Extracto
Antecedentes
esofágica carcinomas de células escamosas (CECA) tienen un mal pronóstico. Mientras modalidad combinada de quimioterapia y de radioterapia supervivencia aumenta, la mayoría de los pacientes mueren dentro de los cinco años. Desarrollo de agentes que confieren quimioterapia de células específicas de cáncer y radiosensibilidad puede mejorar la terapia de la CECA. Nosotros informamos aquí el descubrimiento de berberina como agente radiosensibilizador potente sobre las células CECA
Principales conclusiones
berberina a bajas concentraciones.; Células CECA sustancialmente radiosensitized (& lt 15 M). De rayos X de ADN inducida por doble filamento se rompe (DSBs) persisten más tiempo en las células pretratadas con berberina CECA. pretratamiento berberina condujo a una regulación a la baja significativa de RAD51, un jugador clave en la reparación de recombinación homóloga, en las células CECA, pero no en células humanas no malignas. Regulación a la baja de
RAD51 fotos: por interferencia de ARN de manera similar radiosensitized las células cancerosas, y, por el contrario, la introducción de RAD51 exógeno fue capaz de contrarrestar de manera significativa el efecto radiosensibilizador de berberina, estableciendo así RAD51 como un determinante clave en la sensibilidad a la radiación. También observamos que RAD51 fue comúnmente sobreexpresa en tejidos CECA humanos, lo que sugiere que es necesario regular a la baja RAD51 para lograr una alta radio- o eficacia quimioterapéutica de la CECA en la clínica, debido a la sobreexpresión de RAD51 es conocido para conferir radio y quimiorresistencia.
Conclusiones /Importancia
La berberina puede regular a la baja eficacia RAD51 en conferir la radiosensibilidad de las células de cáncer de esófago. Su aplicación clínica como coadyuvante en quimioterapia y radioterapia de ser objeto de estudio los cánceres de esófago
Visto:. Liu Q, H Jiang, Liu Z, Wang Y, Zhao M, Hao C, et al. (2011) Las células berberina Radiosensitizes cáncer del esófago humano mediante la regulación negativa proteína homóloga La recombinación de reparación RAD51. PLoS ONE 6 (8): e23427. doi: 10.1371 /journal.pone.0023427
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: Diciembre 21, 2010; Aceptado: 17 Julio 2011; Publicado: 8 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China; Ministerio de Ciencia y Tecnología de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
esofágica carcinomas de células escamosas (CECA), que tienen una incidencia particularmente alta en los países de Asia oriental, por lo general tienen un mal pronóstico. Sólo una tasa de supervivencia a 5 años del 4% se registró con la atención quirúrgica [1]. La radioterapia mostró un resultado similar [2]. La tasa de supervivencia de los pacientes con ESCC se puede mejorar de manera significativa con la quimioterapia y la radiación combinada [3], [4]. Sin embargo, el aumento de la dosis de radiación no tiene los resultados más satisfactorios [5]. Sigue existiendo la necesidad de desarrollar agentes que confieren la quimioterapia y la radiosensibilidad de forma selectiva en las células cancerosas, mientras que tiene toxicidad de la radiación mínima para las células normales. Aunque varios sensibilizadores de radiación han sido probados, incluyendo agentes que se dirigen a dianas de ADN o no de ADN, el sensibilizador a la radiación ideales que queda por descubrir [6].
La berberina, el componente principal alcaloide de Huang Lian y otras hierbas medicinales , es el medicamento más comúnmente utilizado para el malestar gastrointestinal en china. Además de su uso común como un medicamento diariamente, un número de estudios de laboratorio han demostrado que la berberina tiene actividad antitumoral para una amplia variedad de células cancerosas, incluyendo glioblastoma [7], el cáncer oral [8], hepatoma [9], cáncer gástrico [10 ], cáncer de próstata [11], leucemia [12] y osteosarcoma [13]. En la mayoría de los casos, se encontró que la berberina para inhibir la progresión del ciclo celular e inducir la apoptosis. Un estudio reciente mostró que la berberina fue capaz de suprimir la activación constitutiva de NF-kB en algunas células del cáncer [14], donde se encontró que inhibe directamente la activación de I? B quinasa (IKK), que conduce a la supresión de la fosforilación y translocación nuclear de p65 . La berberina también se informó de que un efecto radiosensibilizador de células de cáncer de pulmón mediante la inducción de la autofagia [15]. Además, la berberina puede poner en peligro el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis [16].
