Extracto
microARN-214 (miR-214) ha informado que están alteradas en tejidos de cáncer de vejiga humana. El objetivo fue investigar la correlación clínica, la importancia biológica y molecular de la red de miR-214 en el cáncer de vejiga. Nuestros resultados mostraron miR-214 se redujo reguladas en tejidos de cáncer de vejiga y se asocia significativamente con el estadio del tumor, los ganglios linfáticos, el grado, la multifocalidad, historia de no músculo invasivo cáncer de vejiga (CVNMI). Por otra parte, el miR-214 podría servir como un factor independiente de la supervivencia libre de recurrencia (SLR) y la supervivencia global (SG) para los pacientes con cáncer vesical infiltrante (MIBC). La restauración de la expresión de miR-214 en líneas celulares de cáncer de vejiga inhibe la proliferación celular, la migración, la invasión y la apoptosis promovida notablemente. ensayo indicador de luciferasa Dual-PDRG1 reconocido como aguas abajo del gen diana directa de miR-214. PDRG1 fue significativamente mayor en los tumores de bajo de miR-214 y desmontables de PDRG1 imitaba los efectos de la sobreexpresión de miR-214. Nuestros hallazgos manifiesto que el miR-214 podría ejercer efectos supresores de tumores en el cáncer de vejiga por abajo de la regulación directa PDRG1 oncogén y sugerir un indicador novedoso atractivo para la intervención terapéutica y pronóstica de cáncer de vejiga
Visto:. J Wang, Zhang X, Wang L, Yang Y, Dong Z, Wang H, et al. (2015) microARN-214 suprime la oncogénesis y ejerce impacto sobre el pronóstico de focalización PDRG1 en el cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (2): e0118086. doi: 10.1371 /journal.pone.0118086
Editor Académico: Chengfeng Yang, de la Universidad del Estado de Michigan, Estados Unidos |
Recibido: 23 Agosto, 2014; Aceptado: January 4, 2015; Publicado: 23 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel y su respuesta a los Revisores archivos de soporte de información. Sin embargo, por razones éticas, no podemos proporcionar estos datos a nivel de participante en un archivo de información de apoyo o repositorio público. Sin embargo, otros investigadores pueden acceder a ellos desde el Comité de Ética Médica del Hospital Qilu de la Universidad de Shandong y el Hospital Popular de Linyi poniéndose en contacto con 1. Comité de Ética Médica del Departamento de Investigación Científica, Hospital Qilu, la Universidad de Shandong, 107 Wenhua West Road, Jinan 250012, provincia de Shandong, China. Tel: + 86-531-82169035; E-mail:
[email protected]; 2. Comité de Ética Médica del Departamento de Medicina, Hospital Popular de Linyi, 27 Jiefang Road, Linyi 276003, provincia de Shandong, China. Tel: + 86-539-8216157; E-mail:.
[email protected] Financiación: Este estudio recibió el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/) a CW (Nº 81271916) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (http://www.sdnsf.gov.cn/portal/) a XZ (ZR2013HQ063). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el cuarto cáncer más común diagnosticado en los países desarrollados y representa la segunda causa principal de muerte entre los pacientes con neoplasias del tracto genitourinario en todo el mundo [1, 2]. Aunque aproximadamente el 75% de los casos se agrupan en CVNMI con una relativamente alta tasa de supervivencia a 5 años [3, 4], otro 25% de los pacientes con MIBC se someten a la enfermedad metastásica subsiguiente después del primer tratamiento agresivo [5]. La investigación de nuevas modalidades terapéuticas y la identificación de biomarcadores de pronóstico para el cáncer de vejiga basado en redes moleculares originales se han convertido en puntos de acceso de investigación recientemente.
microARN (miARN) representan una clase de, endógena, no codificantes pequeñas moléculas, 22-nucleótidos de ARN que función como regulador post-transcripcional por el emparejamiento parcialmente con las regiones 3 'no traducidas (UTR) del ARNm diana, dando lugar a la degradación del ARNm o la represión de traducción [6, 7]. Se ha establecido firmemente que los miRNAs pueden regular & gt; 60% de los genes codificantes de proteínas humanas [8] y juega un papel crucial en diversos procesos fisiopatológicos [9, 10]. miRNAs se han identificado ya sea como supresores de tumores u oncogenes [11]. A la vista de sus perfiles de expresión enfermedades y específicos de tejido y sorprendente potencial regulatorio, miRNAs están siendo evaluados como biomarcadores para el diagnóstico del cáncer fascinantes y el pronóstico [12]. Los informes anteriores han demostrado la regulación aberrante de miRNAs en el cáncer de vejiga y varios miRNAs (
e
.
