Extracto
La capacidad migratoria de las células del cáncer es una de las características más importantes que reflejan el potencial metastásico. Ouabaína, un glucósido cardiaco endógena producida por la glándula suprarrenal, se ha informado anteriormente que tienen actividades antitumorales; Sin embargo, su papel en la regulación de la migración de células de cáncer sigue siendo desconocido. El presente estudio ha revelado que el tratamiento con ouabaína a concentraciones fisiológicas es capaz de inhibir las actividades migratorias de células H292 de cáncer de pulmón humano. Se encontró que los efectos negativos de la ouabaína estar mediada a través de la supresión de las proteínas reguladoras de migración, tal como quinasa de adhesión focal (FAK), tirosina quinasa dependiente de ATP (Akt), y la división del ciclo celular 42 (Cdc42). Hemos encontrado que las acciones observadas de ouabaína estaban mediados a través de un mecanismo dependiente de especies reactivas de oxígeno (ROS) porque la adición de eliminadores de ROS (N-acetilcisteína y glutatión) podría revertir el efecto de la ouabaína sobre la migración celular. Además, ouabaína ha demostrado inhibir el crecimiento del tumor esferoidal y disminuir la adhesión de células cancerosas con las células endoteliales. Sin embargo, el compuesto no tenía ningún efecto significativo sobre la anoikis de las células. En conjunto, estos hallazgos arrojan luz sobre la comprensión de la biología de las células cancerosas mediante la exploración de la nueva función de esta sustancia endógena humana
Visto:. Pongrakhananon V, Chunhacha P, P Chanvorachote (2013) ouabaına Suprime el comportamiento migratorio de pulmón Células cancerígenas. PLoS ONE 8 (7): e68623. doi: 10.1371 /journal.pone.0068623
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Febrero 2013; Aceptado: 30-may de 2013; Publicado: 10 de julio de 2013
Derechos de Autor © 2013 Pongrakhananon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Fondo de Investigación de Tailandia y Fondo de Dotación Ratchadaphiseksomphot. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
comprensión de la base molecular de las células cancerosas en respuesta a sustancias de origen biológico se considera una ayuda esencial para el descubrimiento de nuevas dianas moleculares para terapias de droga. La evidencia sustancial ha indicado que la ouabaína, un inhibidor de la bomba de sodio /potasio, está presente en plasma y tejidos humanos en el intervalo de desde 0,002 hasta 0,77 nM [1] - [3]. Además, se encontró que la ouabaína para estar regulado en varias patologías, incluyendo insuficiencia cardíaca [1], [4], insuficiencia renal [5] y la hipertensión [3], [6]. Recientemente, hemos proporcionado evidencia que indica que la ouabaína sensibiliza factor de necrosis tumoral relacionados ligando inductor de apoptosis (TRAIL) mediada por apoptosis de las células del cáncer de pulmón, y este hallazgo sugiere que ouabaına puede afectar a la biología celular del cáncer [7].
