Extracto
La invasión y la posterior metástasis es la causa principal de la muerte de la mayoría de los cánceres, incluyendo el cáncer de próstata. Aquí nos presenta en las posibles propiedades supresoras de tumores de Rab7, una GTPasa que regula el tráfico de los lisosomas. El movimiento de los lisosomas a la superficie celular en respuesta a señales ambientales aumenta la secreción de proteinasas y la invasión de células. Se determinó que la troglitazona y otros miembros de la familia tiazolidinediona inhiben la superficie celular tráfico lisosoma dirigido y la secreción de catepsina B a través de un mecanismo dependiente de Rab7. Por otra parte, se encontró que las células que expresan Rab7 shRNA ser más invasivo
in vitro
y
in vivo
. El aumento de la invasividad fue acompañada por la expresión elevada del receptor c-Met y la señalización aguas abajo prolongado, apoyando así un papel para Rab7 como un mediador de señalización de baja regulación. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que Rab7 actúa como un regulador negativo del crecimiento del tumor de próstata y la invasión, proporcionando una prueba más de su potencial como un supresor de tumores
Visto:. Steffan JJ, diques SS, Coleman DT, Adams LK , Rogers D, Carroll JL, et al. (2014) que apoyan un papel para la GTPasa Rab7 de próstata progresión del cáncer. PLoS ONE 9 (2): e87882. doi: 10.1371 /journal.pone.0087882
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 18 Agosto, 2013; Aceptado: January 5, 2014; Publicado: 5 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Steffan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por los Institutos nacionales de Salud NIH subvención R01 CA104242. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes conflictos: BJW se emplea actualmente por EE.UU. Astellas Pharma, Inc . una empresa con intereses en la terapéutica de oncología; Sin embargo, este trabajo se produjo con posterioridad a la finalización del manuscrito y área de interés de la compañía no representa un interés en competencia directa. Todos los demás autores han declarado que no existen intereses en competencia. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en el intercambio de datos y materiales.
Introducción
La formación de focos metastásicos de un tumor invasivo primario es el acontecimiento fundamental en el proceso de líder a las muertes asociadas al cáncer. Las tasas de mortalidad por cáncer de próstata en etapa tardía (enfermedad metastásica) no han mejorado significativamente en la última década; Por lo tanto, se necesita urgentemente una comprensión de los mecanismos subyacentes invasión tumoral y la metástasis, y el desarrollo de terapias para prevenir la progresión del tumor. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) -Met eje de señalización es un importante regulador de la invasión de células tumorales y la metástasis [1]. la señalización de c-Met inducida por el ligando es conocido para inducir una transición epitelio-mesenquimal (EMT) en el que las células epiteliales pierden adherencias célula-célula y adquieren una más móviles, fenotipo mesenquimal [2]. La inducción de EMT se piensa para mejorar la migración de células tumorales y la invasión a través de las membranas basales. Además de la señalización Met, otros factores dentro del microambiente del tumor, tales como la hipoxia, la glucólisis aeróbica, y el pH extracelular ácido (Phe) pueden aumentar la invasión de células tumorales [3], [4].
invasión del tumor a menudo requiere la la secreción de enzimas proteolíticas, aunque algunas formas de migración celular /invasión son proteasa-ind [5], [6]. Aunque la secreción de la proteinasa puede ocurrir a través de la vía de secreción constitutivamente activa, las principales funciones de las proteasas lisosómicas-localizada se han demostrado en invasión de células tumorales [7], [8]. Hemos demostrado previamente que el ácido Phe y HGF inducen el tráfico de lisosomas a la superficie celular, lo que resulta en un aumento de la secreción de catepsina B [9], [10]. Esto es significativo como alterado la catepsina B y D de localización se detectó en los modelos de mama y melanoma en respuesta a la transformación Ras o cambios en pHe [11], [12]. En publicaciones previas, hemos demostrado que la ubicación espacial de los lisosomas en las células tumorales es importante para la invasión de células [10], [13]. Cuando lisosomas están posicionados más cerca de la superficie de la célula, un aumento de proteasas secretadas y se detecta la invasión de células; mientras que, cuando los lisosomas se encuentran más cerca del núcleo de la célula. (lejos de la superficie de la célula, es decir yuxtapuesta al núcleo celular) de las células tumorales secretan menos proteinasas y son significativamente menos invasiva
Los lisosomas son objeto de tráfico a lo largo de las células a lo largo de los microtúbulos y /o filamentos de actina utilizando proteínas motoras moleculares como dyneins, kinesins, y /o miembros de la familia de la miosina [14]. Además, varias GTPasas como RhoA, Rab7, Rab27, y miembros de la familia Arf regulan la actividad de la proteína del motor o el reclutamiento, regulando así la distribución de los lisosomas y otras vesículas de endocitosis [15], [16].