g
., miR-9, el miR-182, miR-200b, miR-145 y miR 129) muestran un valor pronóstico [13-17]. Otros estudios se exigen para decodificar las vías de regulación subyacentes mediante el cual los miRNAs participan en la carcinogénesis del cáncer de vejiga e identificar miRNAs funcionar como nuevas dianas terapéuticas o como biomarcadores de pronóstico para el cáncer de vejiga.
Algunos estudios han informado de que miR 214 fue hasta reguladas y ha contribuido al progreso de la enfermedad y metástasis a distancia en el melanoma maligno [18, 19], mientras que otros han indicado que el miR-214 se redujo reguladas y tuvo un efecto de tumor supresor de cáncer de cuello uterino [20], el cáncer de mama [21] y carcinoma hepatocelular humano [22]. La evidencia anterior señala que el miR-214 puede desempeñar un papel fundamental en la oncogénesis y diversas de los distintos tipos de tumores, sin embargo, los mecanismos potenciales de miR-214 todavía no están completamente desenredado. Hasta ahora, ha habido poca documentos publicados que implican el análisis funcional y la red molecular de miR-214 en el cáncer de vejiga, aunque algunos miARN perfiles de estudios mostraron que el miR-214 se desregula en el cáncer de vejiga [23, 24].
en este estudio, se evaluó el nivel de expresión de miR-214 en tejidos de cáncer de vejiga humana, analizamos su relevancia pronóstica factible y realizado experimentos funcionales pertinentes. Descubrimos que el miR-214 podría inhibir la proliferación de células de cáncer de vejiga, migración, invasión y ejercer una función esencial proapoptótico. Además, la PDRG1 oncogén se verificó por primera vez como un objetivo corriente abajo directa de miR-214 en el cáncer de vejiga. Este informe implicado un papel supresor de tumores y los mecanismos de regulación de miR-214 en el cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
El SV-40 no maligno inmortalizada de células epiteliales de la vejiga (SV-HUC-1) dos líneas celulares de cáncer de vejiga y (T24 y 5637) se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) el 22 de mayo, 2014 después de haber pasado la prueba de análisis de ADN (corto repeticiones en tándem, STR). Las células SV-HUC-1 se cultivaron en medio F12K (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS; TBD, Tianjin, China) y las dos líneas celulares de cáncer de vejiga se cultivaron en modificado RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT) suplementado con 10% de SFB (TBD, Tianjin, China) a 37 ° C en un incubador humidificado (5% de CO2).
pacientes y muestras de tejidos
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética médica del hospital de la Universidad de Shandong Qilu y el hospital Popular de Linyi. Todos los pacientes firmaron consentimiento informado por escrito antes de su inscripción. Un total de 106 pacientes de operación con carcinoma de células transicionales de vejiga primario confirmado patológicamente fueron reclutados entre enero de 2004 y agosto de 2009, del Hospital de la Universidad de Shandong Qilu (n = 45) y el Hospital Popular de Linyi (n = 61). Entre estos pacientes, 31 pacientes fueron sometidos a resección transuretral de tumor de vejiga y 75 pacientes fueron sometidos a cistectomía radical. Ninguno de los pacientes había recibido tratamiento preoperatorio. tejidos de la vejiga adyacente normal se obtuvieron de regiones fuera del margen del tumor (& gt; 5 cm) en los pacientes. Todos los tejidos fueron-macro diseccionado dentro de los 15 minutos después de la resección quirúrgica, se confirma por análisis patológico de secciones congeladas secuenciales, y luego se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. El estadio y el grado de los tumores fueron evaluados de acuerdo con la Unión Internacional contra el Cáncer 2009 sistema TNM [25] y 2004 sistema de clasificación de la OMS [26], respectivamente. Todos los pacientes fueron seguidos por visitas a la clínica cada 3 meses durante los 2 primeros años, cada 6 meses durante 2 años, y posteriormente cada año. SSR y la SG se definieron como el intervalo de tiempo entre la resección quirúrgica inicial y la fecha del evento o el último seguimiento.