anteriormente mostró que la berberina puede inhibir la proliferación de células cancerosas mediante la inducción de ADN de doble filamento se rompe (DSBs). La berberina, que emite una fluorescencia amarillenta, se encontró que se acumulado más intensamente en los núcleos de células de osteosarcoma que en los de los osteoblastos normales, y esta acumulación diferencial de berberina se correlaciona a su efecto inhibidor del crecimiento, a la inducción de daño en el ADN, y posteriormente a la activación de p53 y la detención del ciclo celular [13]. Por lo tanto, la vía de transducción de señales que subyace en el efecto antitumoral de la berberina es probablemente similar a las iniciadas por otros agentes que dañan el ADN, tales como cisplatino. Un informe reciente mostró que la berberina puede regular por incremento de p53 mediante la interrupción de las interacciones MDM2-DAX-HAUSP y promover la auto-MDM2 ubiquitinación y la degradación [17].
Estamos aquí informe que la berberina a bajas concentraciones puede radiosensibilizar significativamente la CECA Células. Hemos demostrado que el efecto radiosensibilizador de berberina está mediada por la regulación a la baja de
RAD51
, que codifica una proteína crítica en la reparación de recombinación homóloga. Además, se observó que
RAD51
fue comúnmente sobre-expresan en tejidos humanos CECA, lo que indica que es necesario regular a la baja RAD51 para lograr una alta radiactividad o eficacia de la quimioterapia de la CECA en la clínica, debido a la sobreexpresión de
RAD51
es conocido para conferir la quimio-resistencia radio y.
resultados
berberina sensibiliza a las células de cáncer de esófago a la radiación ionizante
Como se informó anteriormente para otros tipos de células cancerosas, tratamiento berberina solo tuvo un efecto inhibidor del crecimiento sobre las células de cáncer de esófago de una manera dosis-y dependiente del tiempo (Fig. 1A). En comparación con los fibroblastos normales humanos (HNF), las células CECA son más sensibles a la berberina. A las 72 h, la IC50 para células CECA KYSE450 (12,58 M), era aproximadamente una cuarta parte de la de HNF (51,28 M) (fig. 1B). A bajas concentraciones (& lt; 15 m), la berberina tenía una toxicidad relativamente baja para las células CECA y no indujo apoptosis detectable (Fig 1C.). Sin embargo, las células CECA que fueron pretratados con bajas concentraciones de berberina exhiben un aumento significativo de la sensibilidad a la radiación ionizante, como se refleja en la notable disminución en su capacidad de formar colonias (Fig. 2). pretratamiento berberina (15 M, 24 h) redujo la SF2 (fracción de supervivencia a 2 Gy) de KYSE30 células a 48,1 ± 0,6%, de 77,2 ± 1,2% en las células que no se pretrataron con berberina. Una segunda línea de ESCC KYSE450 mostraron una respuesta similar, con la SF2 redujo a 50,2 ± 2,1% cuando las células fueron pretratadas con berberina a 15 mM durante 48 h, en comparación con 81.2 ± 2.6% para las células no tratadas previamente con berberina. En contraste, la berberina no tuvo ningún efecto radiosensibilizador en los fibroblastos normales humanos (Fig. 2)
.
(A), Efecto de la berberina en la viabilidad de las células KYSE30, KYSE450 y HNF. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. Las células se trataron con DMSO o las concentraciones indicadas de berberina durante 24 h, 48 h y 72 h. Los resultados se representan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (B), la citotoxicidad de la berberina contra las células KYSE30, KYSE450 y HNF representados por las concentraciones inhibitorias de CI50. (C), la medición de la apoptosis mediante análisis de transferencia Western de la caspasa-3. KYSE30 y KYSE450 células fueron tratadas con berberina durante 24 h y 48 h, respectivamente. Las células HL-60 y HeLa tratadas con paclitaxel como control positivo.