en el cáncer de pulmón, la metástasis se ha convertido en la zona más interesante de la investigación debido a la alta tasa de mortalidad de esta enfermedad está asociada con la metástasis del cáncer [8]. Durante la propagación de células, las células cancerosas deben tener la capacidad de migrar de sus sitios originales en el sistema circulatorio cerca. Aumento de la actividad quinasa de la quinasa de adhesión focal (FAK), una tecla de vía de señalización de control de la motilidad celular, potencia la tumorigénesis y metástasis [9]. También se encontraron Tales alteraciones durante el proceso de adquisición de las células cancerosas metastásicas [10], [11]. FAK controla la transducción de señales de sitios de adhesión focal integrina enriquecido de la interacción célula-matriz extracelular [12]. En cuanto a la regulación de la migración de las células cancerosas, la fosforilación de FAK en Tyr-397 y el reclutamiento de las quinasas de la familia Src son importantes procesos que inician la migración [12] - [13]. Además, el estado activado de varios reguladores migratorios tales como la tirosina quinasa dependiente de ATP (Akt) y el ciclo de división celular 42 (Cdc42) [14], [15] son críticos para el proceso de movimiento de las células. Varios estudios han indicado que la activación de Akt mejora la capacidad de las células cancerosas para migrar e invadir [15], [16]. Akt que se localiza en el borde de las células en movimiento interactúa con proteínas de unión a actina e induce la remodelación de la actina y la formación de protuberancias de la membrana, lo que facilita la motilidad celular [15]. Este concepto fue confirmada por un estudio que muestra que la baja regulación de Akt utilizando una técnica de antisentido provoca una inhibición dramática de la invasión de células de cáncer
in vitro
[17] y
in vivo
[18] . Además, la interacción de FAK y ERK1 /2 se ha demostrado que el control de la motilidad celular [19] - [20]. Recientemente, la familia Rho de pequeñas trifosfatasa de guanosina (GTPasas), especialmente Cdc42, se ha demostrado que desempeñan un papel esencial en la reorganización de la actina y la formación de filopodios. El nivel de expresión de Cdc42 se encontró que era hasta reguladas en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón [21] - [22], y la inducción Cdc42 fue mostrado para mejorar la migración del cáncer [23]
Hasta ahora, el papel. de los niveles endógenos de ouabaína en la regulación de la motilidad de células de cáncer ha sido en gran parte desconocida, y una comprensión de este tipo podría conducir a nuevas terapias contra el cáncer. Por lo tanto, el objetivo fue investigar el posible impacto de esta sustancia biológica sobre la migración celular y la invasión del cáncer en las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas. Por primera vez, se muestra que los niveles endógenos de ouabaına suprimen la motilidad de las células tumorales y se asocian con una disminución de la activación de FAK y Akt y la expresión de Cdc42. Nuestro estudio sugiere la novela hipótesis de que esta sustancia fisiológica tiene un papel regulador negativo en el proceso de la metástasis de células de cáncer.
Materiales y Métodos
Células y Reactivos
La no líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC) H292 y H460 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina. Las células se incubaron en un 5% de CO
2 entorno a 37 ° C. Ouabaína, diacetato de diclorofluoresceína (DCFH
2-DA), poli 2-hidroxietilo (poli-HEMA), 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) bromuro de tetrazolio -2,5-difenil (MTT) y faloidina tetrametilrodamina isotiocianato B se obtuvieron de Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO). El yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342 se obtuvieron de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Los anticuerpos para pan-Akt, Akt-P473, FAK, P397-FAK, Cdc42, caveolina-1 y β-actina, así como anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).
viabilidad celular y la apoptosis ensayos
la viabilidad celular se evaluó utilizando el ensayo MTT. Después de los tratamientos indicados, las células se incubaron con 500 g /ml de MTT a 37 ° C durante 4 h. Una lectura intensidad del producto MTT se midió a 550 nm usando un lector de microplaca, y el porcentaje de células viables se calculó en relación con las células control. La apoptosis se determinó por Hoechst 33342 /PI tinción y análisis del contenido de ADN. Las células se lavaron y se incubaron con 10 mg /ml de Hoechst 33342 y 5 g PI /ml durante 30 min. Los núcleos de condensación y fragmentación del ADN de las células apoptóticas y células necróticas PI-positivo se visualizaron y se puntuaron mediante microscopía de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70). Para el análisis de contenido de ADN sub G0, después del tratamiento especificado, se tripsinizaron las células, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en 70% de etanol a 37 ° C durante 3 h. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato, las células se incubaron en una solución de PI que contiene 0,1% de Triton-X, 1 mg /ml de ARNasa y 1 mg /ml de yoduro de propidio a temperatura ambiente durante 30 min. El contenido de ADN se analizó mediante citometría de flujo (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ).
Detección ROS
niveles intracelulares de ROS se determinaron por citometría de flujo utilizando DCFH-DA como una sonda fluorescente. Brevemente, las células fueron incubadas con 10 mM DCFH
2-DA durante 30 min a 37 ° C, después de lo cual se lavaron, se trataron con tripsina, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato, y se analizaron inmediatamente para la intensidad de fluorescencia por un lector de microplacas.
