Extracto
Antecedentes
El cáncer gástrico es una de las la mayoría de las enfermedades malignas comunes en todo el mundo. Nuevas pruebas han demostrado que los microRNA (miRNA) están asociados con el desarrollo y progresión del tumor. Nuestros estudios previos han revelado que
H. pylori
infección fue capaz de inducir la expresión alterada de miR-30b en las células epiteliales gástricas. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel potencial de miR-30b en el cáncer gástrico.
Métodos
Se analizó la expresión de miR-30b en líneas celulares de cáncer gástrico y cáncer gástrico tejidos humanos. Se examinó el efecto de imita miR-30b en la apoptosis de células de cáncer gástrico in vitro por citometría de flujo (FCM) y los ensayos de caspasa-3/7 de actividad. Se utilizó un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo para determinar si miR-30b está implicado en la tumorigénesis del cáncer gástrico. El objetivo de miR-30b fue identificado por análisis de la bioinformática, ensayo de luciferasa y Western blot. Por último, se realizó el análisis de correlación entre el miR-30b y su objetivo expresión en el cáncer gástrico.
Resultados
miR-30b fue significativamente las reguladas en las células de cáncer gástrico y cáncer gástrico tejidos humanos. expresión forzada de miR-30b promovió la apoptosis de células de cáncer gástrico in vitro, y miR-30b podría inhibir significativamente la tumorigenicidad de cáncer gástrico mediante el aumento de la proporción de la apoptosis de las células cancerosas in vivo. Por otra parte, el activador de plasminógeno inhibidor-1 (PAI-1) fue identificado como el objetivo potencial de miR-30b, y el nivel de miR-30b se correlacionó inversamente con PAI-1 expresión en el cáncer gástrico. Además, el silenciamiento de PAI-1 fue capaz de phenocopy el efecto de la sobreexpresión de miR-30b en la regulación de la apoptosis de las células cancerosas, y la sobreexpresión de PAI-1 podría suprimido el efecto de promover la apoptosis de células por miR-30b, indicando PAI-1 es potencialmente implicados en la apoptosis inducida por miR-30b en las células cancerosas.
Conclusión
miR-30b puede funcionar como un nuevo gen supresor de tumores en el cáncer gástrico por la orientación PAI-1 y la regulación de la apoptosis de Células cancerígenas. miR-30b podría servir como un biomarcador potencial y diana terapéutica contra el cáncer gástrico
Visto:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, abajo-regulada en el cáncer gástrico, promueve la apoptosis y suprime el crecimiento tumoral Focalización del inhibidor del activador del plasminógeno-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049
Editor: Gerolama Condorelli, Universidad Federico II de Nápoles, Italia, Italia |
Recibido: May 7, 2014; Aceptado: 28 Julio 2014; Publicado: 29 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81202310), la Ciencia de la Fundación de Investigación de Innovación de la Tercera Universidad Médica Militar (Nº 2009XQN20). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico causa alrededor de 738.000 muertes en todo el mundo por año, y que ha sido reconocida como la tercera causa de muerte por cáncer en los hombres [1]. diagnóstico y tratamiento tempranos han dado lugar a excelentes expectativas para la supervivencia a largo plazo y de buen pronóstico, mientras que el pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico avanzado sigue siendo pobre. Al igual que otros tipos de cáncer, se cree que el desarrollo de cáncer gástrico ser multifactorial.
Helicobacter pylori (H. Pylori)
infección ha sido reconocido como un disparador importante de cáncer gástrico [2]. Aunque muchos cambios genéticos y epigenéticos se han reportado en el cáncer gástrico, el mecanismo molecular subyacente al desarrollo de cáncer gástrico sigue siendo poco clara.
microRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes que posttranscriptionally regulan la expresión génica. miRNAs madura puede unirse específicamente a 3 'UTRs de ARNm diana celular a su vez desencadenar la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción [3], [4]. miRNAs actúan como reguladores clave en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación celular, la apoptosis, el metabolismo, y la transducción de señales [5], [6]. Se ha demostrado que el 50% de miRNAs son frecuentemente encuentra en regiones genómicas asociadas con el cáncer o en sitios frágiles [7]. La creciente evidencia ha demostrado que miRNAs aberrantes expresión se correlaciona con varios cánceres humanos y se indica que miRNAs pueden funcionar como oncogenes o genes supresores de tumores [8] - [10]. Recientemente, un número sustancial de miRNAs desregulados incluyendo el miR 106b-25-clúster, miR-21, miR-218, miR-7, y miR-335 han sido identificados como moduladores del crecimiento celular, la apoptosis, migración o invasión en el cáncer gástrico desarrollo [11] - [15]. Estos hallazgos sugieren que los miRNAs pueden desempeñar un papel crucial en la patogénesis del cáncer gástrico.
Nuestros estudios previos han revelado que
H. pylori
infección fue capaz de inducir la expresión alterada de miRNAs en células epiteliales gástricas incluyendo el miR-155, miR-146a y miR-30b, miRNAs pueden funcionar como nuevos reguladores negativos para afinar
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la inflamación inducida [16], [17]. Por otra parte, hemos demostrado que miR-146a puede jugar un papel potencial en el desarrollo de cáncer gástrico mediante la modulación de la proliferación y la apoptosis de las células de cáncer gástrico [18]. Cabe destacar, también encontramos el miR-30b podría regular el proceso de autofagia durante el
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persiste la infección, lo que contribuye a la persistencia de
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infecciones [19]. Sin embargo, el papel de miR-30b en el cáncer gástrico es todavía en gran parte desconocida.
plasminógeno inhibidor del activador 1 (PAI-1) es el principal inhibidor de serina proteasa de tipo tisular (t-PA) y de tipo uroquinasa ( u-PA) del activador del plasminógeno y por lo tanto juega un papel importante en el sistema del plasminógeno-plasmina [20]. Estudios anteriores han ilustrado PAI-1 es un factor de mal pronóstico en varios tumores comunes, y está asociada con la invasión del cáncer y la metástasis [21]. Recientemente, muchos grupos han encontrado también que PAI-1 puede promover el crecimiento del tumor a través de la inhibición de la apoptosis de las células. Por ejemplo, la adición de un establo de tipo salvaje PAI-1 a la línea celular de cáncer de próstata humano PC-3, la línea promielocítica de células de leucemia humana incluso células no tumorales HL-60 y, resultó en una inhibición significativa de la apoptosis [22] . Cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos con PAI-1 que sobreexpresan las células de fibrosarcoma murino, los tumores se estableció rápidamente, mientras que PAI-1 en las células deficientes tenían una tumorigenicidad suprimida [23]. Otro informe mostró que, la inhibición genética y farmacológica de PAI-1 en líneas celulares de tumor humano (HT-1080, A549, HCT-116, y-MB-231 MDA) aumento de la apoptosis espontánea, y de manera interesante, implantado PAI-1 desmontables HT- 1080 células a ratones knockout de PAI-1 generado una disminución en la tumorigénesis y la supervivencia prolongada en comparación con los ratones de control [24]. Estos estudios proporcionan una evidencia importante que el PAI-1 ejerce un papel protector contra la apoptosis de las células tumorales.
En el estudio actual, se encontró que el miR-30b fue significativamente las reguladas en las células de cáncer gástrico y los tejidos tumorales. La expresión ectópica de miR-30b podría promover la apoptosis de células de cáncer gástrico in vitro, y miR-30b podría inhibir significativamente la tumorigenicidad de los cánceres gástricos en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo. Además, PAI-1 se identificó como los posibles objetivos de miR-30b y miR-30b puede inducir la apoptosis y suprimir el crecimiento tumoral mediante la represión de la expresión de PAI-1. Nuestros hallazgos sugieren que el miR-30b puede funcionar como un nuevo gen supresor tumoral en el cáncer gástrico y puede ser un objetivo potencial para la terapia del cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité ético y Experimental Animal de la Tercera Universidad médica Militar. Toda la cirugía de los animales se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. El estudio que incluyó muestras de tejido fue aprobado por la Junta de Revisión de Ética en la Tercera Universidad Médica Militar, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes antes de la participación.