El aislamiento de ARN, síntesis de cDNA y cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR)
ARN total fue extraído a partir de tejidos o células usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad y calidad de ARN se verificaron con BioPhotometer Plus (Eppendorf AG, hamburguesas, Alemania). Para la detección de PDRG1, cDNA se sintetizó usando un kit de ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Osaka, Japón). Para el miR-214, el ARN se sometió a transcripción inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el cebador de transcripción inversa específica (RiboBio, Guangzhou, China). Los niveles de expresión de miR-214 y PDRG1 se cuantificaron por medio de QRT-PCR utilizando PCR en tiempo real kit Master Mix (Toyobo, Osaka, Japón) y ABI 7500 sistema de PCR en tiempo real (ciudad Applied Biosystems, Foster, EE.UU.) con ARNsn U6 como su gen de referencia endógeno. La reacción de PCR consistió en una etapa inicial de desnaturalización (95 ° C durante 60 s), 48 ciclos (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 45s) y la curva de fusión análisis. El 2
-ΔΔCT método se realizó para calcular la expresión y los niveles relativos de expresión de los controles negativos se utilizaron como calibrador.
miARN maduro o siRNA transfección
células de cáncer de vejiga se cultivaron a 3 × 10
4 células /pocillo en placas de 96 pocillos o 1 × 10
5 células /pocillo en placas de 24 pocillos o 5 × 10
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos en medio de cultivo sin antibióticos durante aproximadamente 24 horas hasta alcanzar el 80% de confluencia y se transfectaron transitoriamente con imita miARN (Ribobio, Guangzhou, china) o siRNA (Ribobio, Guangzhou, china) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. miR-214 de control sinóptico y miR-negativo (miR-NC) mímica fueron utilizados en los experimentos con ganancia de función, mientras que si-PDRG1 y si-control negativo (si-NC) fueron utilizados en los experimentos de pérdida de función de las . Para asegurar la transfección real, QRT-PCR se llevó a cabo para detectar las eficacias de transfección en cada experimento 24 horas más tarde. Para la proliferación, curación de heridas, la migración, invasión y ensayos de apoptosis, las células se recogieron 24 horas después de la transfección. Para el ensayo de transferencia Western, las células se recogieron 48 horas después de la transfección.
Ensayo de proliferación celular
De acuerdo con el protocolo del fabricante, se detectó la proliferación de las células a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la transfección por uso de WST-8 tinción con Cell Counting Kit-8 (Byotime, Haimen, china).
apoptosis ensayo
se recogieron las células de cáncer de vejiga, se lavaron en PBS frío, se volvieron a suspender, teñidas con doble FITC-anexina V /kit de detección de apoptosis yoduro de propidio (BestBio, Shanghai, china) según las recomendaciones del fabricante e inmediatamente analizado por una citometría de flujo (BD FACSCanto II, BD Biosciences, San Jose, EE.UU.).
herida -healing ensayo
las células se sembraron en placas de 6 pocillos con medio que contiene suero hasta subconfluencia y privaron de suero durante 24 horas, a continuación, la monocapa de células se raspó a través del centro de las placas después de que las células alcanzaron la confluencia usando una punta de micropipeta P-20 [27]. La longitud inicial de la diferencia (0 horas) y la longitud residual brecha en diferentes puntos de tiempo (6, 12 y 24 horas) después de la herida fueron fotografiados (200 ×) y calculado conforme al IX71 microscopio invertido (Olympus, Tokio, Japón).
in vitro
ensayos de migración e invasión
las células cancerosas de vejiga en medio libre de suero se colocaron en la cámara superior del inserto con poros de 8 mm en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Costar Corning, Nueva York, EE.UU.) con o sin matrigel (BD Bioscience, Bedfold, MA, EE.UU.). Modificado RPMI 1640 que contiene 10% de SFB en la cámara inferior servía de cebo químico. Después de 24 horas de incubación, se lavaron las células adheridas a la membrana inferior, se fijaron y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y 20% de metanol, la imagen (400 aumentos), y se contaron usando IX71 microscopio invertido (Olympus, Tokio, Japón).