(A), Radiosensibilización por berberina mediante ensayo clonogénico de supervivencia celular. KYSE30 y KYSE450 células fueron expuestas a la berberina (15 M) o control de vehículo (DMSO) durante 24 y 48 h, respectivamente, antes de que se irradiaron y se sembraron. células de fibroblastos humanos normales fueron tratados con berberina durante 24 hy 48 h antes de ser expuestos a los rayos X. Los puntos de datos son los promedios de dos experimentos independientes por triplicado cada chapado en; bares, SE. (B), los valores de SF2 después del tratamiento con la berberina. Disminución en los valores de SF2 indica los efectos de la berberina radiosensibilizadores.
pretratamiento berberina prolonga la persistencia de las DSB inducidos por la radiación
radiación
ionizante mata a las células mediante la imposición de diversos tipos de daños en el genoma . Especulamos que el efecto radiosensibilizador de berberina en las células cancerosas puede ser causada por la alteración en la reparación de ADN de doble filamento se rompe (DSBs). Por lo tanto, determinamos los niveles de DSBs por tinción de inmunofluorescencia de focos γ-H2AX en ESCCs en diferentes puntos de tiempo después de la exposición a los rayos X. Como se muestra en la Fig. 3A, en KYSE30 células no pretratado con berberina, la mayoría de los focos gamma-H2AX se limpiaron a 12 h después de la exposición a 0,5 Gy de rayos X, y el número medio de γ-H2AX focos disminuyó a nivel basal cerca a 24 h. Por el contrario, más γ-H2AX focos persistió en esos dos puntos de tiempo en KYSE30 células que fueron tratadas previamente con berberina (15 M). El número medio de focos γ-H2AX por célula en las células que reciben el tratamiento berberina /radiación combinada fue significativamente mayor en comparación con la radiación de sólo grupo a los 12 y 24 puntos de tiempo h (Fig. 3B) (
P =
0,002, y
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). tratamiento berberina por sí sola no se observó para inducir daño en el DNA obvio en términos de inducción de γ-H2AX focos sobre los controles no tratados (
P
= 0,081).
(A), tinción de inmunofluorescencia de γ-H2AX en KYSE30 células. (B), Resumen de focos γ-H2AX en KYSE30 células en diferentes puntos de tiempo después de diversos tratamientos. (C), Resumen de focos γ-H2AX en KYSE450 células en diferentes puntos de tiempo después de diversos tratamientos. Columnas, medios de tres experimentos independientes. Las células que crecen en cubreobjetos en placas de 6 pocillos fueron expuestos a la berberina (15 M) durante 24, irradiados (0,5 Gy), y se fijaron en los puntos temporales especificados para el análisis de inmunofluorescencia.
KYSE450 células también mostraron un espacio libre retardada de los focos γ-H2AX inducida por los rayos X cuando se pretrataron con berberina. Mientras que la mayoría de los focos gamma-H2AX se limpiaron en células de control a las 24 h después de la exposición a los rayos X, más de la mitad de la γ-H2AX focos persistieron en las células que se pretrataron con berberina (Fig. 3C). Estos resultados indican que el tratamiento previo berberina deteriora la reparación de DSB-x inducidos por los rayos.
berberina downregulates RAD51 en las células cancerosas pero no en células no malignas
DSB se reparan principalmente por dos vías, es decir, unión de los extremos no homólogos y la recombinación homóloga [18], [19], [20]. Ku70 y Ku86 son esenciales para el primero, donde como RAD51 es un actor central de este último. A continuación se determinó si los niveles de estas tres proteínas fueron cambiados en las células de cáncer de esófago tratados previamente con berberina. Observamos que mientras que no hubo cambios evidentes en los niveles de Ku70 y Ku86, el nivel de proteína RAD51 se redujo notablemente en ESCCs que fueron tratados con la berberina durante 24 h o 48 h en 7,5 M o 15 mM (Fig. 4A). El nivel de
RAD51
mRNA mostró una reducción significativa en las dos líneas celulares de cáncer después del tratamiento con la berberina (Fig. 4B), lo que sugiere que la regulación a la baja de RAD51 fue probablemente debido a la disminución de la transcripción de
RAD51
mRNA.