Rab7 es un regulador de tráfico intracelular endocítica /membrana y está implicado en muchos estados de enfermedad, incluyendo el cáncer y varias enfermedades infecciosas (revisado en [17]). Rab7, con uno de sus efectores, RILP (proteína lisosómica Rab7-que interactúan), reclutar el complejo motor dineína dynactin a los lisosomas que facilitan el tráfico de lisosoma a lo largo de los microtúbulos hacia el núcleo de la célula [18]. Por otra parte, además de su función reconocida en el tráfico de vesículas, Rab7 ha obtenido recientemente la atención como un regulador de la apoptosis en respuesta a la retirada del factor de crecimiento [19] y se ha propuesto para funcionar como una proteína supresora de tumores [20].
Los inhibidores de intercambiadores de sodio-protón (NHE) han demostrado ser muy eficaz en la prevención de la superficie celular tráfico lisosoma dirigida, disminuyendo de ese modo la secreción de la proteasa y la invasión de células [9], [10], [13]. EIPA (5 - (
N-etil-
N
isopropil) -amiloride) se ha demostrado que previene ácida Phe y el tráfico celular lisosoma dirigida a la superficie inducida por HGF; mientras que, los miembros de la familia tiazolidindiona de compuestos se han demostrado para prevenir ácida celular tráfico lisosoma dirigida superficie pHe inducida. Nuestro trabajo previo determinó la troglitazona compuestos y EIPA Ambos utilizan un mecanismo dependiente de Rab7 para inducir la agregación juxtanuclear lisosoma (JLA) [13]. La troglitazona es uno de varios miembros de la familia tiazolidindiona (TZD) de los ligandos de alta afinidad de síntesis para la transcripción factor de peroxisoma proliferador activado del receptor-γ (PPAR-γ). Sin embargo, estos compuestos, incluyendo ciglitazona (CIG), rosiglitazona (Rosi; Avandia) y pioglitazona (Pio; Actos), exhiben PPAR-γ efectos independientes y nuestro laboratorio ha demostrado el efecto potente de la troglitazona en la distribución del lisosoma pHe inducida por ácido ser independiente de γ PPAR-pero requiriendo Rab7 (TZDs revisado en [21]). De hecho, se ha demostrado recientemente que los lisosomas de tráfico a la superficie celular en células que expresan Rab7 shRNA (independiente del estímulo externo) lo que sugiere que Rab7 es un regulador negativo de la trata lisosoma dirigida a la superficie celular [10]. Además, Rab7 shRNA expresando células exhiben mayores niveles de proteasas secretadas y estaban más invasiva
in vitro
[10], [13].
Aquí, presentamos varias líneas de evidencia que demuestra que Rab7 puede desempeñar un papel de supresión en el crecimiento del tumor y la progresión, lo que sugiere por primera que Rab7 es un supresor de tumor putativo
in vivo
. tumores más grandes troglitazona requerido Rab7 para evitar HGF inducida por la secreción de la proteasa y la invasión de células tumorales
in vitro.
Además, las células que expresan Rab7 shRNA formaron
in vivo
, que exhibió aumento de la proliferación, disminución de la apoptosis, y aumento de la capacidad invasiva en los tejidos circundantes. Por último, la reducción mediada por shRNA de Rab7 condujo a un aumento de c-Met
in vitro
y
in vivo
proporcionando un posible mecanismo para explicar estos cambios.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
No tejido humano se utilizó en este estudio. Todos los animales utilizados en este estudio recibieron cuidado humano basado en las directrices establecidas por la American Veterinary Medical Association (AVMA), así como de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto para el Laboratorio de Investigación de Animales, Washington, DC ). Todos los protocolos que involucran animales vivos son revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de LSU Health Sciences Center-Shreveport. Este conjunto de experimentos se llevó a cabo en el marco del protocolo aprobado P-07-059. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales, para reducir el número de animales utilizados, y utilizar alternativas a las técnicas in vivo, si está disponible.
