel /medio (1:01) y se incubaron a 37 ° C durante 1 h, para impedir la adhesión a la membrana. La suspensión celular se mezcló con Matrigel 01:04, se transfirió a la pocillo recubierto, y se polimeriza durante la noche a 37 ° C. Las células se alimentaron cada dos días con medio fresco desde abajo.
fijación de la célula, el etiquetado de inmunofluorescencia y de imagen.
culturas miniaturizada 3D se fija dentro de micropocillos, utilizando paraformaldehído al 4%, suplementado con 0,8% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), EGTA 5 mM y 1 mM de MgCl
2 durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. cultivos fijados se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon durante 1 h con suero de caballo al 20%. Los cultivos se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (listados en la Tabla S2), se lavó con PBS, y se incubaron a temperatura ambiente durante 4 h con anticuerpos secundarios y Hoechst tinción nuclear (1:5000).
3D estructuras fueron teñidas con calceína AM tinte de células vivas (Invitrogen). imágenes tridimensionales confocal se tomaron utilizando Zeiss Axiovert 200 M y un disco giratorio confocal Yokogawa CSU22 y un Zeiss Plan-Neofluar 5 × objetivo. Z-pilas fueron adquiridas con un paso de tamaño de 19 micras. proyecciones de intensidad fueron creados por SlideBook 4.2.0.7 y los NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), analizar más a fondo con el software VTT Acca (sensibilidad 10; umbral de 5, estructuras de menos de 500 píxeles en el área /tamaño filtran fuera). Los diagramas de caja se visualizaron con R. 20x contraste de fase imágenes de lapso de tiempo fueron adquiridos con Incucyte (instrumentos de Essen), pre-procesados con ImageJ y analizados con VTT Acca (sensibilidad 30; umbral de 5, estructuras de menos de 1000 píxeles en el área filtrados) .
extracción de RNA y microarrays.
3D cultivos a granel se lavaron con PBS helado, membranas escindidos con un escalpelo, y esferoides transferidas en placas de 6 pocillos. Los geles se mezclan vigorosamente con 9 ml de EDTA 5 mM en PBS, se transfirió a tubos de 15 ml Falcon, y se incubaron en un agitador de mesa durante 45 minutos para desprenderse del Matrigel. Prostaspheres se sedimentaron por centrifugación y se lisaron con tampón RLT (Qiagen). Las células propagadas en monocapa se lisaron a 90% de confluencia, directamente desde 10 cm placas de cultivo celular usando tampón RLT. El ARN total (de repeticiones biológica) se extrajo con RNeasy Mini kit (Qiagen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. 300 ng de ARN se amplificó con el kit de iluminación TotalPrep de amplificación del ARN de Ambion. IVT reacción se llevó a cabo durante la noche (aproximadamente 16 h) para producir suficiente biotina cRNA. las concentraciones de ARN y cRNA se midieron con un NanoDrop ND-1000, calidad general se controló con la estación de electroforesis Experion de BioRad. 750 ng cRNA se hibridó en Sentrix de Illumina HumanRef-8 v3 BeadChips, a 58 ° C durante la noche. Hibridado cRNA se detectó con 1 mg /ml Cyanine3-estreptavidina (GE Healthcare Biosciences), y matrices de escaneado con Illumina BeadArray Reader. Los datos se comprueban la calidad y extrajeron usando el software Illumina GenomeStudio, sin normalización o sustracción de fondo.
análisis de datos de microarrays.