Migración de ensayo
La migración se determinó mediante ensayos de curación de heridas y transwell. Para el ensayo de curación de la herida, una monocapa de células se cultivó en una placa de 24 pocillos, y un espacio de la herida se hizo con una punta de 1 mm de ancho. Después de enjuagar con PBS, las monocapas de células se incubaron con los tratamientos indicados y se dejaron migrar durante 24 h. Micrografías fueron tomadas con un microscopio de contraste de fases (Olympus DP70, Melville, NY), y los espacios de la herida se midieron a partir de 10 campos aleatorios de vista utilizando el software de controlador de Olympus DP. El análisis cuantitativo de la migración de células se realizó utilizando un espacio promedio herida de esos campos aleatorios de vista, y el porcentaje de cambio en el espacio de la herida se calculó usando la siguiente fórmula:% de cambio = (espacio promedio en el tiempo 0 h) - (espacio promedio en el tiempo de 24 h) /(espacio promedio en el tiempo 0 h) x 100. migración celular relativa se calculó dividiendo el cambio de porcentaje en el espacio de la herida de las células tratadas con el de las células de control en cada experimento. Para el ensayo transwell, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo en la cámara superior de un transwell (8 tamaño de micras de poro) en una placa de 24 pocillos en medio libre de suero y se incubaron con varias concentraciones de ouabaína. se añadió medio RPMI con 10% de SFB a la cámara inferior. Después de la incubación, las células no migradas en la cámara superior se retiraron por limpieza de algodón hisopo, y las células que migraron al lado inferior de la membrana se tiñeron con 10 mg /ml de Hoechst 33342 para 10 min y se visualizaron y se puntuaron bajo una microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
Invasion ensayo
un ensayo de invasión se realizó con un pocillos 24 transwell unidad con policarbonato (PVDF) filtros (8 micras de tamaño de poro). La membrana se recubrió con 0,5% matrigel en la superficie superior de la cámara durante la noche a 37 ° C en un incubador humidificado. Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10
4 células por pocillo en la cámara superior de la unidad transwell en medio libre de suero. Medio que contiene 10% de SFB se añadió a la cámara inferior de la unidad. Después de la incubación con agentes específicos de prueba durante 24 horas a 37 ° C, el medio en la cámara superior se aspiró, y las células en el lado superior de la membrana se eliminó con un bastoncillo de algodón. Las células que invadieron a la cara inferior de la membrana se tiñeron con 10 mg /ml de Hoechst 33342 para 10 min, visualizado y se calificó con un microscopio de fluorescencia.
Cell Morfología y Filopodios Caracterización
morfología de la célula se investigó mediante un ensayo de faloidina-rodamina y tinción sulforrodamina B. Las células se sembraron a una densidad de 10
4 células /pocillo en una placa de 96 pocillos durante la noche. Las células se trataron con varias concentraciones de ouabaína para 24 h. Después, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a 37
° C
, permeabilizaron con 0,1% Triton-X100 en PBS durante 4 min, y se bloquearon con 0,2% de BSA durante 30 min. Entonces, las células se incubaron con faloidina 1:100-rodamina en PBS o 0,4% de sulforrodamina B en ácido acético al 1% durante 15 min, se aclararon 3 veces con PBS, y se montaron con glicerol al 50%. a continuación, la morfología celular se evaluó por formación de imágenes de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70). protrusión filopodios se representa como el número medio de filopodios /célula en relación con las células no tratadas en cada campo.
in vitro Ensayo 3D Tumorigénesis
En la tumorigénesis in vitro 3D se realizó en un matrigel recubierto de 96- así placa. Una placa se recubrió con 0,5% de matrigel y se dejó durante la noche a 37 de solidificación
° C. Las células se suspendieron en medio de cultivo que contiene 4% matrigel y ouabaína (0-30 pM), y se sembraron a una densidad de 10
3 células /pocillo en una placa de matrigel recubierto. Medio que contiene ouabaína (0-30 pM) se reemplazó cada 3 días. Después de 10 días, se visualizaron las células y se calificó con un analizador de imagen bajo el microscopio.