Cell Cultura y
La línea celular de cáncer de próstata humano DU -145 se adquirió de ATCC y se mantuvieron en RPMI-1640 (Mediatech) con 10% de FBS (Gemini Bio-Products) y 1% de penicilina-estreptomicina (Mediatech). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37ºC con 5% de CO
2 y se subcultivaron al alcanzar & gt;. 75% de confluencia
Reactivos y anticuerpos
faloidina, 1:100 se adquirió de Molecular Probes. anticuerpo-tubulina, 1:1000, se adquirió de Vision Lab. LAMP-1 anticuerpo (H4A3), 1:50, se adquirió en el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de la Universidad de Iowa, EE.UU.. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para bloting Western: PMET, pAkt, pErk1 /2, (1:1000), escindido con la caspasa-3 (1-200) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), Rab7 (1:1000 ) (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.), c-Met (muestras de tejido 1:500) (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), c-Met (1:1000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), Ki67 (1:50) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). fluoróforo anticuerpos secundarios conjugados (1:100) fueron adquiridos de Jackson Immunoresearch Laboratories (Westrgrove, PA, EE.UU.). anticuerpos secundarios (IHC 1:200) fueron adquiridos de Vector Labs (Burlingame, CA, EE.UU.). HGF (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizó a 33 ng /ml.
La extracción de proteína de muestras de tumores congelados
muestras tumorales congeladas se diluyeron por primera vez en el hielo frío que contenía tampón RIPA Roche cóctel de inhibidores de la proteasa (Indianapolis, IN, EE.UU.), NaF, y NaVO4 en una proporción 01:05, la masa de volumen. Las muestras se homogeneizaron manualmente utilizando un mortero y mano de mortero, seguido de breve sonicación, y se colocaron en hielo durante 20 minutos con agitación periódica. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos para eliminar los residuos insolubles. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo BCA y la igualdad de proteína se diluyó en tampón de Laemmli y se hirvieron durante 10 minutos.
catepsina B secreción Ensayo
ensayo se realizó como se describe anteriormente [9], [10] . HGF se añadió a los cultivos durante 18 horas a 33 ng /ml.
inmunofluorescencia (I.F.) tinción y microscopía
I.F. microscopía se realizó como se describe anteriormente [9], [10]. Brevemente, las células fueron fijadas con hielo frío 4% PFA para 20 minutos. Las células fueron lavadas en PBS y luego incubadas con anticuerpos anti-LAMP-1 (H4A3-s Iowa State University Banco hibridoma) a una dilución 1:100 en BSP durante una hora a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas, y se incubaron con 594 DyLight anti-ratón (Jackson IR) a una dilución 1:100 en BSP durante una hora a temperatura ambiente. entonces faloidina se utilizó para teñir el citoesqueleto de actina (faloidina 488, Molecular Probes) y se incubó durante 20 minutos a 1:200 en BSP a temperatura ambiente. Los portaobjetos se montó con DAPI que contiene el reactivo de oro SlowFade (Invitrogen S36938). Las células fueron imágenes utilizando una Olympus BX-50 microscopio utilizando el software MetaMorph. Las imágenes fueron fusionados usando ImageJ. Se midió
Lysosome Distribución Análisis
distribución
Lysosome del núcleo mediante el software LysoTracker, un generoso regalo de Meiyappan Solaiyappan (Johns Hopkins). Se analizaron un total de 25 celdas que abarca de tres experimentos independientes para cada conjunto de datos.