Dual-luciferasa reportero de ensayo
los vectores PMIR-informe (RiboBio, Guangzhou, china) se construyeron con el tipo salvaje (WT) o mutante -PDRG1 secuencias (MUT) -PDRG1 secuencias insertadas entre el hRluc y el gen hLuc. Las células de cáncer de vejiga en placas de 96 pocillos fueron co-transfectadas con el miR-NC /miR-214 y WT imita PDRG1 3'-UTR del vector /vector MUT PDRG1 3'-UTR utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las actividades de Renilla y luciferasas de luciérnaga en lisados de células se midieron usando el kit de ensayo Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI) y el cociente de las actividades de luciferasa de Renilla /luciérnaga (Rluc /Luc) fueron considerados como datos normalizados.
Western blot
El tampón de lisis (Beyotime, Haimen, china) se utilizó para extraer la proteína total a partir de células de cáncer de vejiga y la concentración de proteína se determinó con BCA Enhanced Kit de ensayo de proteínas (Byotime, Haimen, china). lisado de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. Después de ser bloqueado, las membranas se incubaron con mAb de conejo anti-PDRG1 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) o anti-β actina-mAb de ratón (1: 500; SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4 ° C, a continuación, marcado con peroxidasa de color rojizo (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology). complejos específicos se visualizaron con sustrato de quimioluminiscencia HRP (Millipore, Little Chalfont, Reino Unido).
Objetivo de búsqueda gen de miR-214
Para identificar los posibles genes diana de miR-214, nos aprovechamos de un análisis integrado de la bioinformática, STARBASE v 2.0 (http://starbase.sysu.edu.cn/targetSite.php), que se puede utilizar de forma conjunta cinco algoritmos disponibles públicas (incluyendo TargetScan, PicTar, PITA, RNA22 y Miranda).
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con el programa SPSS versión 17.0, el software GraphPad Prism y Microsoft Excel. diferencias significativas entre los grupos independientes se calcularon mediante la prueba de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis o la prueba t de Student. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para comparar la expresión de miR-214 en tejidos de cáncer de vejiga emparejados y tejidos normales adyacentes. SSR y la SG curvas fueron determinadas por el método de Kaplan-Meier y las diferencias en la supervivencia de los pacientes en subgrupos fueron evaluadas por la prueba de log-rank. factores pronósticos independientes para la predicción de supervivencia se estimaron mediante análisis multivariado de regresión de Cox. Se aplicó el análisis de correlación de Spearman para calcular la relación entre el miR-214 y PDRG1.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
miR-214 se atenúa con frecuencia en el cáncer de vejiga, que está envuelto en la progresión del cáncer
Hemos detectado el nivel de expresión de miR-214 en 106 pares de tejidos de cáncer de vejiga humano congelado y las muestras normales adyacentes emparejados por QRT-PCR y descubrieron que el miR-214 se underexpressed significativamente en tejidos de cáncer de vejiga (
P Hotel & lt; 0,001) con el nivel medio de expresión de diez veces menor que la de las muestras no cancerosas (expresión mediana = 0,084 y 0,864, respectivamente) (Fig. 1A). Además, el 74% de las muestras de tejido de cáncer de vejiga mostró que más de dos veces menor nivel de miR-214 en comparación con los tejidos normales emparejados (fig. 1B y 1C). Se evaluó además la correlación entre el miR-214 expresión en tejidos de cáncer de vejiga y características clínico (Tabla 1) y observó que la expresión de miR-214 atenuado se asoció significativamente con el estadio tumoral más alta (
P Hotel & lt; 0,001), más alto estado de los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,001), de grado superior (
P Hotel & lt; 0,001), multifocalidad (
P
= 0,003) y la historia de CVNMI (
P = 0,033
). Sin embargo, no se encontró correlación significativa entre la expresión de miR-214 y otras características clinicopatológicas. Estos resultados manifiestan que el miR-214 puede desempeñar un papel supresor tumoral en el cáncer de vejiga y su regulación a la baja de verse envueltos en la progresión del cáncer.
