humano
Extracto
Antecedentes
sulfatasa humana 1 (hSulf-1) es una heparina-degradantes endosulfatase que desulfates proteoglicanos de sulfato de heparán de la superficie celular (HSPGs) en la matriz extracelular y negativamente modula el factor de crecimiento de unión a heparina y la señalización de citoquinas en la proliferación celular. Pero hSulf-1 función es más complicada, y su mecanismo molecular no ha sido bien conocida.
Principales conclusiones
Para investigar más a fondo las funciones de hSulf-1 gen en la regulación del factor de crecimiento endotelial vascular receptor (VEGFR) de señalización, una serie de vectores que expresan hSulf-1, se generaron hSulf-1 pequeño ARN de horquilla (shRNA) y VEGFR-2 shRNA. hSulf-1 reexpresión podría downregualte la fosforilación de VEGFR-2 e inhibir la proliferación de células cancerosas tanto en líneas celulares de cáncer de ovario y hepatocelulares. Desmontables de hSulf-1 de expresión por hSulf-1 shRNA mejoró la recuperación de los altos niveles de fosforilados VEGFR-2, y desmontables de VEGFR-2 expresión de VEGFR-2 shRNA inhibe la actividad de proliferación de células de cáncer
in vitro
hasta cierto punto. En los xenoinjertos de cáncer humano en ratones desnudos, el crecimiento tumoral fue inhibido notablemente después de inyecciones de adenovirus que expresa hSulf-1, con las tasas de inhibición del tumor de 46,19% y 49,56% en modelos de tumores de ovario y hepatocelulares, respectivamente. hSulf-1 de expresión redujo significativamente la densidad microvascular tumoral.
Conclusiones
Los resultados demostraron que hSulf-1 reexpresión tanto en células de cáncer de ovario y hepatocelulares induce eficacia antitumoral mediante la atenuación de la fosforilación de VEGFR 2 y la supresión de la angiogénesis. antiproliferación Por lo tanto, mediada por hSulf-1 y antiangiogénesis podría ser un enfoque razonable para la terapia del cáncer
Visto:. Ji W, Yang J, Wang D, L Cao, Tan W, Qian H, et al. (2011) hSulf-1 Gene Exposiciones de eficacia contra el cáncer a través regulando negativamente VEGFR-2 de señalización en los cánceres humanos. PLoS ONE 6 (8): e23274. doi: 10.1371 /journal.pone.0023274
Editor: S. K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Abril, 2011; Aceptado: 11 Julio 2011; Publicado: 10 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Ji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencia Naturales de China (81071866, 30872998). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
heparán sulfato proteoglicanos (HSPGs) en la matriz extracelular son constituyentes importantes para la regulación de la señalización del factor de crecimiento de unión a heparina, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) [1], [2]. La sulfatación de
N
residuos de acetilglucosamina de HSPG es crítica para las interacciones entre estos ligandos de factores y sus tirosina quinasas de los receptores en la superficie celular [3]. sulfatasa humana 1 (hSulf-1) se caracteriza por ser un endosulfatase heparina degradantes que funciona para desulfatar HSPGs de la superficie celular y modulan negativamente factor de crecimiento y la señalización de citoquinas [4]. proteína hSulf-1 se expresa ampliamente en el tejido normal, pero inactiva en la mayoría de diversos tipos de cáncer humano, por ejemplo, el ovario, mama, pancreático, renal, hepática, de cabeza y cuello carcinomas de células escamosas [5] - [7]. La pérdida de heterocigosidad, la metilación de islas CpG de ADN y modificaciones de las histonas posiblemente son las principales razones de hSulf-1 inactivación en los cánceres humanos [8], [9]. El factor nuclear hepático variante 1 (vHNF1), codificada por el factor de transcripción 2 de genes (TCF2, HNF1beta), también se informó de regular negativamente hSulf-1 de expresión en el cáncer de ovario [10]. Re-expresión de hSulf-1 en células de cáncer con eficacia se traduce en una disminución de la proliferación celular, así como un aumento de la sensibilidad a la quimioterapia inducida por apoptosis [11]. Por lo tanto, los datos presentados sugieren que hSulf-1 normalmente funciona como un regulador negativo de la proliferación celular, que pueden desempeñar un papel importante en la terapia del cáncer.