Las muestras de tejido
En total, los tejidos de cáncer gástrico y tejidos no tumorales adyacentes fueron obtenidas de pacientes con cáncer gástrico primario sometidos a una gastrectomía radical en el hospital del suroeste, Tercera Universidad médica Militar, china y las características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer gástrico se resumen en la Tabla 1. Después de la extirpación quirúrgica, se congelaron los tejidos inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. El estudio fue aprobado por la junta de revisión ética en la Tercera Universidad Médica Militar, y el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes antes de la participación.
Líneas celulares y cultivo celular
Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio se obtuvieron de Shanghai Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), los humanos gástricos celulares de cáncer de líneas AGS se cultivó en F12 de Ham (Hyclone) medio con 10% de suero fetal bovino (FBS), otro tipo de cáncer gástrico líneas de células MKN45, HGC-27, BGC-823, SGC-7901 y de riñón embrionario humano (HEK) 293 células fueron cultivadas en DMEM (Hyclone) con 10% de FBS, todos ellos fueron mantenidos en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C como se describió previamente.
RT-PCR cuantitativa
el ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen), seguido de una transcripción inversa usando ensayos TaqMan miARN (Ambion), con U6 pequeños ARN nucleares como una referencia normalizada interna. reacciones QRT-PCR se realizaron con los siguientes parámetros: 95 ° C durante 2 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 30 s. análisis de QRT-PCR para el mRNA de PAI-1 se llevaron a cabo mediante el uso de kits PrimeScript RT-PCR (Takara), como los siguientes parámetros: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 5 s y 72ºC durante 30 s. El nivel de ARNm de β-actina se utilizó como control interno. Las secuencias de los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 2.
Northern blot
ARN de talla pequeña se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion). Tres pares de muestras clínicas fueron escogidos al azar de los 21 pacientes para el análisis de transferencia de Northern subsiguiente. transferencia de Northern se realizó de acuerdo al procedimiento estándar como descried anteriormente [17]. Las sondas de oligonucleótidos antisentido de ADN utilizados para detectar miR-30b y U6 snRNA fueron los siguientes: miR-30b (5'-AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') y U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')
transfección de la célula.
imita el miR-30b, revueltos miR-control, modificado químicamente dúplex de miR-30b (agomir), modificado químicamente revueltos miR-control, PAI-1 siRNA, o un control negativo siRNA fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai Co GenePharma . Ltd., china). PAI-1 (SERPINE1) ADNc humano ORF Clon fue adquirido de Origene (Origene Technologies, Beijing, China). Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
ensayo de apoptosis de la célula de FCM
células SGC-7901 o HGC-27 se sembraron en placas de 12 pocillos a una adecuada densidad y crecido a 30% de confluencia después de 24 h. Luego, las células fueron transfectadas con imita miR-30b o miR-control, y el medio fue reemplazado con DMEM libre de suero durante 48 h. Para el experimento de co-transfección con miR-30b y PAI-1 que expresa vector, las células SGC-7901 fueron transfectadas con imita de control de miR o miR-30b, y luego con PAI-1 humano cDNA ORF vector Clone (indicado como PAI-1) o vector vacío 24 h más tarde. 24 h después de la transfección del vector, el medio se reemplazó con DMEM libre de suero durante otras 24 h. Finalmente, se aplicaron las células para el análisis de la apoptosis. Para el análisis FCM, un kit de Anexina V-FITC de detección de apoptosis estaba acostumbrado I (BD Pharmingen), luego se analizaron mediante citometría de flujo (BD FACSCantoTM II).
caspasa-Glo 3/7 Ensayo
se detectó la actividad de la caspasa-3/7 usando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7 (Promega). Añadir 100 ml de la caspasa-Glo 3/7 reactivo para placa de 96 pocillos de paredes blancas, mezclar suavemente contenido de los pozos, y luego incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 min. La luminiscencia se detectó usando el GloMax-96 luminómetro de microplacas (Promega).