(A), los niveles de proteínas de reparación del ADN en las células de cáncer de esófago tratados con berberina. Las células se trataron con berberina a las concentraciones indicadas y por la duración indicada antes de las células se prepararon para los extractos celulares. (B), la disminución de
RAD51
niveles de mRNA después de la exposición berberina. Las células se expusieron a la berberina (15 M) durante 24 h para KYSE30 células (48 h para KYSE450 células), y se recogieron para cuantitativa en tiempo real de análisis PCR de la RAD51 /relaciones de GAPDH ARNm. (C),
RAD51
actividad promotora fue suprimida por la berberina en KYSE30 y KYSE450 células. Los plásmidos informadores pGL3-RAD51p luciferasa (luciérnaga) se transfectaron transitoriamente en células de cáncer de esófago humanos. Cuatro horas más tarde, las células fueron tratadas con berberina durante 24 h, y después se ensayó la actividad de luciferasa. Firefly luciferase valores se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla de una PRL-SV40 vector de control co-transfectadas. Cada valor representa la media SE de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó utilizando
prueba de la t de Student para datos independientes. *
, P & lt; 0,05 en comparación con los valores de control. (D), la falta de RAD51 regulación a la baja en las células no malignas. Las células fueron expuestas a la berberina (15 M) para el período de tiempo especificado y se recogieron para el análisis de inmunoblot. (E), regulación a la baja de RAD51 en otros tipos de células cancerosas. Las células fueron expuestas a la concentración berberina designada durante 48 h y se recogieron para el análisis de inmunotransferencia. Las inmunotransferencias se muestran en A, D, y E son representativos de al menos dos experimentos independientes con GAPDH que sirve como control de carga de proteínas. C indica cultivos expuestos a la DMSO control del vehículo.
La expresión de RAD51 se sabe que es dependiente del ciclo celular y es mayor en las fases S y M que en la fase G0 /G2 /G1 [21] , [22]. Para determinar si la reducción de la expresión de RAD51 fue debido al cambio en la distribución del ciclo celular en las células tratadas con berberina, sometimos células berberina tratada para citometría de flujo análisis. Mientras que el tratamiento berberina (15 m para 24 h) redujo el porcentaje de KYSE30 células en S y G2 /M a 49% a partir de 60% en el control (datos no mostrados), tal cambio no fue suficiente para dar cuenta de los muchos veces en la reducción el nivel de expresión RAD51. Más importante aún, el tratamiento berberina (15 M durante 24 h) no alteró significativamente la distribución de la distribución del ciclo celular de KYSE450 células (44% y 45% para el porcentaje de células en S-G2 /M fases en el control y el grupo tratado, respectivamente ), lo que indica que la reducción de la expresión de RAD51 en respuesta a la berberina no es debido a la reducción de tamaño de la población de células en S y G2 /M fases. Por lo tanto, la regulación a la baja de RAD51 en respuesta a la berberina es probablemente independiente de los cambios de expresión que se asocian con la progresión del ciclo celular
.
La sobreexpresión de
RAD51
se asocia frecuentemente con un aumento de su actividad promotora [23]. A continuación clonado el promotor y la región del extremo 5 'de
RAD51 gratis (-1693 a 487 pb) en un plásmido informador de luciferasa, vector pGL3-básico, ellos se transfectaron en células de cáncer de esófago, y se probaron los
RAD51
la actividad del promotor en respuesta al tratamiento berberina. Como se muestra en la Fig. 4C, la actividad del promotor de
RAD51
se redujo significativamente en las células que fueron tratadas con la berberina en comparación con el control. En conjunto, estos resultados muestran que la berberina fue capaz de regular negativamente la expresión de
Rad5
1 en células de cáncer de esófago a nivel de transcripción.
Debido a RAD51 es un jugador clave en la reparación de recombinación homóloga, su regulación a la baja podría contribuir a la radiosensibilidad de las células pretratadas con CECA berberina. Desde berberina no tuvo ningún efecto radiosensibilizador en HNF, especuló que el nivel de RAD51 podría no ser afectada por el tratamiento berberina en HNF. En primer lugar, encuestamos a los niveles basales de RAD51 en varias líneas de células no malignas incluyendo HNF. Como se muestra en la Fig. 4D, los niveles de RAD51 fueron mucho menores en HNF, hMSC (células madre mesenquimatosas humanas derivadas de cordón umbilical) y XWXL (fibroblastos derivados de un fibroadenoma benigno) que los de las células CECA. Curiosamente, las células humanas umbilicales vasculares endoteliales (HUVEC) y células HEK-293 también expresaron altos niveles de RAD51. Sin embargo, en contraste con las células CECA, ninguno de los cuatro tipos de células no malignas mostró una regulación a la baja en la expresión de RAD51 en el tratamiento berberina (Fig. 4D).