Análisis Western Blot
Western blot se realizó como se ha descrito anteriormente [9].
lentiviral entrega de corto horquilla de ARN
ARN de horquilla corta (shRNA) dirigidas hacia Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCTGACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) se dieron en las células de cáncer de próstata DU145 (creación estable Rab7 shRNA células que expresan) usando Misión Lentiviral transducción de partículas (Sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se describe anteriormente [9]. Se generaron células que expresan shRNA no diana utilizando el mismo método con un vector de control de orientación no hay genes de mamíferos conocidos (Sigma) shc202V.
La invasión se realizaron Ensayo
Invasión ensayos como se describe anteriormente [10], [13]. HGF se añadió en medio libre de suero a las dos de las cámaras superior e inferior a una concentración de 33 ng /ml. Los resultados representan el número medio de células invadidas en cuatro campos de visión por condición de tres experimentos independientes.
in vivo Los experimentos
Seis a 8 semanas de edad macho SCID /bg Los ratones fueron inyectados con 2 × 10
6 DU145 células tumorales de próstata que expresan establemente o bien revueltos (no diana; NT) shRNA o shRNA dirigidos a Rab7 en 100 l de PBS por vía subcutánea (n = 6 NT shRNA; n = 7 Rab7 shRNA) . Los tumores se hicieron medible por día 41 después de la implantación y se midieron con calibres digitales dos veces por semana. Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la ecuación: Volumen = π /6 * Largo * ancho
2. Los ratones se sacrificaron a los 104 días después de la implantación y los tumores fueron removidos quirúrgicamente y se fija en el 10 por ciento de formaldehído o congelada. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices establecidas por el Comité LSUHSC-S Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó utilizando técnicas estándar DAB. Brevemente, los tumores fijados con formalina se procesaron y se incluyeron en parafina. Estos bloques fueron seccionadas, deparaffinized, y rehidratada en xileno y lavados de etanol graduado. Los antígenos se desenmascarados con tampón de recuperación de antígeno precalentado durante 15 min y después se enfrió. 0,3% H
2O
2 en metanol se colocó sobre los portaobjetos durante 30 minutos para bloquear los peróxidos endógenos, seguido de una proteína (suero) de bloque para 10 min. A continuación se añadió el anticuerpo primario durante 1 hora a la dilución indicada. A continuación se añadió el anticuerpo secundario biotinilado (1:200) durante 30 minutos. Biotina La unión se incrementaron con el método ABC Elite (Vector Labs) durante 30 minutos y las manchas se visualizaron con DAB (Vector Labs) durante 7 minutos. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina durante 2 min.
Análisis estadístico
GraphPad Software, Prism 3.0 se utilizó para llevar a cabo todas las estadísticas. Uno o dos de cola de Mann-Whitney T-pruebas se realizaron para indicar la significación estadística. Todos los gráficos muestran el error estándar de la media (SEM).
Resultados
troglitazona Evita inducida por HGF de la célula dirigida por superficie Tráfico lisosoma, catepsina B secreción, y la invasión celular
Hemos demostrado previamente que el HGF puede inducir el tráfico dirigido a la superficie celular de los lisosomas [10]. Además, hemos demostrado que la troglitazona impedido ácida de la superficie celular pHe inducida dirigido tráfico lisosoma [13]. célula Con el fin de determinar si troglitazona también puede prevenir HGF inducida por superficie dirigida tráfico lisosoma, las células de tumor de próstata DU145 se co-tratadas con 10 mM troglitazona y 33 ng /l HGF durante 16 horas, después de lo cual los lisosomas se visualizaron por I.F. microscopía usando LAMP1 (lisosoma asociada a la membrana de proteína-1) como un marcador lisosoma previamente establecido [9]. representante I.F. imágenes que se muestran en la figura 1A demuestran que el HGF indujo el tráfico de lisosomas a la superficie celular como publicó anteriormente y que troglitazona no sólo impide el tráfico dirigido a la superficie celular inducida por HGF, pero también inducida por el tráfico retrógrada y la coalescencia de los lisosomas adyacentes a la celda núcleos. Los lisosomas se unieron sobre el centro organizador de microtúbulos (COMT) en las células tratadas con troglitazona (datos no mostrados; [13]). La cuantificación de la ubicación lisosoma como la distancia desde el núcleo de la célula (utilizando el software previamente descrito [9], [22]; Figura 1B) demostró que el HGF causó la redistribución de los lisosomas hacia la superficie de la célula (lejos del núcleo de la célula) y troglitazona impedido HGF celular inducida por superficie dirigida tráfico lisosoma.