microarrays de datos en bruto se cuantil normalizado, utilizando el Bioconductor R paquete "BeadArray". Los datos normalizados se procesaron utilizando un filtro de varianza y la intensidad. El análisis estadístico de la expresión diferencial de genes se realizó mediante los paquetes de R /Bioconductor limma y lumi. El umbral para la expresión diferencial fue q & lt; 0,05 después de una corrección de múltiples ensayos Benjamini-Hochberg. Illumina normalizados de datos de expresión génica de todo el panel de experimentos se han presentado a GEO (Gen Expression Omnibus) como GSE19426 estudio
Los datos fueron entonces utilizar de dos modos diferentes:. Para evaluar los cambios relativos de la expresión génica entre 2D y experimentos en 3D, o diferentes puntos de tiempo en cultivo 3D, significan valores normalizados en 3D se restaron de los valores medios de los distintos recipientes de cultivo en monocapa 2D y relaciones calculadas. Log (2) relaciones /3D 2D transformadas fueron luego utilizados para el agrupamiento y la generación de mapa de calor (Cluster 2.11 y 1.60 TreeView, la Universidad de Stanford), y el análisis de genes ontología (GO; DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-means clustering se utiliza para trazar mapas de calor representativos basados en datos de las razones 2D /3D, la generación de 12 nodos (100 iteraciones). El paquete de conjunto de genes Análisis (GSA) en R se utilizó para definir las categorías de genes enriquecidos significativamente, aquí las estadísticas "Maxmean" fue utilizado para calcular las puntuaciones de enriquecimiento, y los valores de p basado permutación se derivaron de 1000 repeticiones de arranque. Una corrección de la tasa de falso descubrimiento (FDR) se aplicó también como una medida de relevancia. conjuntos de genes utilizados para el análisis se obtuvieron de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB, Broad Institute), incluyendo posicional, barrio curada, la co-expresión, IR, y los objetivos de factor de transcripción evolutivamente conservados.
En segundo lugar, pero por lo demás normalizado ONU-procesados se utilizaron los datos de expresión de genes para definir firmas de genes que se correlacionan con las características fenotípicas (redondo /normales, la masa, el fenotipo estrellado). El análisis de componentes principales (PCA) y el trazado de los genes informativos que correlacionan con morfologías esferoides se lleva a cabo basándose en los guiones R especializados. Se seleccionaron genes que representan el mayor porcentaje de variación en función de ANOVA.
Ingenuity Pathway Analysis (IPA) y la selección compuesto.
grupos de genes expresados diferencialmente (proporciones 2D /3D) se cargaron en IPA para realizar análisis de genes de la red y la identificación de genes potencialmente informativos centrales "hub". pequeñas moléculas inhibidores específicos contra determinados genes hubs o concentradores y las vías fueron adquiridas de TOCRIS y Sigma-Aldrich (véase más adelante). Las fuentes adicionales e independientes de drogas /información de destino también se utilizaron para el mismo propósito (DrugBank; http://www.drugbank.ca; Matador http://matador.embl.de)
RT-PCR. validación.
2 mg de ARN total fueron transcritas inversa con transcriptasa inversa Invitrogen Superíndice II en 50 l. ADNc se diluyeron 1/10. QRT-PCR se realizó por triplicado con la secuencia de Fast 7900HT Sistema de Detección (Applied Biosystems) en formato de 384 pocillos placa de 96 pocillos o, 8 l /pocillo. cebadores y sondas de PCR se diseñaron basándose en la Biblioteca de la sonda Roche universal, los oligonucleótidos fueron ordenados de Sigma-Aldrich. Los cebadores se utilizaron a 300 nM, las sondas en una concentración de 100 nM; con Master Mix 2x TaqMan PCR Universal. carreras de PCR fueron analizados utilizando el software de Applied Biosystems SDS
microarrays de proteínas de lisado (LMA)
Prostaspheres se recogieron en los días 3, 6, 8, 10 y 14..; de acuerdo con el siguiente protocolo: los micropocillos se lavaron con PBS, Matrigel mezclado con EDTA 5 mM enfriado en hielo en PBS, se transfirió a placas de 96 pocillos de fondo en v (Greiner) y se incubaron en hielo en un tablero de la mesa-agitador durante 30 minutos. Esferas se sedimentaron por centrifugación y se lisaron en LMA-tampón (0,2% de SDS, 100 mM Tris, 10 mM de DTT). Las células en monocapa se cosecharon en LMA-tampón a 90% de confluencia en placas de 10 cm. Para cada punto de tiempo, dos repeticiones biológica se imprimieron en una sola matriz. Impresión, las manchas, la exploración, la sustracción del fondo, la normalización en relación con ß-actina señal y análisis de datos se realizó como se describió anteriormente [34].
Western Blot.