Para determinar si la regulación a la baja de RAD51 por la berberina se aplica a otros tipos de las células cancerosas, también expusieron células de cáncer de mama humano MCF7, células de osteosarcoma humano U2OS, células de cáncer de próstata de ratón RM-1 y las células de cáncer de pulmón de ratón LLC a bajas concentraciones de berberina durante 48 horas y se midió el nivel de proteínas de RAD51. Como se muestra en la Fig. 4E, RAD51 se downregulated en todos esos cuatro líneas celulares de cáncer probadas, lo que sugiere que la regulación por disminución de RAD51 por berberina no es única para las células CECA. En conjunto, estos resultados indican que los diferentes tipos de células pueden responder de manera diferente al tratamiento berberina en cuanto a la regulación de la expresión RAD51.
Regulación al alza de RAD51 por IR puede ser atenuada por la berberina
Hemos observado que ionizante la radiación indujo una regulación de RAD51 en las células CECA (Fig. 5A). En consonancia con el aumento de RAD51 a nivel de proteína, el nivel de
RAD51
ARNm se incrementó en las células CECA que había sido expuesto a IR (datos no mostrados). Esta conclusión está de acuerdo con un informe previo de inducción RAD51 por IR en las células de glioma [24]. Debido a que el IR puede regular al alza la expresión de
RAD51
, próximo a prueba si el tratamiento previo berberina podría contrarrestar este efecto de IR. Las células CECA fueron tratados primero con berberina, a continuación, con IR y se midió el nivel de expresión de RAD51. En contraste con la elevación de RAD51 en las células que fueron tratados con IR por sí solo, el tratamiento previo berberina atenúa eficazmente la sobre regulación de RAD51 inducida por IR (Fig. 5B), lo que indica que la berberina fue capaz de superar la regulación por incremento de RAD51 inducida por IR. No sólo hubo una reducción en el nivel de proteína total, la formación de focos RAD51 en respuesta a la IR se inhibió en gran medida por la berberina (Fig. 5C). La regulación a la baja de RAD51 por la berberina se refleja de nuevo en el nivel de transcripción (Fig. 5D).
(A), la radiación aumenta la expresión de RAD51 en las células tumorales. Las células se expusieron a las dosis indicadas de la radiación y se recogieron 24 h más tarde para el análisis de inmunotransferencia. (B), cambio de los niveles de proteína RAD51 en respuesta a la berberina y la radiación. Las células se trataron previamente con berberina (15 M) durante 24 h antes de ser irradiado con 6 Gy de rayos-X. Las células se recogieron para el análisis de inmunotransferencia a las 24 h después de la irradiación. (C), la inhibición de la formación de focos RAD51 radiación inducida por la berberina. Se muestra son imágenes de inmunofluorescencia de KYSE30 y KYSE450 células teñidas con el anticuerpo anti-RAD51 después de 24 h de pretratamiento con berberina, a las 24 h después de la irradiación con 6 Gy de rayos-X. DAPI mostró counterstaining los núcleos. (D),
RAD51
los niveles de ARNm después del pretratamiento con berberina (15 M) durante 24 h (KYSE30) o 48 h (KYSE450) antes de la irradiación con 6 Gy. Las células se recogieron por cuantitativa en tiempo real PCR análisis de la RAD51 /ratios de GAPDH mRNA a las 24 horas después de la exposición a 6 Gy de rayos-X. Inmunotransferencias y los valores de expresión de ARNm son representativos de al menos dos experimentos independientes.