(A) El nivel de expresión de miR-214 se determinó por medio de QRT-PCR y normalizado contra U6 ARN, un control endógeno, en 106 pares de tejidos humanos de cáncer de vejiga (BC) y tejidos normales adyacentes emparejados (NT). ***
P Hotel & lt; 0,001, prueba de Wilcoxon, n = 106. (B) La expresión atenuada de miR-214 se encontró en el 74% (78 de 106) de los tejidos de cáncer de vejiga en comparación con los especímenes normales adyacentes. (C) Expresión relativa de miR-214 se presentó como log
2 veces el cambio (AC /NT) y el registro
2 veces el cambio se define como sigue: & lt; 1, disminución en la expresión; & Gt; 1, la sobreexpresión; los restantes se definió como sin cambios. (D) de Kaplan-Meier y las curvas de RFS OS basados en los miR-214 niveles de expresión de los pacientes con cáncer de vejiga. El punto de corte fue la mediana de nivel de expresión de miR-214 en las muestras de tejido de cáncer de vejiga. (E) de Kaplan-Meier y las curvas de RFS OS basan en los miR-214 niveles de expresión de los pacientes con MIBC. El punto de corte fue la mediana de miR-214 nivel de expresión en las muestras de tejido MIBC.
miR-214 sirve como un predicador pronóstico independiente para pacientes con MIBC
durante el seguimiento, el 54,7% (58 de 106) de los pacientes con cáncer de vejiga sufrieron recurrencia y la tasa de supervivencia global a los 5 años fue del 61,3% (65 de 106). La mediana de seguimiento de SSR como la SG de 57,5 meses (rango, 0.5-79 meses) y 62 meses (rango, 1-79 meses), respectivamente. curva de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que los pacientes con cáncer de vejiga con baja expresión de miR-214 se sometieron a RFS significativamente más cortos (prueba de log-rank = 26,207;
P Hotel & lt; 0,0001) y OS (prueba de log-rank = 45,174;
P
. & lt; 0,0001) que aquellos con alta expresión (figura 1D), mientras que el análisis de regresión de Cox multivariado mostró que el miR-214 no era ni variable pronóstica independiente de RFS (
P = 0,269
) ni OS (
P = 0,397
) para pacientes con cáncer de vejiga.
a continuación, se realizó un análisis por separado de los tumores CVNMI y MIBC. En el grupo CVNMI, después de una mediana de seguimiento de 59 meses (rango, 42-79months), el 54,8% de los pacientes (17/31) CVNMI presentó recurrencia, pero el miR-214 no prevé ni RFS sistema operativo cuando desregulado por de Kaplan-Meier análisis. En el grupo de MIBC, después de una mediana de seguimiento de 32 meses (rango, 0.5-76 meses), se observó recidiva local o metastásica el 54,7% de los 75 pacientes MIBC (41/75), que murieron todos. La tasa de supervivencia global a los 5 años fue del 45,3% (34 de 75) y la mediana de seguimiento de la SG fue de 35 meses (rango, 1-76 meses). El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier reveló que la disminución de la expresión de miR-214 se asoció significativamente con un peor pronóstico en términos de RFS (prueba de log-rank = 14.214;
P = 0,0002
) y OS (log-rank test = 13.797;
P = 0,0002
) (figura 1E).. Por otra parte, entre los diferentes parámetros clínico investigados en este estudio, la edad, la historia de CVNMI, estadio del tumor y los ganglios linfáticos se asociaron significativamente con el resultado de MIBC a un nivel de significación del 5% en el análisis univariado. Análisis multivariado de regresión de Cox, incluyendo la edad, historia de CVNMI, el estadio del tumor, los ganglios linfáticos y miRNA-214 mostró esa etapa, los ganglios linfáticos y miRNA-214 eran predicadores pronósticos independientes de SSR y la SG de MIBC (Tabla 2).