ensayos de tumorogénesis en ratones desnudos
Los ratones utilizados en este experimento se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Viable mimics- miR-30b y las células SGC-7901 de control transfectadas de miR (1 × 10
6) se suspendieron en 100 l de PBS y luego se inyecta por vía subcutánea en cada lado del flanco posterior de la misma hembra BALB /c atímicos ratón desnudo a las 4 a 6 semanas de edad como se describe anteriormente [25]. El crecimiento del tumor y la condición incluyendo la salud general y el comportamiento de los ratones fueron examinados cada tres días durante 4 semanas. Los ratones beared tumor no mostraron signos de dolor o malestar, tales como pérdida de peso o cambios de comportamiento, por lo que todos los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia en el día 28 después de la inyección. El volumen del tumor (V) se controló midiendo la longitud (L) y el ancho (W) con pinzas y se calcula con la fórmula (L x W
2) × 0,5.
tinción TUNEL
Los tumores fueron cosechadas a los 26 días, y se fijaron en solución de formaldehído al 10%, a continuación, se incluyó en parafina. Secciones (5 m de espesor) que había sido desparafinados y rehidratados fueron teñidas con hematoxilina y eosina. células tumorales apoptóticas se tiñeron por método in situ fin de etiquetado dUTP nick deoxynucleotidyltransferase mediada terminal (TUNEL) utilizando un kit de detección de muerte celular in situ (POD; Roche Diagnostics Co.). El control negativo fue sometido a la misma tinción de TUNEL sin TDT. Las imágenes se recogieron mediante el uso de microscopio con 200 × magnificación.
Construcción de plásmidos
La construcción de diversos vectores de luciferasa de informes para la meta de miR-30b se realizó tal como se describe anteriormente [16], [26] , y la construcción que contiene la región semilla mutante se generó como un control. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Tabla 2. Los experimentos
ensayo de luciferasa y GFP represión
Las células HEK-293 se sembraron en placas de 96 pocillos a 5.000 células por pocillo el día antes de la transfección. Las células fueron transfectadas con cada vector reportero de luciferasa de luciérnaga, luciferasa de Renilla el control de vectores, PRL-TK (Promega), e imita el miR-30b o miR-control (GenePharma). El ensayo de luciferasa se realizó utilizando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega).
Para los experimentos de GFP represión, HEK-293 células fueron sembradas en placas de 12 pocillos a 1 x 10
5 por el bien el día antes de la transfección y luego se cotransfectaron con los imitadores de miR-30b o miR-de control con varios vectores indicadores de GFP. Las células se sometieron a análisis de citometría de flujo, y se analizaron los datos mediante el uso de software CellQuest Pro.
Western blot
Las células tratadas se lavaron con PBS helado y después se lisaron por un tampón de lisis celular (Atravesar). Después de centrifugación a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C, la concentración de proteína se midió por el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). lisados de proteína celular se separaron en SDS gel de poliacrilamida desnaturalizado 12% y después se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con leche en polvo desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris, pH 7,4, que contiene 0,05% de Tween 20, y se incubaron con anticuerpos primarios para PAI-1 (1:1000, Abcam) y β-actina (1:1000 , Santa Cruz) a 4 ° C durante la noche, respectivamente. Las membranas se lavaron y se incubaron con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante secundarios (1:5000, Santa Cruz) según las instrucciones del fabricante. La proteína de interés se visualizó usando ECL Western Blot sustrato (Pierce) y el Sistema de Documentación ChemiDoc XRS gel (BioRad).