RAD51 regulación a la baja de RNAi radiosensitizes células cancerosas
Debido a que la berberina puede afectar a muchas vías celulares que están involucrados en la proliferación celular y supervivencia, no se puede descartar que las vías distintas de la regulación a la baja de RAD51 fueron responsables para el efecto radiosensibilizador de berbeirne. Para demostrar que se trata de la regulación a la baja de RAD51 que es responsable de este efecto de la berberina, el próximo agotados RAD51 en células de cáncer de esófago por RNAi y probamos su radiosensibilidad. Como se muestra en la Fig. 6A,
RAD51
expresión podría ser silenciado de manera eficiente por siRNA dirigidos específicamente
RAD51
en ambas líneas celulares. Además, la formación espontánea de RAD51 focos se redujo considerablemente (Fig. 6B). Como era de esperar, el agotamiento de RAD51 condujo a una reducción significativa en la supervivencia de células clonogénicas para ambas líneas celulares de cáncer de esófago (Fig. 6C). El SF2 se redujo a 33,3 ± 0,4% en las células RAD51-RNAi KYSE30 de 78,4 ± 1,2% en el control. KYSE450 células mostraron una respuesta similar a la depleción de RAD51. Por lo tanto, el efecto radiosensibilizador de berberina en las células del esófago estaba mediada principalmente por la regulación a la baja de RAD51.
(A), regulación a la baja de RAD51 de siRNA. los niveles de proteína RAD51 se midieron mediante transferencia Western. KYSE30 y KYSE450 células se transfectaron con ARNsi dúplex (200 nM) específicos a
RAD51
o oligo negativo en medio libre de suero durante 4 h, luego se reemplaza con medio completo durante 24 h. Los extractos celulares se recogieron para el análisis de Western blot utilizando anticuerpos RAD51. (SEGUNDO). formación de focos de RAD51 inducida por la radiación reducida en las células de cáncer de esófago en el que
RAD51
fue silenciado por RNAi. Las células se expusieron a 6 Gy de rayos X a 28 h después de la transfección con dúplex de siRNA. (C), Efecto de RAD51 caída en la radiosensibilidad de las células de cáncer de esófago como se determina por ensayo de supervivencia clonogénico. (D), el análisis de transferencia Western de la proteína RAD51 en células de cáncer que fueron transfectadas con pcDNA3.1 o pcDNA3.1B-mRAD51. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de dos experimentos independientes con GAPDH que sirve como control de carga de proteínas (línea celular KYSE30 /KYSE450 padres, células establemente transfectadas con pcDNA3.1 KYSE30 /KYSE450 (pcDNA3.1), las células KYSE30 /KYSE450 (mRAD51) transfectadas de forma estable con pcDNA3.1B-mRAD51). (E), Efecto de la sobreexpresión de RAD51 en la radiosensibilidad de las células de cáncer de esófago, determinado por ensayo de supervivencia clonogénico. Se compararon los resultados para las células transfectadas con el vector pcDNA3.1 mRAD51 o tratado con berberina (* P & lt; 0,01).
Introducción de RAD51 exógena contrarresta el efecto radiosensibilizador de berberina
a fin de validar el papel de RAD51 como un jugador clave en la mediación del efecto radiosensibilizador de berberina, hemos hecho un constructo que expresa RAD51 murino bajo el promotor CMV, pcDNA3.1B-mRAD51, y tenía células transfectadas de forma estable CECA. Expresión de la RAD51 exógeno fue evidente en las células transfectadas con mRAD51, como se muestra mediante transferencia Western (Fig. 6D). Es importante destacar que el efecto radiosensibilizador de la berberina se atenuó significativamente en ambas líneas celulares KYSE30 y KYSE450 que fueron transfectadas con mRAD51 (Fig. 6E). Estos resultados, junto con los obtenidos con RAD51-RNAi, demostraron que RAD51 es un determinante crítico de radioresistance en las células CECA.