Para investigar el papel regulador de hSulf-1 en el crecimiento de unión a heparina factor de señalización en los cánceres humanos, los estudios anteriores identificó que hSulf-1 de expresión puede disminuir la fosforilación en cascada de una serie de quinasas que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), señal extracelular regulada quinasa (ERK), proteína quinasa quinasa activada por mitógeno ( MEK), serina /treonina quinasa (AKT) después del tratamiento con exógenamente añadido factores de crecimiento, y seguido de la inactivación de las vías de señalización corriente abajo [6], [11], [12]. hSulf-1 también participa en la inhibición de la fosforilación de autocrina mediada por EGFR-ERK en células de cáncer de mama inducido por la privación de suero, y la inhibición de la señalización de EGFR-ERK autocrina por hSulf-1 da como resultado una expresión reducida de la ciclina D1, una disminución de la fracción S de fase y una fracción de aumento de G2-M, y, finalmente, conduce a la inhibición de la supervivencia celular en células de cáncer de mama [7]. Por lo tanto, la pérdida de hSulf-1 en los cánceres y las líneas celulares de cáncer se asocia con la regulación al alza del factor de crecimiento de señalización por fosforilación quinasa mejorada, y la fosforilación y la activación de tirosina quinasas receptoras han sido implicados en la promoción de la carcinogénesis y el desarrollo de cánceres.
por otra parte, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y del receptor de VEGF (VEGFR) están involucrados en la supresión de las células cancerosas hSulf-1 mediada por [6]. Por lo tanto, supongamos que hSulf-1 puede presentar potencia contra el cáncer mediante la inhibición de la angiogénesis en la mayoría de los cánceres humanos. La familia de VEGFR contiene tres miembros, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR /Flk-1) y VEGFR-3 (Flt-4), que son receptores de tirosina quinasa transmembrana que regulan la formación de la sangre y linfático vasos. Entre estos tres receptores, VEGFR-2 se reconoce en general que tiene un papel principal en la mediación de la respuesta inducida por VEGF que regula directamente la angiogénesis del tumor [13]. En este estudio, mediante la construcción de diversos vectores que portan el gen hSulf-1, hSulf-1 pequeña horquilla de RNA (shRNA) o VEGFR-2 shRNA, que aportaron pruebas para demostrar que el hSulf-1 reexpresión exhibió un efecto negativo sobre el crecimiento celular mediante la regulación negativa VEGFR-2 de señalización tanto en el cáncer de ovario y de líneas celulares de carcinoma hepatocelular. La eficacia antitumoral de hSulf-1 también fue validado en xenoinjertos de cáncer de ovario y hepáticas en ratones desnudos.
Resultados
Inactivación de hSulf-1 es un acontecimiento molecular común en la mayoría de los cánceres humanos e implica en VEGFR-2 de señalización
La proteína hSulf-1 se expresa ampliamente en los tejidos y las funciones normales de modular negativamente la señalización del factor de crecimiento. Para demostrar su inactivación en la mayoría de diversos tipos de cáncer humanos, se examinaron hSulf-1 expresión en muchos tipos de especímenes de cáncer de humanos por inmunohistoquímica. En las células epiteliales de tejidos normales, hSulf-1 fue positivo con una tasa positiva de 100,0%. Pero en sus correspondientes tipos de cáncer, hSulf-1expression fue suprimida obviamente. Las tasas positivas de hSulf-1 fueron 23,1% (6/26), 16,7% (2/12), 31,8% (7/22), 11,1% (1/9), 44,4% (8/18) en hepatocelular, de mama, gástrico, cánceres renales y de colon, respectivamente (fig. 1A).