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miR-214 suprime la reintroducción oncogenicidad
in vitro
en primer lugar, se encontró que el nivel de expresión de miR-214 madura para ser abajo de manera significativa regulado en células de cáncer de vejiga en comparación con la de SV-HUC-1 mediante el uso de QRT-PCR (Fig. 2A). Para investigar el papel potencial de supresión tumoral de miR-214, a continuación, reintrodujimos miR-214 en líneas celulares de cáncer de vejiga seguido de ensayos funcionales. Relativa expresión de miR-214 en T24 y 5637 células transfectadas con miR-214 imitador era 22319 y 10276 veces mayor que la transfectadas con miR-NC imitar confirmó por medio de PCR en tiempo real 24 horas después de la transfección (Fig. 2B). Como se indica en la figura. 2C, se observaron inhibiciones importante proliferación de células mejoradas-miR-214 en comparación con el control por Cell Counting Kit-8 ensayo. También observó que la proporción de células apoptóticas se incrementó significativamente en el miR-214 en comparación con la restauración de miR-NC mediante citometría de flujo (Fig. 2D), lo que indica un papel proapoptótico de miR-214 en la regulación de la carcinogénesis. Además, las células de cáncer de vejiga que sobreexpresan miR-214 mostraron una reducción significativa en la capacidad de migración en comparación con los controles por el ensayo de curación de la herida (Fig. 3A) y ensayo de migración transwell (Fig. 3B). Como se muestra en la Fig. 3C, transwell ensayo de invasión con revestimiento de matrigel presentó que miR-214 reexpresión también significativamente afectada la capacidad de invasión de las dos líneas celulares. Es de destacar que el tiempo de incubación para los ensayos de migración y la invasión fue dentro de las 24 horas después de la transfección, durante el cual el crecimiento de las células cancerosas de la vejiga no se vio afectada por miR-214. Así que los efectos inhibidores sobre la migración celular y la invasión no fueron causados por la disminución del número de células. Estas observaciones demuestran que el miR-214 suprime la reintroducción oncogenicidad de las células del cáncer de vejiga
in vitro
.
(A) La expresión de miR-214 fue significativamente downregulated en líneas celulares de cáncer de vejiga que los que en condiciones normales línea de células de la vejiga (SV-HUC-1). (B) Expresión relativa de miR-214 después de miARN transfecciones imitan según lo determinado por QRT-PCR. (C) ensayo de viabilidad celular en simulacro /miR-NC /miR-214 células de cáncer de vejiga transfectadas (análisis estadístico entre miR-NC-214 y miR: ***
P Hotel & lt; 0,001, prueba t, n = 4). (D) La citometría de flujo El análisis mostró que la expresión forzada de miR-214 promovió significativamente la apoptosis. Las barras de error corresponden a la media ± error estándar de la media (SEM). ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6.
(A) Cicatrización de heridas de ensayo, (B) de ensayo Transwell migración y la invasión de ensayo (C) Transwell con fingida /miR-NC /miR-214 transfectadas células de cáncer de vejiga. Las barras de error corresponden a la media ± SEM. ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6.
Oncogene PDRG1 será un objetivo directo de miR-214
Desde miARN normalmente ejerce su función mediante la inhibición de la expresión de los genes diana , miramos más lejos para los objetivos de miR-214 para dilucidar el mecanismo subyacente de sus efectos, antitumoral. El análisis integrado de la bioinformática (TargetScan, PicTar, PITA y Miranda) demuestra que PDRG1 contiene un sitio de miR-214-unión de cortesía potencial en su extremo 3 'UTR (Fig. 4A). Teniendo en cuenta que, en primer lugar construido vectores de luciferasa PMIR-informe que contenga de tipo salvaje o mutante 3
'- UTR del PDRG1 insertado entre el hRluc y el gen hLuc, y luego se llevó a cabo ensayo indicador Dual-luciferasa mediante cotransfección por encima de vectores con el miR -214 imita o miR-NC en células de cáncer de vejiga. Como se muestra en la Fig. 4B, miR-214 suprimió de forma significativa la actividad de luciferasa relativa del indicador que contiene de tipo salvaje 3'-UTR, pero no el reportero mutante, lo que significa que PDRG1 será un objetivo directo de miR-214 en células de cáncer de vejiga.
en consonancia con esto, la expresión endógena de depresión de PDRG1 en ambos niveles de ARNm y proteínas se observaron en el miR-214 vuelto a expresar las células de cáncer de vejiga (Fig. 4C y 4D). Además, no había una correlación inversa entre miR-214 y la expresión PDRG1 en tejidos de cáncer de vejiga (Fig. 4E). Tomados en conjunto, nuestros resultados enérgicamente verificar que el miR-214 regula negativamente la expresión PDRG1 uniéndose directamente a sus secuencias complementarias 3'-UTR.