sobreexpresión de RAD51 es común en los tejidos de cáncer de esófago
La regulación positiva de
RAD51
expresión es común en líneas de células tumorales [25] y en una serie de tumores malignos humanos [26], [27], [28]. Seguidamente, evaluó el
RAD51
nivel de expresión en un panel de 86 tejidos escamosas de esófago primarias humanas de carcinoma de células por tinción inmunohistoquímica. tinción nuclear y /o citoplásmico de RAD51 se detectó en 81 de 86 muestras. En las muestras que presentan tinción positiva de RAD51, distribución subcelular y la intensidad se variaron. La intensidad se puntuó como 1 en 29, en 43 2, 3 y 9. Seis de las muestras mostraron tinción nuclear predominante, 30 muestras mostraron tinción citoplasmática predominante, y 45 muestras mostraron tanto la tinción citoplasmática y nuclear (Fig. 7A-E). Por el contrario,
RAD51
expresión fue baja o ausente en los tejidos normales que rodean el carcinoma (Fig.7F). Sin embargo, hemos encontrado ninguna correlación entre los niveles de expresión RAD51 y los parámetros clínico en ESCCs (Tabla 1). Sin embargo, nuestros resultados mostraron que RAD51 es comúnmente sobreexpresa en especímenes CECA. Debido a que la sobreexpresión de RAD51 generalmente confiere resistencia a los agentes que dañan el ADN [29], [30], [31], nuestros resultados exigen medidas que regulan negativamente RAD51 con el fin de alcanzar una alta radiactividad o eficacia de la quimioterapia de ESCCs en el ámbito clínico. Curiosamente, el tratamiento berberina también el regulado RAD51 en tres líneas adicionales de esófago de células de cáncer (KYSE410, EC109, y TE-1), como en KYSE30 y KYSE450 células (datos no presentados), lo que sugiere que la berberina puede hacer efecto radiosensibilizador a una amplia matriz de células de cáncer de esófago.
se muestran imágenes de muestra diferente nivel de expresión y distribución celular. (A), la ausencia de tinción (núcleos azules debido a contratinción hemalum de Mayer)-RAD51 específico. (B), bajos niveles de RAD51 en el citoplasma, pero no en los núcleos, de las células de carcinoma invasivo. (C), los niveles intermedios de RAD51, tanto en el citoplasma y núcleos de las células de carcinoma invasivo. (D), los altos niveles de RAD51 en el citoplasma, pero no en los núcleos, de las células de carcinoma invasivo. (E), los altos niveles de RAD51 nuclear en los núcleos de células de carcinoma invasivo. No tinción citoplasma es evidente. (F), la ausencia de tinción de RAD51 en tejido esofágico normal. La inmunohistoquímica se realizó como en Materiales y Métodos. Todas las imágenes originales fueron capturados en 400 × magnificación.
Discusión
Hemos demostrado por primera vez que la berberina puede regular a la baja de manera eficiente la expresión RAD51 en las células cancerosas en conferir radiosensibilidad. tratamiento berberina condujo a una reducción en
RAD51
transcripción y una inhibición de
RAD51
actividad promotora. También se puede superar la regulación por incremento de RAD51 que es inducida por la radiación (IR) ionizante. El efecto radiosensibilizador de berberina fue atenuada en las células cancerosas que sobreexpresan RAD51 exógeno. Regulación a la baja de RAD51, que es esencial para la reparación de recombinación homóloga, afectada en gran medida la reparación de DSBs inducidas por IR y condujo a una mala supervivencia de las células tratadas con IR. Es importante destacar que se observó que RAD51 fue comúnmente upregulated en los tejidos humanos CECA, que puedan anular resistencia a las terapias que se dirigen a ADN. Por lo tanto, la administración de berberina como una radio y quimiosensibilizador puede servir como una estrategia en el tratamiento de pacientes CECA.
Upregulation de RAD51 en células de cáncer ha demostrado ser asociado con un aumento de la quimiorresistencia [29], [30] . Varios estudios anteriores también mostraron que algunos fármacos contra el cáncer hacen que las células cancerosas sensibles a la radiación y sensible a la quimioterapia mediante la regulación negativa RAD51 y, por consiguiente menoscabo de la reparación de recombinación homóloga en células de cáncer. Por ejemplo, imatinib (Gleevec), que inhibe la c-Abl tirosina quinasa, puede reducir de manera eficiente la expresión de RAD51 en las células cancerosas y conferir radiosensibilidad [24], [32]. Gefitinib, un inhibidor de crecimiento epidérmico receptor del factor selectivo de la tirosina quinasa, se encontró que era regular a la baja RAD51 en células de cáncer de pulmón y de sensibilizarlos a la mitomicina C [33] y gemcitabina [34]. Fenil ácido hidroxámico PCI-24781, un inhibidor de la histona desacetilasa que tiene un efecto radiosensibilizador en las células cancerosas, también actúa mediante la regulación negativa RAD51 [35]. Además de tener una serie de efectos secundarios, estos medicamentos tienden a ser muy costoso.