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (SD) de al menos tres experimentos independientes. Se aplicó la prueba de la t de Student para analizar las diferencias entre los grupos. La relación entre el nivel de miR-30b y PAI-1expression se analizó mediante la correlación de Pearson. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS (versión 17). Las diferencias estadísticas fueron declarados significativa a
P Hotel & lt; 0,05. los datos estadísticamente significativas se indican con asteriscos (
P Hotel & lt; 0,05 (*),
P
. & lt; 0,01 (**)
Resultados
disminución de la expresión de miR-30b en líneas celulares de cáncer gástrico y muestras de tejidos humanos GC
Para determinar el papel de miR-30b en la patogénesis del cáncer gástrico, se analizaron los niveles de miR-30b en varias células de cáncer gástrico, incluyendo HGC-27, AGS, BGC-823 y SGC-7901. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión de miR-30b fue significativamente las reguladas en cuatro líneas celulares en comparación con un grupo de cinco tejidos gástricos no tumorales (
P
. & lt; 0,01)
(A) Comparación del nivel de expresión de miR-30b entre las muestras normales de tejido de la mucosa gástrica y líneas celulares de cáncer gástrico HGC-27, SGC-7901, BGC-823 y AGS . **
P
& lt;.. 0,01, en comparación con los tejidos normales (B) expresión relativa de miR-30b en 21 tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos gástricos no tumorales adyacentes emparejados (C) Comparación de la media la expresión de miR-30b en dos grupos de B. Los datos representan la media ± SD **
P
& lt; 0,01, en comparación con la mucosa gástrica normal. (D) Análisis de la expresión de miR-30b mediante el uso de transferencia de Northern. ARN total fue extraído de tres cáncer gástrico emparejado (T) y los tejidos adyacentes no cancerosas gástricas (n), que fueron escogidos al azar de todos los pacientes. ARN se hibridaron secuencialmente con miR-30b y la sonda U6, y se utilizó U6 como control para la carga de ARN.
La expresión de miR-30b se examinó en 21 GC emparejado y no tumoral adyacente tejidos gástricos a través de TaqMan cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR). Como se muestra en la Figura 1B, se encontró que la disminución de miR-30b en 18 de 21 pacientes (85,7%) en comparación con los tejidos no tumorales correspondientes. Por otra parte, el diagrama de dispersión mostró que el miR-30b fue significativamente las reguladas en muestras de cáncer gástrico en comparación con mucosa gástrica normal, con una disminución media del 6,28 veces (
P
= 0,002) (Figura 1C). Para validar los datos de expresión obtenidos de QRT-PCR, 3 de los 21 pares de muestras se eligieron al azar para determinar el nivel de miR-30b usando un perno del Norte. También encontramos la constante disminución de la expresión de miR-30b en el cáncer gástrico en comparación con los tejidos gástricos no tumorales (Figura 1D). Estos resultados sugieren que la expresión de miR-30b es con frecuencia las reguladas en el cáncer gástrico y tal vez involucrado en el desarrollo de cáncer gástrico.
La sobreexpresión de miR-30b aumenta la apoptosis de las células de cáncer gástrico
Una de las característica del cáncer es su capacidad para evadir la apoptosis [27], por lo que se examinó el efecto de miR-30b en las células de cáncer gástrico apoptosis. SGC-7901 o HGC-27 células fueron transfectadas con imita el miR-30b o revueltos miR-control y la validez de miR-30b expresión ectópica fue confirmada por QRT-PCR (Figura 2A). A continuación, el efecto de miR-30b sobre la apoptosis de SGC-7901 o HGC-27 células se evaluó por ensayos de citometría de flujo (FCM) de análisis y de la caspasa 3-/7 de actividad. Como se muestra en la Figura 2B y 2C, se encontró que la proporción de células apoptóticas fue significativamente mayor en las células SGC-7901 o HGC-27 transfectadas con imita el miR-30b en comparación con las células de control transfectadas miR (16,08%
contra
8,25% a las células SGC-7901, y 17,83%
frente al 10,87% HGC-27 células). Además, el aumento significativo en la actividad de la caspasa-3/7 se encuentra en las células SGC-7901 o HGC-27 transfectadas con miR-30b en comparación con los transfectantes de control de MIR (
P
& lt; 0,01, Figura 2D). Por encima de los resultados revelan que la sobreexpresión de miR-30b puede promover la apoptosis de cáncer gástrico in vitro.