(a) Los especímenes, incluyendo varios tipos de cáncer y sus tejidos normales adyacentes, se fijaron en formaldehído al 10% neutral durante 6 h, parafina incrustado, y cortados en secciones de 5 micras de espesor para hSulf-1 inmunohistoquímica. Las células de carcinoma hepatocelular (CHC) fueron negativos para hSulf-1 de expresión, que estaban rodeados por las células del hígado hSulf-1-positivas. El cáncer de mama, cáncer gástrico y células de carcinoma renal de células claras fueron todos negativos, y las células de cáncer de colon fueron positivos para hSulf-1 de expresión; aumento original × 200 (panel superior). Los porcentajes de células hSulf-1-positivos en todas las muestras se contaron dentro de los 5 campos de gran aumento (aumento original × 400) bajo el microscopio, y mostraron en histogramas (panel inferior); * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01. (B) La expresión de VEGFR-2, incluyendo las camisetas, VEGFR2 y p-VEGFR2, en 26 casos de HCC fue detectada por inmunohistoquímica; aumento original × 400 (panel izquierdo). Los porcentajes de células positivas en 6 hSulf-1-positivos y 20 hSulf-1-negativos HCC fueron contados dentro de los 5 campos de gran aumento (aumento original × 400) bajo el microscopio, y mostró en los histogramas (panel derecho); * P & lt;. 0.05
El efecto evidente de hSulf-1 es disminuir la fosforilación en cascada de una serie de receptores de tirosina quinasas, que se demuestra en VEGF y VEGFR señalización [6]. Por lo tanto, hemos explorado la expresión de total de VEGFR-2 (t-VEGFR2) y fosforilada VEGFR-2 en Tyr1175 (p-VEGFR2
Tyr1175) en las muestras de tumor (Fig. 1B). Entre 26 casos de carcinoma hepatocelular, hay una disminución evidente de p-VEGFR2
nivel Tyr1175 en el carcinoma hepatocelular hSulf-1-positiva que la del carcinoma hepatocelular hSulf-1-negativos (P & lt; 0,05), pero no hubo diferencia de expresión t-VEGFR2 entre ellos (P & gt; 0,05).
mediada por adenovirus hSulf-1 reexpresión regula a la baja la fosforilación de VEGFR-2 en células de cáncer
Para probar la eficacia de la infección adenovirus, células de cáncer BEL-7404 se infectaron con el adenovirus de control Ad5-EGFP que lleva un gen informador de proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) y se observaron las cuarenta y ocho horas después de la infección con un microscopio fluorescente. Los porcentajes de células EGFP positivas fueron 42,67 ± 12,25% y 86,33 ± 26,48% a multiplicidades de infección (MOI) de 5 y 10 pfu /célula, respectivamente (Fig. 2A).
(A) Bel 7404 células fueron infectadas con el adenovirus de control Ad5-EGFP en las MOI de 5 y 10 pfu /célula, y se observaron los porcentajes de células EGFP positivas bajo un microscopio fluorescente, aumento original × 400. (B) RT-PCR se utilizó para identificar hSulf-1 mediada por la expresión por adenovirus Ad5-hSulf1. 1, las células infectadas con Ad5-hSulf1 a una MOI de 10 pfu /célula; 2, las células infectadas con Ad5-hSulf1 a una MOI de 10 ufp /célula y luego transfectadas con hSulf-1 shRNA vector a una concentración de 20 g /10
5 células; 3, células parentales. (C) Expresión de hSulf-1, t-VEGFR2 y p-VEGFR2
Tyr1175 se identificó mediante inmunotransferencia de tipo Western. gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como control de carga. Se realizó un análisis densitométrico para mostrar los niveles de expresión de p-VEGFR2
Tyr1175 en las células cancerosas, normalizados con la densidad GAPDH. Las columnas son la media de tres análisis separados; barras = SD; ** P & lt;.
0,01
Las líneas celulares de cáncer de los padres, y SKOV3 BEL-7404, fueron negativos para hSulf-1 de expresión. Después de 48 h post-infección de Ad5-hSulf1 a una MOI de 10 pfu /célula, células de cáncer fueron positivos para hSulf-1, y la hSulf-1 shRNA podrían regular a la baja el nivel de expresión hSulf-1 (Fig. 2B). Dado que el gen hSulf-1 puede disminuir la fosforilación de quinasas implicadas en muchas vías de señalización del factor de crecimiento, se examinaron los niveles de expresión de t-VEGFR2 y p-VEGFR2
Tyr1175. En comparación con las células cancerosas de los padres, el nivel de t-VEGFR2 permaneció sin cambio en las células Ad5-hSulf1 infectadas. Sin embargo, el nivel de p-VEGFR2
Tyr1175 tuvo una disminución obvia después de la infección de Ad5-hSulf1. Cuando el hSulf-1 shRNA se transfectó en la Ad5-hSulf1 células cancerosas infectadas, hSulf-1 expresión fue re-inhibido, y el contenido de p-VEGFR2
Tyr1175 recuperó casi a los niveles normales (Fig. 2C).
mediada por adenovirus hSulf-1 reactivación inhibe la proliferación de células de cáncer
Debido a que la pérdida de hSulf-1 es un acontecimiento molecular común en la mayoría de los cánceres humanos, reactivamos hSulf-1 de expresión por la infección de adenovirus que lleva el gen hSulf-1 en diferentes líneas celulares de cáncer y se examinó la proliferación celular. En comparación con el adenovirus de control Ad5-EGFP, Ad5-hSulf1 ejerce un efecto de inhibición obvio en la proliferación de células de cáncer con forma MOI-dependiente. Cuando MOI era más de 20 pfu /célula, la viabilidad celular se redujo a menor que 50% en el Ad5-hSulf1 infectado las células de cáncer, mientras que, la viabilidad celular fue de más de 80% en el Ad5-EGFP infectado las células cancerosas (Fig. 3A).