) células tumorales de próstata DU145 a se trataron con 10 mM troglitazona y /o HGF durante la noche, seguido de IF La microscopía de visualizar los lisosomas (rojo), actina (verde), y los núcleos (azul). La troglitazona también causa lisosomas a agruparse juxtanuclear a los núcleos celulares. B) Cuantificación de la distribución espacial de los lisosomas Se muestra la distancia como la media de los núcleos celulares individuales para cada condición de tratamiento. Las barras de error representan la S.E.M. de 30 células de al menos tres experimentos independientes. ) las células DU145 C fueron tratados durante 16 horas con troglitazona y /o HGF y la cantidad de catepsina B secretada en el medio de cultivo se detectó utilizando un ensayo de actividad de la catepsina B (ver materiales y métodos). D) las células DU145 se sembraron en insertos Transwell recubiertas con Matrigel y se dejaron invadir por 24 hrs. Se añadieron los tratamientos que se indique a la parte superior e inferior de la pieza de inserción. * La significación estadística (p & lt; 0,001) frente a control; ** La significación estadística (p & lt; 0,01) versus control. Barras de escala: 10 micras
Para demostrar una consecuencia funcional de la trata lisosoma, se midió la actividad de la catepsina B secretada en el medio de cultivo.. El aumento de la actividad de la catepsina B es directamente proporcional a la cantidad de la catepsina B secretada de las células tumorales [9]. Figura 1C demuestra que troglitazona impidió significativamente la secreción de la catepsina B inducida por HGF. Por último, se utilizaron insertos de Matrigel Transwell recubierto de realizar
in vitro
ensayos de invasión. La troglitazona impedido significativamente la invasión de las células HGF tratadas (Figura 1D). La disminución de la invasión no se debió a la muerte celular (datos no mostrados; [10])
Los miembros de la familia tiazolidinediona (TZD) de la Trata Lysosome dirigido en superficie inducida por HGF compuestos diferencialmente de inhibición celular y la invasión celular.
la troglitazona es un miembro de la familia de compuestos Tiazolidinediona. Por lo tanto, hemos probado la capacidad de otros TZD para inhibir el tráfico de lisosoma dirigida a la superficie celular inducida por HGF e invasión celular. Como se muestra en la Figura S1A y se cuantificó en la Figura S1B, ciglitazona y Rosiglitazona superficie celular también impidió dirige el tráfico lisosomal; mientras que, la pioglitazona no tuvo ningún efecto. se clasificaron los efectos diferenciales de las tres TZD en la agrupación lisosoma: La troglitazona & gt; = ciglitazona rosiglitazona. Dado que la pioglitazona no tuvo ningún efecto sobre la trata lisosoma, se compararon los efectos de la troglitazona y pioglitazona sobre la invasión celular. Figura S1C demuestra que troglitazona la invasión de células significativamente inhibido a través de filtros revestidos Matrigel; mientras que, la pioglitazona no tuvo efecto sobre la invasión de células, lo que sugiere que la localización espacial de los lisosomas es un aspecto intrínsecamente importante en la invasión de células tumorales.
El Rab7 GTPasa es necesaria para la Prevención de la inducida por HGF Lysosome dirigida a la superficie celular el tráfico, la catepsina B secreción, y la invasión celular
a pesar de que recientemente hemos implicado Rab7 como un regulador negativo de la trata lisosoma, la secreción de la catepsina B y la invasión de células [10], [13], no hemos demostrado el papel de Rab7 en el contexto de troglitazona y HGF. Por lo tanto, las células que expresan DU145 Rab7 shRNA (caída Rab7 fue del 95% en comparación con un no-objetivo (línea celular que expresa NT) shRNA (Figura 2C recuadro) [10]), fueron tratados con HGF o troglitazona durante 16 horas. SI. microscopía (Figura 2A) demostró que Rab7 se requiere para la troglitazona para prevenir el tráfico dirigido a la superficie celular inducida por HGF lisosoma. Además, los lisosomas en las células que expresan Rab7 shRNA se encontraron más cerca de la superficie de la célula, incluso en ausencia de HGF. La cuantificación de la distancia núcleo-lisosoma (Figura 2B) muestra que los lisosomas son significativamente más lejos de los núcleos de las células y que troglitazona fue ineficaz en la inducción de la agregación de lisosoma juxtanuclear en las células que expresan Rab7 shRNA.