Las muestras de proteína a partir de pocillos de cultivo eran recogido tal como se describe a partir de placas de micropocillos, y se lisaron en WB-buffer (25 mM Hepes pH 7,5, NaCl 100 mM, 5 mM EDTA pH 8,3, 0,5% Triton X-100, 20 mM β-glicerofosfato, 100 mM de ortovanadato, PMSF 0,5 mM y DTT 1 mM). La concentración de proteína se midió por el ensayo de Bradford, y las proteínas separadas por SDS-PAGE con geles prefabricados de buscapersonas (Lonza), transferidos sobre membrana de transferencia de nitrocelulosa Protran (Whatman), y se transfirió con los anticuerpos primarios listados en la Tabla S3. múltiplex de incubación con tres anticuerpos se utilizó para dar cabida a la pequeña cantidad total de proteínas extraídas de las culturas miniaturizados. Los anticuerpos se detectaron con anticuerpos de Alexa infrarrojos tinte secundario conjugado (Invitrogen), y membranas escaneados con el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR).
Los tratamientos farmacológicos en 3D.
compuestos fueron ordenados de SIGMA o Tocris Inc., y se disolvió en el vehículo apropiado (DMSO, etanol, 1 x PBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. quimioquinas recombinantes humanos, citoquinas, anticuerpos y la función de bloqueo fueron ordenados a partir de R & amp; D Systems. Los fármacos se prepararon como soluciones madre 10 mM, almacenados a -20ºC. La mayoría de las quimioquinas y péptidos se diluyeron a 1 mg /l de soluciones madre. La dilución de las soluciones de trabajo se realizó inmediatamente antes del tratamiento. Se añadieron medicamentos después de un período de 4 días, durante el cual se desarrollan esferoides, y se mantuvieron durante un máximo de 7 días. Las concentraciones del fármaco fueron seleccionados de acuerdo a la mitad de la máxima concentración inhibitoria (IC50), conocido por la mayoría de los compuestos. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Esferoides se monitorizan en tiempo real por imágenes de células vivas (Incucyte, Essen Instrumentos; objetivo de 10x), la adquisición de imagen 1 /h
Ensayos de proliferación celular
Las células fueron sembradas en 384.. así se añadieron placas de 24 h antes de las drogas. Después de 72 h se evaluó el número de células vivas con CellTiter Blue® viabilidad celular de ensayo (Promega) según el protocolo del fabricante. Señal de fluorescencia se cuantificó con EnVision Multilabel lector de placas (Perkin Elmer).
Resultados
células epiteliales normales de la próstata y PrcA líneas forman morfologías características en Matrigel
Normal de próstata y el cáncer de próstata líneas celulares (APCR) no pueden diferenciarse y formar estructuras multicelulares en pura rica en colágeno de la matriz extracelular (Figura S1). En el colágeno, tanto en células tumorales NORMAL- y formaron sólo agregados sueltos, con los contactos célula-célula pobres o no, a menudo presentan un patrón de crecimiento similar a fibroblastos. Por el contrario, Matrigel apoya firmemente tanto el crecimiento y la diferenciación de esferoides normales y AEP. Matrigel tiene efectos profundos en todas las líneas celulares ensayadas y, con pocas excepciones; formación de estructuras multicelulares relevantes es compatible. la formación de esferoides en Matrigel se inicia típicamente por las células individuales. Los esferoides formados en Matrigel general cayeron en cuatro categorías morfológicas, adaptado de [19], [35] (Figura 1; la figura S2).
La mayoría de las estructuras cayeron en las categorías de masa redonda, estrelladas, o grape- me gusta. Algunas líneas celulares no lograron formar esferoides en Matrigel, pero persistieron como células vivas individuales para un máximo de dos semanas (un solo fenotipo). La mayoría de los esferoides fueron imágenes en los días 9-10 después de la inoculación. PC-3, que se muestra como esferoides fenotipo redonda en el día 9, sufren una metamorfosis al fenotipo invasivo /estrelladas en el día 13. Lo mismo ocurre con la PC-3M en un punto de tiempo anterior (día 5-8).
ramificación /fenotipo Ronda.