(A) Bosquejo de los presuntos miR-214 secuencias de unión en PDRG1 3'- UTR y la estructura de tipo salvaje o mutante PDRG1 vectores PMIR-informe. El sitio de unión era mutante en cursiva y subrayado. (B) Ensayo de actividad de luciferasa Dual-se llevó a cabo en células de cáncer de vejiga cotransfectadas con vectores de miR-NC /miR-214 y PMIR-informe que contenga WT PDRG1 3'-UTR /MUT-PDRG1 3'-UTR secuencias. Los datos se muestran como factor de cambio en la actividad de luciferasa normalizada relativa (Rluc /Luc). Las barras de error corresponden a la media ± SEM. ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6. (C) El ARNm PDRG1 se había reducido regulado en células de cáncer de vejiga transfectadas con el miR-214 de QRT-PCR. Las barras de error corresponden a la media ± SEM. ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6. (D) Western blot resultados de expresión de la proteína endógena PDRG1 en células de cáncer de vejiga transfectadas con el miR-NC /miR-214 con β-actina como control de carga. análisis de correlación (E) de Spearman indicó una correlación inversa entre la expresión de miR-214 y ARNm PDRG1 niveles en tejidos de cáncer de vejiga.
En comparación con los tejidos normales emparejados, PDRG1 se sobreexpresa significativamente en el 81% de los tejidos de cáncer de vejiga detectado por QRT-PCR (
P Hotel & lt; 0,001). Además, se evaluó la correlación entre la expresión PDRG1 en tejidos de cáncer de vejiga y parámetros clínico (Tabla 1) y descubrimos que la expresión regulada PDRG1 arriba se asoció significativamente con un mayor estadio del tumor, los ganglios linfáticos más alta, más alta categoría y sexo. curva de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con cáncer de vejiga con una expresión de alto PDRG1 sufrieron RFS significativamente más cortos (prueba de log-rank = 6,578;
P
= 0,010) y OS (prueba de log-rank = 8.990;
P
= 0,003) que aquellos con baja expresión, mientras que el análisis de regresión de Cox multivariado demostró que no era ni PDRG1 variable independiente pronóstico de RFS (
P = 0,457
) ni OS (
P = 0,145
) para los pacientes con cáncer de vejiga. Realización de análisis por separado de Kaplan-Meier para los tumores CVNMI y MIBC, PDRG1 ni predijo RFS ni sistema operativo cuando están alteradas en ambos grupos.
caída PDRG1 recapitula los efectos de miR-214 reexpresión en células de cáncer de vejiga
con el objetivo de investigar si el miR-214 ejerce sus funciones, antitumoral principalmente a través de PDRG1, se trataron las células del cáncer de vejiga con PDRG1 siRNA seguido por ensayos funcionales. El efecto knockdown fue confirmada por RT-PCR y análisis de transferencia Western (Fig. 5A y 5B). Tal como se esperaba, se observaron inhibiciones de proliferación significativas en las células transfectadas si-PDRG1 comparación con el control (Fig. 5C). Lo que es más, las fracciones de células apoptóticas se incrementaron significativamente en PDRG1 caída en comparación con el control como se observa en el miR-214 reintroducción (Fig. 5D). El ensayo de curación de heridas y ensayo de migración transwell tanto indicaron que si-PDRG1 redujo significativamente la capacidad de migración de las células de cáncer de vejiga (Fig. 6A y 6B). Notablemente, transwell ensayo con la capa de matrigel manifiesta que PDRG1 Si- provocó un efecto inhibidor sobre la invasión de células de cáncer de vejiga en comparación con el grupo control (Fig. 6C). Por encima de todo, PDRG1 desmontables mediante la técnica de siRNA imitaba los efectos inducidos por la expresión forzada de miR-214, lo que indica, además, que PDRG1 puede servir como mediador funcional de aguas abajo de miR-214
.