A) I.F. La microscopía se realizó en células tumorales de próstata DU145 que expresan bien un no-diana (codificado) shRNA o una shRNA Rab7 dirigida para visualizar los lisosomas (rojo), actina (verde), y los núcleos (azul). expresión Rab7 shRNA impide troglitazona inducida por la agrupación lisosoma juxtanuclear y hace que los lisosomas para el tráfico a la superficie celular independiente de HGF. B) Cuantificación de la distribución espacial de los lisosomas Se muestra la distancia como la media de los núcleos celulares individuales para cada condición de tratamiento. Las barras de error representan la S.E.M. de 30 células de al menos tres experimentos independientes. células DU145 que expresan C) NT y Rab7 shRNA fueron tratados durante 24 horas con troglitazona y /o HGF y la cantidad de catepsina B secretada en el medio de cultivo se detectó utilizando un ensayo de actividad de la catepsina B (ver materiales y métodos). Catepsina B se aumenta la secreción y troglitazona ya no impide la secreción en las células Rab7 desmontables. El recuadro indica la expresión LAMP-1 y Rab7 en la no diana (NT) o Rab7 shRNA (KD) líneas celulares estables por Western blot. D) células que expresan DU145 NT y Rab7 shRNA fueron sembradas en insertos Transwell recubiertas con Matrigel y se dejaron invadir por 24 hrs. Tratamientos indicados se añadieron a la parte superior e inferior de la pieza de inserción. * La significación estadística (p & lt; 0,001) versus control NT; ** La significación estadística (p & lt; 0,01) versus control NT. Barras de escala: 10 micras
similar a la distribución de los lisosomas, las células que expresan Rab7 shRNA demostraron un aumento de la secreción de catepsina B en ausencia de HGF (Figura 2C).. Por otra parte, troglitazona fue incapaz de prevenir la secreción B catepsina inducida por HGF en células que expresan Rab7 shRNA. Se obtuvieron resultados similares para la invasión celular. La troglitazona impidió que el aumento inducido por HGF en invasión de células tumorales en las células control NT shRNA, pero no en las células Rab7 desmontables (Figura 2D). Por otra parte, las células que expresan Rab7 shRNA fueron significativamente más invasiva en comparación con las células NT shRNA en ausencia de cualquier estímulo. Tomados en conjunto estos datos sugieren que i.) Se requiere la expresión Rab7 para troglitazona para prevenir la trata lisosoma inducida por HGF y ii.) Rab7 actúa como un regulador negativo de tráfico dirigida a la superficie celular lisosoma, la secreción de la catepsina B, y la invasión de células tumorales.
Rab7 shRNA tumores que expresan se hacen más grandes debido al aumento de la proliferación y la disminución de los precios apoptóticas
Desde Rab7 shRNA que expresan las células DU145 fueron más invasiva
in vitro
, se inyectaron estas células subcutánea en el flanco trasero de ratones SCID y volumen tumoral se midió el tiempo para determinar lo que, en su caso, tuvo efecto en la regulación Rab7
in vivo
. Los tumores derivados de las células que expresan Rab7 shRNA se hicieron más grandes que las de NT shRNA que expresan las células (Figura 3A). La diferencia se hizo significativa (p & lt; 0,05) en el día 79 después de la inyección y altamente significativo últimos 79 días (p & lt; 0,001). Es interesante observar que el aumento de la proliferación no se detectó en el Rab7 shRNA célula que expresa
in vitro
(Figura S2). Después de que el tumor más grande alcanzó 1,4 cm
3, todos los ratones fueron sacrificados y los tumores se retiraron quirúrgicamente. Los tejidos murinos circundantes adyacentes a los tumores también se recogieron en este momento. Los tumores se dividieron entonces en medio y, o bien fijadas en el diez por ciento de formalina o Flash-congelado.