(a) SKOV3 y células cancerosas BEL-7404 fueron infectadas con Ad5-hSulf1 a diferentes MOI. Ad5-EGFP se utilizó como un adenovirus control. (B) SKOV3 y células de cáncer de BEL-7404 fueron transfectadas con VEGFR-2 shRNA vector a una concentración de 20 g /pocillo. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, VEGFR-2 se detectó expresión por Western blotting y la viabilidad celular se detectó mediante el ensayo de MTT. El control negativo shRNA (Ctrl-shRNA) se utilizó como control negativo; * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01. las células cancerosas (C) BEL-7404 fueron infectadas con Ad5-hSulf1 a una MOI de 10 ufc /ml y después se transfectaron con VEGFR-2 shRNA vector a una concentración de 20 mg /10
5 células, a continuación, VEGFR-2 y la expresión celular se detectaron viabilidad. BEL-7404 células parentales se utiliza para representar la cantidad máxima de crecimiento de las células para producir la viabilidad por ciento; * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0.01
Las células de cáncer cultivadas en placas de 96 pocillos se transfectaron con los vectores que contienen el VEGFR-2 shRNA y control negativo shRNA a una concentración de 20 g /pocillo. La expresión de VEGFR-2 se examinó por transferencia de Western, y la viabilidad celular se midió por 3- bromuro (MTT) ensayo de -2,5-difeniltetrazolio (4,5-dimetiltiazol-2-il). En comparación con el control negativo shRNA, el VEGFR-2 shRNA inhibe VEGFR-2 expresión y la disminución de la viabilidad celular en cierto grado (Fig. 3B). Para demostrar si VEGFR-2 desmontables en condiciones de hSulf-1 sobreexpresión tiene el mismo efecto sobre la viabilidad celular, las células cancerosas BEL-7404, que fueron infectadas con Ad5-hSulf1 a una MOI de 10 ufp /célula, se transfectaron con VEGFR-2 shRNA vector a una concentración de 20 g /10
5 células a desmontables la expresión de VEGFR-2 (Fig. S1), los resultados mostraron que la viabilidad celular BEL-7404 después de la transfección de VEGFR-2 shRNA se redujo aún más en el contexto de hSulf-1 efecto (Fig. 3C).
mediada por adenovirus terapia génica hSulf-1 exhibe una eficacia antitumoral potente por antiangiogénico en xenoinjertos de cáncer humano en ratones desnudos
Reactivación de hSulf- 1 función en las células de cáncer pueden inactivar el factor de crecimiento de aguas abajo vías de señalización, por lo tanto, hSulf-1 es un nuevo objetivo para la terapia génica del cáncer. Por la presente, se construyó un vector de adenovirus que expresan el tipo salvaje hSulf-1 gen, Ad5-hSulf1. Su eficacia antitumoral fue validado tanto en xenoinjertos de cáncer de ovario y hepatocelulares en ratones desnudos (Fig. 4A). Después de las inyecciones intratumorales de los virus en una dosis total de 10
9 pfu por ratón, la supresión del crecimiento del tumor en el grupo de Ad5-hSulf1 tratado fue más eficaz, con las tasas de inhibición del tumor de 46,19% y 49,56% en SKOV3 y Bel 7404 modelos, respectivamente, en comparación con el grupo de control en blanco (P & lt; 0,01). No hubo diferencias entre el grupo negativo de control del virus y el grupo control en blanco (P & gt; 0,05).