(A) Expresión relativa de miR-30b en AGS, HGC-27, y las células SGC-7901 transfectadas con miR 30b imita o miR-de control durante 48 h. Los datos representan la media ± S.D.. a partir de tres experimentos independientes, ***
P Hotel & lt; 0,001. (B) El efecto de miR-30b sobre la apoptosis se examinó mediante análisis FCM. SGC-7901 o HGC-27 células fueron transfectadas con imita el miR-30b o miR-control, y luego se reemplazó el medio con DMEM libre de suero durante 48 h, las células se analizaron para la tasa de apoptosis después de la tinción con anexina V-FITC y PI . Los datos representan la media ± S.D.. a partir de cuatro experimentos independientes, **
P
& lt; 0,01. se muestra (C) Un representante análisis FCM en B. células SGC-7901 o HGC-27 (D) se transfectaron con imita el miR-30b o miR-control para 48 h. Se detectó la actividad de la caspasa-3 y caspasa-7 usando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7. Los datos son la media ± S. D. de 6 duplicaciones de cuatro experimentos independientes, **
P
. & lt; 0,01
miR-30b suprime la tumorigenicidad y promueve la apoptosis de células in vivo
A fin de determinar si miR-30b está implicado en la tumorigénesis del cáncer gástrico, se utilizó desnuda modelo de xenoinjerto de ratón. Porque encontramos que el miR-30b jugó un papel más importante en la promoción SGC-7901 células de la apoptosis HGC-27 células in vitro, se explora el papel de miR-30b en la tumorigénesis del cáncer gástrico utilizando células SGC-7901. miR-control- y las células SGC-7901 tranfected miR-30b-se inyectaron subcutáneamente en cada flanco posterior de los mismos ratones desnudos. Los ratones fueron seguidos para la observación del crecimiento de xenoinjerto durante 4 semanas. Se encontró que la introducción de miR-30b en células SGC-7901 llevado a una reducción significativa en el tamaño del volumen del tumor (Figura 3A y 3B) de las células, y los tumores derivados de miR-30b tratados SGC-7901 creció más lento en comparación con el control grupo durante todo el período de crecimiento del tumor (Figura 3C, panel de la izquierda). Cuando se recogieron los tumores, el volumen medio de los tumores derivados del grupo imita miR-30b fue sólo 27,87% de que en el grupo de control de MIR (Figura 3C, panel de la derecha,
P
& lt; 0,01). Los tumores se cosecharon a los 26 días a partir de dos lados de la flanco posterior del mismo ratón, la apoptosis in situ se midieron por TUNEL. Como se muestra en la figura 3D, las secciones tumorales de imita miR-30b xenoinjertos mostraron aumentar significativamente en las células TUNEL positivas tratadas. Estos resultados sugieren fuertemente que la introducción de miR-30b podría inhibir el crecimiento del cáncer gástrico mediante la promoción de la apoptosis de las células cancerosas.
(A) Efecto ofmiR-30b en la formación de tumores en el modo de xenoinjerto in vivo. miR-control- y miR-30b-transfectadas SGC-7901 (1 × 10
6) se suspendieron en 100 l de PBS y luego se inyectaron por vía subcutánea en cada lado del flanco posterior de la misma hembra BALB /c atímicos ratón desnudo. Se muestran dos ratones portadores de tumores representativos después de 4 semanas de la inoculación. (B) Las diferencias significativas de volumen del tumor entre el grupo control y el grupo de miR-30b MIR de 6 ratones. (C) El volumen del tumor se midió cada tres días después de la inyección de las células SGC-7901 con el tratamiento como se describe en A, y se muestra la curva de crecimiento del tumor. La diferencia de tamaño del tumor entre el grupo control y el grupo de miR miR-30b fue estadísticamente significativa, ** P & lt; 0,01. (D) Los tumores se cosecharon a los 26 días a partir de dos lados de la flanco posterior del mismo ratón, la apoptosis in situ se midieron por TUNEL. Todos los datos anteriores son representativos de al menos tres experimentos independientes.