) SCID ratones A /BG fueron inyectados con 2 × 10
6 NT shRNA (n = 6) o Rab7 shRNA (n = 7) que expresan las células DU145 sc Los tumores se hicieron medible por día 41 y se midieron a través de calibradores digitales dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados una vez que el tumor más grande, fue de 1,4 cm
2. Los datos se expresan como el volumen milímetro cúbico. Las barras de error representan s.e.m. 6 y 7 de los tumores, respectivamente. * La significación estadística (p & lt; 0,05) en comparación con los tumores NT shRNA; ** La significación estadística (p & lt; 0,001) en comparación con los tumores NT shRNA. B) La inmunohistoquímica se realizó sobre el formaldehído fijo tejido tumoral (ver materiales y métodos). La proliferación celular se evaluó mediante Ki-67 como un marcador de células apoptóticas y se visualizaron utilizando exfoliados caspasa-3 como marcador. C) IHC se cuantificó contando Ki-67 o exfoliados caspasa-3 células positivas. Tres campos al azar por tumor se contaron manualmente. se graficaron El número de células con tinción positiva. * La significación estadística (p & lt; 0,01) frente a tumores NT shRNA; ** La significación estadística (p & lt; 0,05) en comparación con los tumores NT shRNA. Las barras de escala: 100 micras
fijados con formol y los tumores fueron seccionadas y embebidos en parafina para el análisis inmunohistoquímico (IHC).. Desde que se detecta una diferencia en la tasa de crecimiento del tumor, tumor secciones se tiñeron con Ki-67 (un marcador de proliferación) y se escindió de la caspasa-3 (un marcador de apoptosis) y contratinción con hematoxilina. tinción representativo se muestra en la Figura 3B. tinción IHC se cuantificó por recuento manual de Ki-67 o exfoliados caspasa-3 células teñidas. La cuantificación se muestra en la Figura 3C demuestra una disminución significativa (p & lt; 0,01) aumento de Ki-67 tinción positiva y significativa (p & lt; 0,05) disminución de exfoliados caspasa-3 tinción positiva, lo que sugiere que el aumento en el volumen del tumor se debe al aumento tanto de la proliferación y disminución de las tasas de apoptosis.
Rab7 shRNA tumores que expresan presentan un aumento de la invasión y la remodelación de tejidos
embebidos en parafina tumor secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina y se visualizan en dos aumentos diferentes. Como se ha indicado anteriormente, durante la extirpación quirúrgica de los tumores, los tejidos murinos adyacentes y la piel se dejaron intactos. Representativos secciones transversales de la H & amp; E mancha se muestran en la Figura 4. Control (NT shRNA expresar) tumores muestran integridad general de tejido con una capa delgada de piel que recubre una capa pensador gran parte de organizado tejido, intacto (células estriadas; indicado por la flechas). Pocas células tumorales pueden ser detectados en la invasión de esta capa de tejido en los tumores de control. Por el contrario, los tumores que expresan Rab7 shRNA muestran un fenotipo mucho más agresivo. La integridad del tejido circundante murino se vio gravemente comprometida y numerosas células tumorales se encontró intercalan dentro del tejido murino o en la mayoría de los casos, la arquitectura estriado del tejido circundante se vio comprometida por completo. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que no sólo eran los Rab7 shRNA tumores que expresan más grande, que habían aumentado la capacidad de remodelar y de invadir el tejido circundante
H & amp;. E manchadas por vía subcutánea secciones transversales tumorales con el tejido circundante murino y la piel muestran adyacente al tumor. tumores desmontables Rab7 pantalla incrementaron la infiltración en la capa de tejido subyacente a la piel en comparación con el control de los tumores. Además, las pantallas BPB aumentaron el desorden y la pérdida de la integridad que rodea a los tumores Rab7 desmontables. Barra de escala:. 100 micras
Rab7 ARNm es el regulado en el cáncer de próstata biopsias epiteliales celulares, pero no en las células del estroma circundante, ni en la HPB
Desde Rab7 baja regulación aumento del crecimiento tumoral
in vivo
y una mayor capacidad invasiva
in vitro
, el
Oncomine