Muchos productos naturales tienen valores medicinales notables. Además de ser más asequible, hierbas medicinales suelen tener una baja toxicidad. Varios compuestos naturales se han encontrado para conferir radiosensibilidad y quimiosensibilidad en células cancerosas. Un estudio demostró que la curcumina, un componente de la cúrcuma (
Curcuma longa
), podría radiosensibilizar células de cáncer de próstata a través de la inhibición de la función NFkB, lo que llevó a una regulación a la baja de los genes anti-apoptóticos
Bcl-2
[36]. El tratamiento de células de cáncer cervical con la curcumina condujo a una mayor producción de especies reactivas del oxígeno de IR inducida (ROS), que causa la activación sostenida ERK1 /2-MAPK [37]. En contraste, se informó emodina, una sustancia que se encuentra en algunas plantas, incluyendo el ruibarbo, para inhibir la activación de ERK1 /2 en células de cáncer de pulmón, que a su vez conduce a una regulación a la baja de RAD51 y confiere quimiosensibilidad [38], [39].
Huang Lian es una de las hierbas medicinales más utilizadas en china. Es una de las 12 hierbas medicinales utilizadas más comúnmente en los Estados Unidos [40]. Además de su uso común como un medicamento para el malestar gastrointestinal, la berberina se ha probado en ensayos clínicos de diabetes mellitus tipo 2 [41], [42] y en la hipercolesterolemia [43]. Es importante destacar que los pacientes que toman la experiencia berberina efectos secundarios relativamente leves. Mientras que los estudios anteriores mostraron que la berberina posee efectos directos anti-tumorales mediante la inducción de la producción de especies reactivas del oxígeno en las células cancerosas, lo que presumiblemente conferir radiosensibilización [44], [45], [46], [47], nuestro estudio es el primero para mostrar que la berberina puede conferir radiosensibilidad por la regulación negativa de un jugador clave en la reparación de DSB. Debe tenerse en cuenta que la potencia de la berberina en la regulación negativa de RAD51 en células CECA es comparable a la de Gleevec en células de glioma [24]. En concentraciones más altas, se espera que la berberina para desempeñar un doble papel en la promoción de la muerte de las células en las que se retiene, infligiendo daños en el ADN simultáneamente y menoscabar una vía que es responsable de la reparación de los daños. Es importante destacar que, a concentraciones que confieren la radiosensibilidad de las células de cáncer de esófago, la berberina no tuvo ningún efecto radiosensibilizador en fibroblastos humanos normales. En consecuencia, no se observó berberina para regular a la baja RAD51 en las células no malignas. Estos resultados sugieren que el efecto radiosensibilizador de berberina puede ser específico para las células cancerosas.
En resumen, hemos demostrado que la berberina a bajas concentraciones radiosensitized sustancialmente las células de carcinoma de células escamosas de esófago. Actúa mediante la regulación negativa RAD51, un jugador clave en la reparación de recombinación homóloga, dando lugar a pérdida de valor en la reparación de roturas de doble hebra. Nuestros resultados revelaron una actividad biológica hasta ahora no reconocido de un fármaco comúnmente usado y barato e indicaron que la berberina, con su relativamente baja toxicidad, se puede utilizar como un adyuvante en la terapia de radiación del cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los procedimientos que implican muestras clínicas fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong.
Líneas celulares
Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2. El carcinoma de células escamosas de esófago humano (CECA) líneas KYSE30, KYSE450, KYSE410, EC109 y TE-1 se obtuvieron del Instituto del Cáncer & amp; Hospital, Academia China de Ciencias Médicas (Beijing) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 unidades /ml y 100 mg /ml de estreptomicina. KYSE30, KYSE450 y KYSE410 se generaron originalmente por el Dr. Yutaka Shimada, se obtuvieron células normales de fibroblastos humanos (NHF), del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas (Beijing), y se mantuvieron en DMEM complementado con un 10% del feto de suero bovino, 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina y 4 g /ml bFGF. HUVECs se obtuvieron de ATCC. Las células madre mesenquimales derivadas de cordón umbilical humano fueron un regalo del Dr. Li Dong, Hospital Qilu, la Universidad de Shandong. Fibroblastos (XWXL) se establecieron a partir de un fibroadenoma extirpado quirúrgicamente, con el consentimiento informado del paciente y aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Shandong.