PAI-1 es un gen candidato objetivo de miR-30b
A fin de evaluar la función de miR-30b, es importante determinar qué mRNAs de acogida están siendo regulados por miR-30b. En nuestro estudio anterior, se analizó el perfil de expresión de ARNm en cinco pares de tejidos tumorales primarias de pacientes con cáncer gástrico y se correspondía con los tejidos no tumorales utilizando microarrays. Totalmente, encontramos 303 genes regulados positivamente (doble cambio & gt; 2,
P
& lt; 0,05) en los tejidos de cáncer gástrico en comparación con los tejidos no tumorales (datos no mostrados). Teniendo en cuenta la expresión downregulated de miR-30b en el cáncer gástrico, nos centramos en la lista de genes que muestran el aumento de expresiones y se seleccionaron los 30 mejores aumento de los genes en el cáncer gástrico, a continuación, determina si esos genes eran posibles objetivos de miR-30b utilizando el algoritmo de predicción , TargetScan. Curiosamente, se encontró que el gen PAI-1 que fue aumentada en microarrays (3,83 veces,
P
= 0,04) podría ser un gen diana probable de miR-30b (Figura 4A). Para abordar directamente si miR-30b se une al extremo 3 'UTR de los ARNm diana, hemos construido los vectores de informe de luciferasa que contienen el sitios dentro de 3'-UTR de unión putativo miR-30b. Como se muestra en la Figura 4B, se observó una marcada reducción en la actividad de la luciferasa (
P Hotel & lt; 0,01) después contransfection de vectores de luciferasa de informes e imita el miR-30b. En contraste, no se observó cambio de la luciferasa en células transfectadas con los mutantes construcciones 3'-UTR. Este resultado fue confirmado posteriormente por los experimentos GFP represión. Como se muestra en la Figura 4C y 4D, la fluorescencia de GFP se redujo significativamente en las células transfectadas con vectores que contienen GFP informe sitios de unión e imita miR-30b, mientras que no hubo ningún cambio de la fluorescencia de GFP en las células transfectadas con el vector mutante y miR-30b imita. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-30b en AGS y HGC-27 células dio como resultado la baja regulación de los niveles de proteína de PAI-1 (Figura 4E). Tomados en conjunto, los datos anteriores sugieren que el PAI-1 es un objetivo potencial de miR-30b y miR-30b podría regular a la baja la proteína diana.
Secuencia alineación de miR-30b y sus sitios de destino (A) en 3'-UTR de PAI-1. (B) Las células HEK293 se co-transfectaron transitoriamente con vectores informe de luciferasa, y, o bien imita o miR-control de miR-30b. Las actividades de luciferasa se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla. células (C y D) HEK-293 se transfectaron con el vector de informe GFP o vector mutante, y, o bien miR-30b imita o miR-control. la fluorescencia de GFP se monitorizó mediante microscopio de fluorescencia y análisis FCM. (E) Análisis de transferencias de Western de PAI-1 de las células AGS y HGC-27 transfectadas con imita el miR-30b o miR-control. Todos los datos anteriores son representativos de al menos tres experimentos independientes, **
P
. & Lt; 0,01
correlación inversa entre miR-30b y PAI-1 de expresión en tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares de cáncer
Teniendo en cuenta que miR-30b es el regulado en el cáncer gástrico, y se ha informado de que la proteína PAI-1 en tejidos de cáncer gástrico es mucho más elevado que en los tejidos no tumorales [28], se realizó el análisis de correlación entre miR-30b y PAI-1 expresión en líneas celulares de cáncer gástrico y cáncer de los tejidos gástricos. Como se muestra en la Figura 5A superior, PAI-1 nivel de proteínas fue la más baja en células AGS entre las cinco líneas de células gástricas. Por el contrario, el nivel de miR-30b fue la más alta en AGS, en comparación con otras líneas celulares (Figura 5A abajo). Posteriormente, se analizó el PAI-1 y miR-30b expresión en 21 conjuntos de cáncer gástrico y los tejidos no tumorales adyacentes. Se encontró que el 81% (17/21) de los cánceres gástricos aparece más altos de mRNA de PAI-1 en comparación con los tejidos normales. Por el contrario, el miR-30b era comúnmente el regulado en 18 de los 21 tumores. Utilizando el análisis de correlación de Pearson, se observó una correlación inversa significativa entre el miR-30b y PAI-1 mRNA (Figura 5B,
R
= -0.6475,
P = 0,0123
). Los resultados anteriores sugieren que la expresión de miR-30b se correlaciona inversamente con PAI-1 expresión en el cáncer gástrico, y una mayor expresión de PAI-1 en el cáncer gástrico podría ser un resultado de la expresión de miR-30b reducida.