(A) la expresión relativa de ARNm PDRG1 después de transfecciones siRNA según lo determinado por QRT-PCR. los niveles de (B) de proteína de PDRG1 se evaluaron mediante inmunotransferencia de tipo Western en células de cáncer de vejiga si-NC /Si- PDRG1 con β-actina como control de carga. (C) Ensayo de proliferación celular en las células del cáncer de vejiga transfectadas con fingida /SI-NC /SI-PDRG1 (análisis estadístico entre si-si-NC y PDRG1: ***
P Hotel & lt; 0,001, prueba t , n = 4). (D) La citometría de flujo análisis indicó que PDRG1 desmontables apoptosis promovido significativamente. Las barras de error corresponden a la media ± SEM. ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6.
(A) Cicatrización de heridas de ensayo, (B) de ensayo Transwell migración y la invasión de ensayo (C) Transwell en células de cáncer de vejiga transfectadas con fingida /SI-NC /SI-PDRG1. Las barras de error corresponden a la media ± SEM. ***
P Hotel & lt; 0,001, t-test, n = 6.
Discusión
En el estudio actual, se verifica por primera vez un gen supresor tumoral vitales, miR-214, que funciona en el importante patogénesis de cáncer de vejiga. miR-214 fue significativamente las reguladas en líneas celulares de cáncer de vejiga tumorigénicos en comparación con la línea de células epiteliales de vejiga inmortalizadas no maligno. La atenuación de la expresión de miR-214 se evaluó en aproximadamente el 74% de los tejidos de cáncer de vejiga y asociada con una mayor estadio del tumor, los ganglios linfáticos alto, más alto grado, multifocalidad y la historia de CVNMI, lo que sugiere que el miR-214 puede ser envuelto en la progresión del cáncer. Nuestros datos son consistentes con la de varios estudios de la siguiente manera. Por ejemplo, miR-214 suprimió el crecimiento y la invasividad de las células de cáncer cervical por la orientación UDP-N-acetil-α-D-galactosamina [20]. Disminución de miR-214 niveles en células de cáncer de mama coincidieron con un aumento de la proliferación celular, la invasión y la acumulación de la Polycomb Ezh2 metiltransferasa [21]. Regulación a la baja de miR-214 contribuyó a la angiogénesis tumoral mediante la inducción de la secreción del factor de crecimiento derivado de hepatoma-en hepatoma humano [22]. miR-214 potenciador regulada de homólogo zeste 2 y la migración y la invasión inhibido en el carcinoma humano de células escamosas de esófago [28]. miARN expresión de estudios de perfiles mostró que el miR-214 se había reducido regulado en muestras de tejido de la vejiga malignas y significativamente expresó diferencialmente entre CVNMI y MIBC [23, 24]. Sin embargo, el miR-214 que sirve como oncogén se había encontrado hasta reguladas en otros cánceres humanos tales como ovario, estómago, páncreas, cuello uterino, pulmón, cánceres de la mucosa nasofaríngea y orales y los melanomas malignos [18, 19, 29-32]. Es notable que las diferencias funcionales de miR-214 en diferentes tipos de cáncer pueden ser el resultado de la diversidad de sus genes o distinción entre los tipos de tejidos celulares y circunstancias de destino. Se ha informado de que los genes miARN puede ser silenciado por alteraciones genéticas estructurales (tales como deleción genómica y mutaciones inactivadoras), el promotor de la metilación del ADN y pérdida de la acetilación de histonas [33, 34]. Además, se encontró al menos una copia de los miR-214 alelos que desea eliminar en el 24% de los tumores primarios de mama [21]. En nuestro estudio, atenuado la expresión de miR-214 resultante de la pérdida genómica o de otros mecanismos, junto con el aumento de nivel de PDRG1 puede proporcionar nuevos biomarcadores de pronóstico para la intervención de cáncer de vejiga.
En el proceso de evaluar la importancia pronóstica de miR 214, hemos descubierto que los pacientes con cáncer de vejiga con baja expresión de miR-214 tuvieron una recurrencia significativamente mayor y menor supervivencia global tras el análisis multivariante identificó la cirugía y miR-214 como un factor pronóstico independiente de SSR y la SG en pacientes con MIBC. Nuestros hallazgos presentados que el miR-214 desregulación podría servir como un nuevo biomarcador de pronóstico para MIBC, del mismo modo que puede ser pronosticador de hepatoma humano [22].