(A) SKOV3 y modelos BEL-7404, 5 ratones por grupo, efecto de supresión de Ad5-hSulf1 el tumor se analizó el crecimiento, en comparación con el grupo control o el grupo Ad5-EGFP adenovirus negativo; puntos negros en el eje X presentan los puntos de tiempo de las inyecciones de adenovirus; ** P & lt; 0,01. (B) El examen patológico de los tumores de xenoinjertos SKOV3. Comparación de peso del tumor en modelos SKOV3 (panel izquierdo); Bar = 1 cm; ** P & lt; 0,01 frente a los grupos Ad5-EGFP control o. Por hematoxilina y eosina (HE) y los exámenes inmunohistoquímicos, los porcentajes de células positivas para hSulf-1, la densidad microvascular (MVD) Contar etiquetados por el anticuerpo CD31, fueron cuantificados dentro de los 5 campos de gran aumento (aumento original × 400) bajo el microscopio. Después de inyecciones de Ad5-hSulf1, las células tumorales fueron positivas para hSulf-1 expresión en el citoplasma. En consecuencia, el recuento de MVD se redujo notablemente, en comparación con la de en el grupo de control. (C, D) El total de VEGFR-2 y fosforilada VEGFR-2 (C), y AKT total y AKT fosforilada (D) se identificaron por transferencia (panel izquierdo) Western e inmunohistoquímica (panel derecho) en Ad5-hSulf1 tratado SKOV3 xenoinjerto tumores, en comparación con los grupos de Ad5-EGFP control y.
al final del período de observación, los ratones portadores de xenoinjertos SKOV3 se sacrificaron y los tumores se retiraron y se pesaron. Los pesos de los tumores del grupo de Ad5-hSulf1 eran más bajos que el de los otros dos grupos (Fig. 4B, panel izquierdo). Las secciones de tumor embebidas en parafina se examinaron inmunohistoquímicamente. En el grupo de control en blanco, las células cancerosas fueron negativos para hSulf-1 de expresión. Pero en el grupo Ad5-hSulf1, células de cáncer de re-expresan la proteína hSulf-1. Un análisis cuantitativo de la densidad de microvasos (MVD) se realizó por CD31 inmunohistoquímica. Los MVDS en los tejidos tumorales fueron 24,67 ± 6,51 y 52,33 ± 12,34 en el grupo control, respectivamente (Fig. 4B, panel derecho) Ad5 y hSulf1. Hubo una diferencia significativa entre ellos (P & lt; 0,05).
A medida que el gen hSulf-1 ejerce una amplia papel en la regulación de múltiples vías mediante la inhibición de la fosforilación de tirosina quinasas intracelulares que podría ser crítico en la proliferación de células tumorales y la angiogénesis tumoral, por lo tanto, examinó la expresión de proteínas aguas abajo, incluyendo VEGFR-2 y la serina /treonina quinasa (AKT) en los tumores de xenoinjertos. Los resultados mostraron que la expresión de p-VEGFR2
Tyr1175 y AKT fosforilada en Thr308 (p-AKT
Thr308) se downregulated en el grupo de Ad5-hSulf1 examinado por transferencia de Western e inmunohistoquímica (Fig. 4C, D).
Discusión
la sulfatación de HSPG de la superficie celular se cree que desempeñan un papel importante en la regulación de la unión a heparina de señalización en la matriz extracelular [14] factor de crecimiento, [15]. La proteína hSulf-1 es una enzima actividad arilsulfatasa que puede regular negativamente el estado de sulfatación de HSPG [16]. Una fuerte evidencia demostró que hSulf-1 normalmente funciona para desulfatar HSPGs de la superficie celular y regulan negativamente la señalización del receptor de tirosina quinasa de abrogar eficazmente el crecimiento celular y la supervivencia [4], [17]. Este proceso juega un papel distinto en la inhibición de la transformación maligna y el crecimiento de células de cáncer [18], [19]. Por lo tanto, hSulf-1 es considerado como un gen supresor de tumor. Estudios anteriores demostraron que hSulf-1 se inactiva en la mayoría de los cánceres humanos a través de cualquiera de los mecanismos genéticos, tales como la eliminación y mutación, o a través de mecanismos epigenéticos, como la metilación del ADN y la desacetilación de histonas [12], [20], [21]. Se demostró además que la inmunohistoquímica hSulf-1 de expresión se downregulated en 87 casos de muestras clínicas incluyendo hepatocelular, mama, gástrico, renal y cánceres de colon, en comparación con sus tejidos normales adyacentes. Debido a las razones por las que hSulf-1 ha complicadas funciones, y su mecanismo molecular no ha sido bien conocidos aún, en estos estudios hemos probado si la inhibición mediada por hSulf-1 de la señalización de VEGFR se asocia con antiproliferación y antiangiogénico en cáncer.