Anoikis Ensayo
Para la evaluación anoikis, cultivo de tejidos placas de seis pocillos se recubrieron con 6 mg /ml de poli (2 placas de hidroxietil-metacrilato de (poli-HEMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en 95% de etanol y se incubaron a 37 ° C para el secado. se sembraron células H292 en poli-recubiertos de HEMA-en medio RPMI que contenía tratamientos indicados para 0-24 h. Después de la incubación con 10 mg /ml de Hoechst 33342 para 30 min, la condensación núcleos y la fragmentación del ADN de las células anoikis se visualizaron y se puntuaron por microscopía de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
independiente del anclaje crecimiento ensayo
crecimiento
independiente del anclaje se determinó por el ensayo de formación de colonias en agar blando. brevemente, las células a partir de cultivos de 6 pocillos de placa en monocapa se prepararon en una suspensión de una sola célula. Las células se suspendieron en RPMI que contiene 10% de FBS y 0,33% de agarosa de baja temperatura de fusión, y 2 × 10
4 células se sembraron en una placa de 35 mm sobre una capa de solidificado RPMI /10% FBS /0,6% de agarosa. Las células se alimentaron cada tres días mediante la adición de 200 l de RPMI /10% de FBS. Las colonias fueron teñidas utilizando 10 mg /ml de Hoechst 33342 para 30 min, visualizados y marcados por el analizador de imagen bajo microscopio de fluorescencia (Olympus IX51 con DP70).
monocapa de células de ensayo de adhesión
HUV-EC C se estimularon con 10 ng /ml de IL-1β de 0-4 h. Después del tratamiento indicado, H292 células (2,5 × 10
4 células /ml) se añadieron a un cultivo de monocapa semi-confluente de HUV-EC-C, se incubaron durante 20 min a 37 ° C con rotación a 120 rpm, y se lavaron ampliamente para excluir la unión celular no específica. El número de células unidas se contó directamente bajo un microscopio de fluorescencia.
Western Blotting
Después de tratamientos específicos, las células se incubaron en tampón de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 % de Triton X-100, cloruro de sodio 150 mM, 10% de glicerol, 1 mM ortovanadato de sodio, fluoruro de sodio 50 mM, 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y un cóctel inhibidor de la proteasa comercial (Roche Molecular Biochemicals) durante 30 min en hielo. Se recogieron los lisados celulares y se determinó el contenido de proteína utilizando el método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cantidades iguales de proteína de cada muestra (60 g) se desnaturalizaron por calentamiento a 95 ° C durante 5 min con tampón de carga de Laemmli y, posteriormente, se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Después de la separación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa 0,45 mm (Bio-Rad). Las membranas transferidas se bloquearon durante 1 h en leche en polvo desnatada al 5% en TBST (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) y se incubaron con los anticuerpos primarios apropiados a 4 ° C durante la noche. Las membranas se lavaron dos veces con TBST durante 10 min y se incubaron con anticuerpos secundarios específicos de isotipo acoplados a peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente. Los complejos inmunes se detectaron mediante la mejora con un sustrato de quimioluminiscencia. (Supersignal West Pico; Pierce) y se cuantificaron usando software analista /PC densitometría (Bio-Rad)
Análisis estadístico
media de los datos de independiente experimentos se normalizaron a los resultados a partir de células en el grupo de control. Todos los experimentos se repitieron al menos cuatro veces. Un análisis estadístico entre los dos grupos fue verificada por la prueba t de Student, y para comparar a varios grupos, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) con una prueba post-hoc. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
característica migratorias de células no pequeñas cáncer de pulmón de células H292
Para probar el efecto de ouabaína en la migración de células de cáncer de pulmón, lo primero que caracteriza el perfil de la migración de las células H292 mediante la migración de la herida y transwell ensayos. Figs. 1A y B muestran que las células H292 emigraron a través del espacio de la herida de una manera dependiente del tiempo, y los resultados fueron consistentes con los obtenidos en el ensayo de migración transwell