células epiteliales normales de la próstata primario (PrECs) y líneas no transformadas como RWPE-1 y EP156T formaron esferoides redondas después de 6-10 días de cultivo (Figura 1). PrECs normal y en-vitro Las líneas celulares inmortalizadas tales como RWPE-1 y células PWR-1e formados simultáneamente acinar y estructuras esferoides redondas ramificación, migran activamente en la ECM circundante en forma de grandes agregados de células (Figura 2A-D). EP156T células mostraron pocos o ningún estructuras ramificadas. estructuras redondas generalmente desarrollan una lámina basal robusta (BL), encapsula tanto esferoides y estructuras acinares (Figura 2, Figura S2, Figura 3g-m). ronda Sorprendentemente, las líneas tumorales DU145, PC-3 y PC-3M células también forman y, esferoides bien diferenciadas polarizadas (Figura 2e), rodeado de una completa BL, y que contiene frecuentemente un lumen (PC-3; Figura 3e + r) . Además, PC-3 esferoides menudo contenían una celda interna masiva que recuerda a las estructuras observadas en PIN (neoplasias intraepiteliales de próstata). inmunotinción para proteínas apretado nudo como ZO-1 (no mostrado) y F-actina (Figura 3a-c) demostraron generalmente contactos célula-célula y la polarización celular en esferoides redondas formadas por tanto las células normales y tumorales muy robusto.
contraste de la imagen A) Fase de ramificación estructuras formadas por células RWPE-1, B) estructura acinar formado por RWPE-1 se tiñeron con un anticuerpo contra laminina B1. C) La ramificación o estructuras de grupos similares formados por las células epiteliales de la próstata (PrEC primaria). RE). estructuras mixtas de ramificación y fenotipo de masas, formadas por células PWR-1E. estructuras redondas E) formados por las células PC-3 en el día 9, la tinción de células vivas con calceína. F) la transformación morfológica de esferoides redondas en las estructuras invasoras en el día 13. G) imagen de contraste de fases de invasoras PC-3 estructuras alrededor del día 13. H). La tinción de PC-3 filopodios con un anticuerpo específico para la forma activa de la integrina beta 1 (ITGB1), que ilustra densa decoración de estructuras de células fusiformes similares.
Faloidina
Alexa488 marcado con se utilizó para detectar F núcleos actina y Hoechst para etiquetar (azules). RWPE1, DU145 y PC3 células muestran expresión de marcadores mesenquimales relacionados con la EMT, independientemente del fenotipo (células PC-3; vuelta en el día 9, estrelladas en el día 14) guía empresas
fenotipo misa
..
la mayoría de PRCA (LNCaP, 22Rv1, MDA-PrcA 1, UM-SCP1, CWR-r1, LAPC-4) y dos
in vitro
líneas transformadas (PWR-1E, RWPE-2) esferoides generado grandes e irregulares con BL menudo incompleta o falta, también carece de un lumen de huecos (Figura 3d + k). PWR-1E fue la única línea de células de la masa-fenotipo capaz de ramificar /acinar morfogénesis (Figura 2d). Las queratinas luminales KRT8 y KRT18 siempre se expresaron con fuerza (Tabla S3). contactos célula-célula, la maduración y la polarización fueron generalmente menos pronunciada, en comparación con esferoides redondas, que se refleja en los esferoides irregulares a menudo en forma de riñón (Figura 1). estructuras fenotipo de masas hicieron por lo general no muestran la invasión de la lrECM; sin embargo, la formación de filopodios o pseudópodos se observó consistentemente en el 22Rv1 y de vez en cuando en las líneas celulares RWPE-2 LNCaP y. En esferoides LNCaP, se observaron células con frecuencia para dejar las estructuras esferoides en los sitios de la cobertura incompleta BL (Figura S2).
fenotipo similar a la uva.
Sólo una línea celular, 1013L, formado consistentemente racimos sueltos de células con contactos célula-célula particularmente pobres, que carecen de cualquier BL. células LAPC-4 formaron dos estructuras masivas y uvas. No hay propiedades invasivas se observaron en estas líneas celulares.
Stellate fenotipo "invasivo".
Los vitro en líneas celulares transformadas RWPE-2 /W99, WPE-1 /NB14, y las líneas tumorales estrelladas formada o invasivos estructuras ALVA-31 y ALVA-41, que se caracteriza por filopodios tipo huso (Figura 2 g) y la rápida migración de las cadenas de células a través de la ECM circundante. estructuras formadas invasivos fueron casi exclusivamente multicelular y mostraron un modo de invasión de tipo cadena. Similar a fibroblastos, se observó la invasión de las células mesenquimales individuales sólo ocasionalmente. El
in vitro
líneas transformadas RWPE-2, RWPE-2 /W99 y WPE1 /NB14 formaron simultáneamente estructuras estrelladas y esferoides redondas, que indican la composición heterogénea de estas líneas celulares. De estos, RWPE-2 /W99 representado la línea de células con el fenotipo stellate más consistente, y fue seleccionada para experimentos adicionales. células de la próstata inmortalizada estromales (WPMY-1) y, las células del estroma primario derivados del tumor (no se muestra) también formaron estructuras estrelladas similar, sin embargo carece de la motilidad rápida y propiedades invasivas.
interruptor invasiva.