Tanto las lesiones primarias y tumores metastásicos deben desarrollar un nuevo suministro vascular con el fin de apoyar la expansión de las células cancerosas y difusión. La mayoría de las células cancerosas pueden expresar tanto ligando VEGF y VEGFR que actúan en un bucle autocrino para estimular directamente la angiogénesis del tumor [22]. La angiogénesis es un paso limitante de la velocidad en el crecimiento del cáncer, la progresión y la metástasis. VEGF es un mediador crítico de la angiogénesis, que se expresa bien de manera equilibrada en la mayoría de tejidos y tipos de células, pero altamente regulados hasta en tumores [23]. La unión de VEGF a sus receptor da como resultado la autofosforilación del receptor y la posterior activación de una serie de quinasas de tirosina, a continuación, activa múltiples proteínas aguas abajo que desempeñan papeles funcionales en la supervivencia celular, la proliferación celular, la permeabilidad vascular y la estabilización de nuevos vasos sanguíneos [24] - [ ,,,0],26]. Por lo tanto, la activación de la fosforilación mediada por VEGFR es un proceso importante para la regulación del crecimiento del cáncer. Debido hSulf-1 cataliza la desulfatación de HSPG, por lo tanto, afecta a la capacidad de unión de factores de unión a heparina a sus receptores en el EGFR, ERK1 /2, MEK, las vías de señalización de PI3K /AKT, y deprime la fosforilación y la activación de tirosina quinasas receptoras . Estas vías de señalización estaban involucrados en proceso angiogénico [27] - [29]. HSPGs altamente sulfatados potencian la interacción entre VEGF y VEGFR-2, a continuación, fosforilan y activan VEGFR-2. En este proceso, la expresión de VEGF y VEGFR-2 no puede verse afectado por sulfatación o desulfatación de HSPG [30]. Se encontró que el aumento de VEGFR-2 fosforilación en Tyr1175 era conocido por ser esencial para la activación dependiente de VEGF de la señalización de MAPK y la angiogénesis [31]. Para comprobar el efecto negativo de hSulf-1 en la angiogénesis del cáncer, generamos adenovirus que expresa hSulf-1. Adenovirus mediada hSulf-1 de expresión no sólo downregualted los niveles de fosforilados VEGFR-2 pero también inhibió la proliferación de células de cáncer tanto en líneas celulares de cáncer de ovario y hepatocelulares. Desmontables de hSulf-1 de expresión por hSulf-1 shRNA vector mejoró la recuperación de los altos niveles de fosforilados VEGFR-2, lo que indica que hSulf-1 regula la fosforilación y la activación de VEGFR-2. Sin embargo, la inhibición de la proliferación de células de cáncer
in vitro
por hSulf-1 re-expresión puede ser debido principalmente a la desulfatación de HSPG y la desactivación del de muchas vías de señalización del factor de crecimiento. Sin embargo, cuando se utilizó el VEGFR-2 shRNA para silenciar la expresión de VEGFR-2 en células de cáncer de ovario y hepatocelulares, la viabilidad celular se redujo hasta cierto punto, lo que demuestra que la señalización VEGFR-2 participa en la regulación de la proliferación celular del cáncer, y el efecto de antiproliferación de hSulf-1 en las células cancerosas se debe en parte a la inhibición de VEGFR-2 de señalización. Cuando las células cancerosas BEL-7404 se infectaron con Ad5-hSulf1 para volver a expresar hSulf-1 y luego transfectadas con VEGFR-2 shRNA para silenciar VEGFR-2 expresión, la viabilidad celular se redujo aún más, lo que demuestra exactamente que existe otro mecanismo involucrado en VEGFR-2 de activación y proliferación de células cancerosas en el contexto de hSulf-1 efecto.
Para evaluar el efecto de hSulf-1 sobre el crecimiento tumoral, se trataron xenoinjertos de cáncer humano en ratones desnudos con adenovirus que expresa hSulf-1. Los resultados encontraron que el crecimiento del tumor se inhibió después del tratamiento. Las tasas de inhibición de tumores fueron 46,19% y 49,56% en modelos de tumores de ovario y hepatocelulares, respectivamente. Re-expresión de hSulf-1 dio como resultado la regulación por disminución de fosforilados VEGFR-2 y AKT fosforilada, después se redujo significativamente la densidad de los microvasos de tumores, lo que indica que hSulf-1 de expresión se asocia con la antiangiogénesis.