(A) La la expresión de miR-30b y PAI-1 en líneas celulares de cáncer gástrico MKN45, MGC-823, SGC-7901, AGS y HGC-27. Arriba, Western blot de PAI-1 los niveles de proteína; inferior, QRT-PCR análisis de los niveles de miR-30b. Los datos representan la media ± S.D.. de tres experimentos independientes. niveles (B) miR-30b y PAI-1 mRNA en tejidos de cáncer gástrico fueron analizados por QRT-PCR. El gráfico del recuadro indica una correlación inversa estadísticamente significativa (
R
= -0.6475,
P = 0,0123
). U6 y β-actina sirvió como referencias normalizadas internos para miR-30b y PAI-1 mRNA, respectivamente.
PAI-1 es potencialmente implicadas en el miR-30b-apoptosis inducida por
para investigar más a fondo si PAI-1 está implicado en la apoptosis promovida-miR-30b, primero a prueba si el silenciamiento de la expresión de PAI-1 puede tener el efecto de apoptosis similar a la promoción de la sobreexpresión de miR-30b. células SGC-7901 fueron transfectadas con PAI-1 siRNA o ARN control negativo (NC) durante 48 h, como se muestra en la Figura 6A, los niveles de mRNA de PAI-1 se pueden reducir de manera significativa por su siRNA. Posteriormente, PAI-1 siRNA muestra aumentos evidentes en la tasa de apoptosis en células SGC-7901 (Figura 6B, 6C), en comparación con el miR-control. En particular, PAI-1 siRNA fue capaz de phenocopy el efecto de la sobreexpresión de miR-30b en la regulación de la apoptosis de las células cancerosas (Figura 6B, 6C). Un ejemplo representativo de gráfico de puntos se muestra en la Figura 6D. A continuación, se examinó también si el PAI-1 podría derogar el efecto de promover la apoptosis de miR-30b. células SGC-7901 fueron transfectadas con imita de control de miR o miR-30b durante 24 h, y seguido por la transfección con PAI-1 humano cDNA ORF vector Clone (indicado como PAI-1) o el vector vacío. Como se muestra en la Figura 6E-G, la sobreexpresión de PAI-1 dio como resultado la supresión evidente en el efecto de la apoptosis inducida por miR-30b. En conjunto, nuestros resultados sugieren que PAI-1 es potencialmente implicadas en la apoptosis promovida-miR-30b.
(A) PAI-1 siRNA inhibe la expresión de PAI-1 de manera eficiente a niveles de mRNA. RT-PCR se utilizó para controlar la expresión de PAI-1 48 h después de la transfección con siRNA para PAI-1 o ARN control negativo, β-actina sirvió como un control interno. Los datos representan la media ± S.D.. a partir de tres experimentos independientes, **
P Hotel & lt; 0,01. células SGC-7901 (B) se transfectaron con miR-control, miR-30b o PAI-1 siRNA, y el medio fue reemplazado con DMEM libre de suero durante 48 h, la actividad de la caspasa-3 y caspasa-7 se detectó utilizando la caspasa-Glo 3/7 Ensayo. Los datos son la media ± S. D. de 6 duplicaciones de tres experimentos independientes, **
P Hotel & lt; 0,01. las células (C) SGC-7901 fueron tratados como (B), y luego las células se analizaron para la tasa de apoptosis después de la tinción con Anexina V-FITC y PI. Los datos representan la media ± S.D.. a partir de tres experimentos independientes, **
P Hotel & lt; 0,01. se demostró (D) análisis FCM Un representante en (C). (E) células SGC-7901 se transfectaron primero con imita de control de miR o miR-30b, y luego con PAI-1 humano cDNA ORF vector Clone (indicado como PAI-1) o el vector vacío 24 h más tarde. 24 h después de la transfección del vector, el medio se reemplazó con DMEM libre de suero durante otras 24 h, por último, la actividad de la caspasa-3 y caspasa-7 se detectó utilizando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7. Los datos son la media ± S. D. de 6 duplicaciones de tres experimentos independientes, **
P Hotel & lt; 0,01. células SGC-7901 (F) se trataron como (E), finalmente se analizaron las células para la tasa de apoptosis después de la tinción con Anexina V-FITC y PI. Los datos representan la media ± S.D.. a partir de tres experimentos independientes, **
P Hotel & lt; 0,01.