Ronda y, esferoides polarizadas bien diferenciadas fueron formados por células PC-3M PC-3 y, aunque fueron sometidos a una transformación espontánea hacia la morfología invasiva alrededor de 10-13 y 6-8 días en 3D, respectivamente (Figura 2e + f, complementario invasión de películas S1). El inicio de la transformación morfológica en el estrelladas, fenotipo invasivo era dependiente de la densidad celular. Transformación podría retrasarse temporalmente e incluso revirtió parcialmente a la alimentación de medio fresco, pero con el tiempo continuó progresando hasta que todas las estructuras fueron transformados a fondo y sólo quedaban estructuras estrelladas (Figura 2g). estructuras invasoras y filopodios formaron incluso antes de la invasión expresa fuertemente la forma activa de la laminina-receptor de la integrina beta 1, lo que indica fuertes contactos con la matriz extracelular como requisito previo para procesos invasivos (Figura 2h). Simultáneamente, el BL de estructuras transformadas se vuelve cada vez más difusa y se desintegró (Figura 3M). Fuerte expresión de marcadores mesenquimales vimentina y fibronectina VIM FN1 (Figura 3o-y), observados en no invasiva RWPE-1 (heterogéneo) y DU145, pero también en las células PC-3, no se correlaciona con el fenotipo estrelladas. Además, la expresión de VIM y FN1 no se incrementaron después de la transformación invasivo de las células PC-3 y PC-3M (Figura 3s + y)
fenotipo "individual".
Algunas líneas de cáncer ( VCAP, DuCaP, NCI-H660 y 2b MDA-PCa) no lograron formar esferoides, pero persistieron como células individuales ( "single" o "fenotipo singular") por hasta 2 semanas. Curiosamente, todas estas líneas celulares fueron positivas para eventos de fusión de factor de transcripción ETS-o reordenamientos (TMPRSS2-ERG en H660, VCAP y DuCaP, un reordenamiento ETV1 equilibrado en MDA-PCa 2b). Gen análisis de la expresión de las células VCAP en Matrigel indicó que las células pueden someterse a la diferenciación terminal o la senescencia cuando incrustado en Matrigel (datos no mostrados). La expresión del gen y la proliferación relevante fusión genes TMPRSS2-ERG se redujo en Matrigel. Sin embargo, el crecimiento de VCAP y DuCaP no se restringió en geles de colágeno tipo I; y los patrones de expresión génica en Col I eran limitadas (no se muestra).
Los cambios dinámicos de la expresión génica en respuesta a Matrigel se correlacionan con propiedades normales, transformado e invasivos
LrECM y la formación de esferoides inducen cambios fundamentales en la biología celular, la proteína y la expresión génica de las células ARNm APCR. Alrededor de 3400 los ARNm fueron expresados diferencialmente entre las condiciones en 2D y 3D, sin embargo, no forma coherente en todas las líneas celulares y todos los puntos de tiempo. Se observaron tres patrones generalizados de expresión de genes alterados a través del panel de líneas celulares (Figura 4a + b). La expresión alterada de genes seleccionados fue validado por QRT-PCR (Figura 4c). Factores de expresión diferencial, según lo confirmado por QRT-PCR, fueron generalmente mayores en comparación con los datos de la matriz. GO análisis y GSEA reveló genes categorías funcionales enriquecidos altamente significativas para la mayoría de los grupos (Tablas S4, S5 y S6).
Un mapa de calor), que ilustra 12 agrupaciones generadas por el algoritmo K-medias. Los grupos 1 + 2 representan genes afectados exclusivamente en las células normales (PrEC, EP156T). Clusters 6-8 representan genes inducidos o reprimidos de manera similar en todas las líneas celulares en respuesta al cultivo celular 3D en Matrigel 3D, independientemente del fenotipo, o la transformación. Clusters 9-12 contienen genes característicos para los /líneas estrelladas invasivos de células tipo (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /W99), o que se inducen durante la conversión espontánea de vuelta a las estructuras estrelladas (por ejemplo, PC3, días 13 y 15).