En conclusión, hSulf-1 es una sulfatasa que funciona para desulfatar HSPGs de la superficie celular. Puede inhibir la fosforilación de quinasa aguas abajo con un espectro amplio y regular negativamente la señalización del receptor de tirosina quinasa. Este estudio dio una evidencia convincente para demostrar que hSulf-1 reexpresión tanto en células de cáncer de ovario y hepatocelulares atenúa la fosforilación de VEGFR-2, a continuación, suprime la proliferación de células cancerosas y la angiogénesis, por último induce la eficacia antitumoral. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que antiproliferativa mediada por hSulf-1 y antiangiogénesis podría ser un enfoque razonable para la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Exámenes de hSulf-1 y VEGFR-2 en la expresión clínica especímenes de cáncer
la expresión de hSulf-1 se detectó mediante inmunohistoquímica en 87 casos de cáncer de especímenes clínicos, incluyendo 26 carcinomas hepatocelulares, 12 cánceres de mama, 22 cánceres gástricos, cánceres renales 9, 18 cánceres de colon, y su normal adyacente tejidos. VEGFR-2 incluyendo t-VEGFR2 y p-VEGFR2
Tyr1175, también se detectó en 26 carcinomas hepatocelulares por inmunohistoquímica. Las muestras fueron fijadas en formol al 10% neutral durante 6 h, embebido en parafina y se cortaron en secciones de 5 micras de espesor para inmunohistoquímica con un hSulf-1-anticuerpo anti conejo (Abcam inc., Cambridge, MA), un anti-conejo VEGFR-2 y un anticuerpo
anticuerpo Tyr1175-fosfo-VEGFR2 anti-conejo (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). La aprobación para el uso de muestras clínicas fue dada por el Comité de Ética de Investigación, La Segunda Universidad Médica Militar, y hemos obtenido el consentimiento informado por escrito de todos los participantes involucrados en el estudio.
Preparación de vectores de adenovirus y
el plásmido pcDNA3.1-hSulf1 que contiene la totalidad de longitud hSulf-1 cDNA y la pSUPER.retro.puro vector que contiene el hSulf-1 shRNA (19 pares de oligonucleótidos dirigidos hSulf-1 cDNA posiciones 294-312: GTATGTGCACAATCACAAT) fueron amablemente dotado de Viji Shridhar (Departamento de Patología Experimental, Centro Oncológico de Mayo Clinic, Rochester, MN). El vector pGenesil-1.1 que contiene el VEGFR-2 shRNA (19 pares de oligonucleótidos dirigidas a VEGFR-2 cDNA posiciona 525-543: CAGAATTTCCTGGGACAGC) o el control negativo shRNA (19 pares de oligonucleótidos: gacttcataaggcgcatgc) fueron adquiridos de Wuhan Genesil Biotecnología Co., Ltd. (Wuhan, china).
para recombinar vector de adenovirus, pcDNA3.1-hSulf1 se utilizó para amplificar el ADNc hSulf-1 con los cebadores P1 (5'-cgggatccaccatgaagtattcttgc-3 ') y P2 (5'- gcgtcgacttaaccttcccatccatcccataac-3 '). El producto de PCR se digirió con BamHI y SalI, se inserta en el plásmido pDC315 adenovirus (Microbix Biosystems, Ontario, Canadá) para generar pDC315-hSulf1. Los plásmidos pDC315-hSulf1 y pDC315-EGFP fueron transfectadas, respectivamente, en células HEK293 (Microbix Biosystems, Ontario, Canadá) utilizando el reactivo de transfección Polyfect (QIAGEN Inc., Valencia, CA) junto con el plásmido de empaquetamiento de adenovirus pBHGloxdelE13cre (Microbix Biosystems, Ontario, Canadá). Después de una recombinación homóloga en células HEK293, se obtuvieron los adenovirus Ad5 nombre-hSulf1 y Ad5-EGFP. Ad5-EGFP se utilizó como el control de virus. Todos los adenovirus se amplificaron en células HEK293 y se purificaron por ultracentrifugación en gradientes de cloruro de cesio (CsCl). Los títulos virales se detectaron con el cultivo de tejidos dosis infecciosa 50 método (TCID50) [32] establecido por Qbigene Inc. (IIIkich, Francia), y mostró como unidades formadoras de peste por mililitro (pfu /ml).