base de datos, se realizaron búsquedas para determinar los niveles de mRNA diferencial de Rab7 en el cáncer de próstata humano. Análisis de la regulación diferencial de Rab7 en el cáncer de próstata reveló seis conjuntos de datos que abarcan nueve subconjuntos diferentes de tejido prostático. Como se ve en la Tabla 1, varios estudios mostraron una disminución significativa en la expresión de ARNm de plegado Rab7 van -2,501 a -1,128; Sin embargo, dos estudios fueron equívocos con una sonda de detección de un incremento y una segunda sonda de detección de una disminución de Rab7 ARNm en muestras de tumores de próstata, y un estudio no detectó ningún cambio en la expresión del ARNm Rab7. Por otra parte, un análisis de lesiones PIN también mostró una disminución -1.939 veces significativa en Rab7, mientras que dos análisis separados de la hiperplasia prostática benigna (HPB) no pudieron demostrar una reducción en Rab7. Tomados en conjunto, una tendencia aparece por el que se regula Rab7 abajo temprano en el desarrollo de tumores de próstata (lesiones PIN) y permanece baja regulado durante la progresión tumoral, pero no las reguladas en condiciones benignas como la hiperplasia prostática benigna.
Rab7 Derribo provoca un aumento de los niveles de c-Met
para comenzar a determinar los mecanismos que regulan un aumento de la proliferación tumoral y la invasión de las células que contienen reducida Rab7, se examinaron los niveles y la activación de c-Met en el vector control y Rab7 shRNA células que expresan. La adición de HGF con células de control dio como resultado aumento de la fosforilación de c-Met y la activación de vías de señalización aguas abajo seguido por una disminución gradual en los próximos horas. Por el contrario, la adición de HGF a RAB7 desmontables células dio lugar a un más robusto aumento de la fosforilación de c-Met y una pérdida lenta de socios se reunieron y aguas abajo de señalización activadas con el tiempo (Figura 5A). De acuerdo con estos datos, el análisis de la proteína total c-Met en el control y desmontables células Rab7 indicó que los niveles de c-Met fueron más altos en las células con menos Rab7 y que la pérdida mediada por HGF de c-Met también se atenuó (Figura 5B).
a) no-objetivo (NT) el control de vectores o células que expresan DU145 Rab7 shRNA fueron expuestos a HGF durante los tiempos indicados. Lisados de células enteras se recogieron y c-met, Akt, y la fosforilación de ERK se detectó mediante transferencia Western. B) Las células fueron tratadas con HGF para los períodos de tiempo indictated y los niveles de proteína total de c-Met se determinaron mediante análisis de transferencia Western. Densitometría de tres experimentos independientes se utilizó para la representación gráfica de la pérdida de c-Met en el tiempo. C) Las células se trataron con las concentraciones indicadas de HGF durante 30 minutos seguido por análisis de transferencia Western de las proteínas indicadas. lisados D) Proteína de xenoinjertos de tumores fueron cosechadas y los niveles de c-Met y la proteína Rab7 fueron detectados por Western blot total. El gráfico de barras que representa la expresión media de c-se reunieron y Rab7 de siete tumores por grupo de tratamiento como se determinó por densitometría de Western blot. * = P & lt; 0,0007 en comparación con NT shRNA Rab7. ** = P & lt; 0,03 en comparación con NT shRNA c-met. barras de error representan el SEM.
Dado que los niveles de c-Met fueron mayores en desmontables células Rab7, predijimos que estas células tumorales serían más sensibles a las concentraciones más bajas de HGF. Como se indica en la figura 5C, desmontables células Rab7 respondieron a bajas concentraciones de HGF según lo medido por la activación de c-Met, Akt y Erk.
Por último, para determinar si los niveles de c-Met se redujeron en Rab7 xenoinjertos de ratones desmontables , la proteína a partir de tejido de xenoinjerto de tumor congelado se recogió y se preparó para el análisis de transferencia de Western. Figura 5D indica que los tumores se forman a partir de células DU145 de control de vectores, en promedio, contenían más Rab7 y menos de c-Met que los tumores formados a partir de las células Rab7 desmontables.