cultivo de células y transfectantes
la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), la línea celular de carcinoma hepatocelular BEL-7404 (Instituto de Biología celular, Academia de Ciencias de china, Shanghai, china ) se cultivaron en los medios de comunicación de acuerdo con las recomendaciones de los proveedores. Cuando las células se encontraban en fase logarítmica, que se infectaron con adenovirus (Ad5-hSulf1 o Ad5-EGFP) a MOI de 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 pfu /célula, y se recogieron 48 h después de la infección. Las células infectadas por virus y sus células parentales fueron transfectadas con hSulf-1 shRNA y VEGFR-2 shRNA vectores utilizando el reactivo de transfección Polyfect (QIAGEN Inc., Valencia, CA) según el protocolo del proveedor. Veinticuatro horas más tarde, la puromicina (3 pg /ml) o se añadió G418 (400 mg /ml) para seleccionar hSulf-1 transfectantes shRNA o VEGFR-2 transfectantes shRNA, respectivamente. Después continua cultivaron durante 24 h, se cosecharon las células y se ensayó el silencio de la expresión del gen diana.
in vitro
examen de la expresión del factor correlativo
Las células cancerosas, incluyendo las células parentales, infectadas con virus y shRNA transfectadas, se recogieron 48 h después de la infección o transfección. ARN total fue extraído de 10
5 células con reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y utilizados para amplificar hSulf-1 de expresión por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), con la P3 cebadores (5'-ccaccttcatcaatgcctt -3 ') y P4 (5' ccttgaccagtccaaactgc-3 '). Los fragmentos amplificados eran 762 pb. gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó con los cebadores P5 (5 'accacagtccatgccatcac-3') y P6 (5'-tccaccaccctgttgcttgta-3 ') como un control interno. La proteína total fue extraído a partir de 10
5 células por M-PER proteínas de mamíferos reactivo de extracción (Pierce, Rockford, IL) y investigado por el Western Blot como se describe anteriormente [33], con los anticuerpos primarios indicados, incluyendo el conejo anti-VEGFR -2 y conejo anti-fosfo-VEGFR-2
Tyr1175 (Cell Signaling Tecnología, Inc., Danvers, MA).
La viabilidad celular por MTT ensayo
El parental a virus se diluyeron las células transfectadas infectadas y shRNA a una concentración de 10
5 células /ml, y se sembraron a una densidad de 100 l /pocillo en placas de 96 pocillos. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT utilizando el kit de proliferación celular I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) como se describe anteriormente [34]. absorbancia media para cada muestra se examinó con un lector de microplacas (Modelo 550, Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japón) a una longitud de onda de 570 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm.
Los modelos animales y
in vivo
experimentos
células
SKOV3 y BEL-7404 se inyectaron por vía subcutánea en los flancos derechos de ratones Balb /c (nu /nu) (Shanghai Centro de Experimentación Animal de la Academia china de Ciencias, Shanghai, china) , 10
7 células por ratón, para establecer xenoinjertos. Tres semanas después, los ratones fueron separados al azar en 3 grupos: el Ad5-hSulf1, Ad5-EGFP y los grupos de control, 5 ratones por grupo. Los ratones en los grupos de Ad5-hSulf1 y Ad5-EGFP se les dio 5 inyecciones intratumorales, una inyección cada dos días, con una dosis total de 10
9 PFU virus por ratón. Los ratones del grupo de control se les dio el mismo volumen de solución de conservación viral (10 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 2 mmol /L MgCl
2, 4% de sacarosa). El tamaño del tumor se midió con regularidad, y el volumen del tumor se calculó con la fórmula "
a
×
b
2 x 0,5", en el que
a
y
B Opiniones representan el máximo y diámetros mínimos. Los ratones fueron sacrificados al final del periodo de observación, y se eliminaron los tumores, se pesaron y se fijaron en 10% formaldehído neutro para 6 h. Las secciones consecutivas incluidas en parafina se cortaron para examinar la expresión de hSulf-1, t-VEGFR2 p-VEGFR2
Tyr1175 y t-AKT, p-AKT
Thr308 por inmunohistoquímica y Western Blot. El conejo anti-fosfo-AKT
Thr308 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). El valor MVD en los tejidos tumorales se realizó por CD31 inmunohistoquímica utilizando una rata anti-ratón CD31 anticuerpo monoclonal (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los porcentajes de células positivas y el valor MVD en los tumores fueron contados dentro de los 5 campos de alta potencia al azar (aumento original × 400) bajo el microscopio, y se muestran como media ± desviación estándar (SD) [35].