A:. Monocapas confluentes de células H292 resultaron heridas usando una 1 mm de ancho punta y se deja migrar por 0-24 h. El espacio de la herida se visualizó bajo el microscopio, y los niveles de migración relativa en comparación con se calcula el punto de tiempo 0 h. Los datos representan la media ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 vs. valor en el punto de tiempo 0 h. B: la migración de células H292 se examinó mediante un ensayo transwell de 0-24 h. células migratorias en el lado basolateral de la membrana se tiñeron con Hoechst 33342 para 30 min y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los datos se representan como un número medio de células en cada campo y representan las medias ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 vs. valor a las 0 h punto de tiempo. C: Las células H292 se trataron con varias concentraciones de ouabaína (0-5,000 pM) durante 24 h. La supervivencia celular se determinó mediante un 3- (4,5-dimethly-tiazol-2-il) bromuro (MTT) ensayo de -2,5-difenil tetrazolio. La viabilidad de las células no tratadas se representa como 100%. Los datos representan la media ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células control sin tratar. D: La muerte celular apoptótica se evaluó mediante tinción con Hoechst 33342. Los datos representan la media ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células control sin tratar. E:. Apoptosis celular se determinó mediante análisis de contenido de ADN mediante citometría de flujo
A continuación, un experimento de citotoxicidad se realizó para probar si las concentraciones biológicas de ouabaína afectan la viabilidad de células H292. Las células se cultivaron en ausencia o en presencia de ouabaína (10-5000 pM), y se determinó la viabilidad de las células utilizando un ensayo de MTT a 24 h. Los resultados indican que las concentraciones de uabaína en los niveles endógenos (2-770 pM) causaron efectos tóxicos ni ni de proliferación en estas células de cáncer de pulmón (Fig. 1C). Mientras que las concentraciones de esta sustancia hasta 1000 nM no indujo apoptosis, 5000 nM ouabaína redujo significativamente la viabilidad celular (Fig. 1 C) y la muerte celular mediada por detectada por un 33342 ensayo de tinción nuclear Hoechst (Fig. 1D). Además, las células se trataron con 0-500 ouabaína pM durante 24 h, y las células se sometieron a citometría de flujo para sub G
0 determinación fracción. Higo. 1E muestra que el tratamiento de las células con 10 a 500 pM ouabaína causó ninguna alteración significativa de la sub G
0 fracción en comparación con la de las células control no tratadas. Estos resultados sugieren que las concentraciones de ouabaına encuentran en el plasma y los tejidos humanos no afectan a la viabilidad de las células H292.
ouabaína inhibe el cáncer de pulmón migración celular y la invasión
concentraciones endógenas de ouabaína se probaron más de su posible efecto sobre la migración de las células cancerosas. Las células fueron tratadas con ouabaína 0-30 pM y utilizados en ensayos de migración de 24 h. Un ensayo de migración herida mostró que ouabaína suprimió la migración de células H292 de manera dependiente de la dosis en comparación con las células de control sin tratar (Fig. 2A). A la concentración de 20 pM, ouabaína causó una reducción aproximada del 50% en la actividad migratoria de las células. Además, el ensayo de migración transwell proporcionado datos de apoyo que indica que la ouabaína significativamente la migración de células inhibida (Fig. 2B). Aunque los mecanismos y la regulación de la migración celular y la invasión del cáncer no se conocen por completo definidos, los estudios han sugerido que están asociados vías de señalización [24]. El efecto de ouabaína en el potencial invasivo de las células cancerosas se ensayó adicionalmente usando un ensayo transwell matriz recubierto extracelular. Se añadieron las células a la transwell y se trataron con las concentraciones indicadas de ouabaína para 24 h. Higo. 2C muestra que el tratamiento ouabaína reduce sustancialmente el número de células H292 invadidos comparación con las células de control sin tratar con una reducción aproximada del 50% encontrado en respuesta a ouabaína 20 pM
A:. Monocapas confluentes de células H292 fueron heridos con un 1 -mm-punta ancha y se incubaron con ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. El espacio de la herida se analizó y se representa como el nivel de migración en relación con el cambio de las células no tratadas. B: células migratorias se tiñeron con Hoechst 33342 para 30 min, se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia y representado como un número medio de células en cada campo. C: invasión celular se evaluó utilizando un transwell revestido con matrigel como se describe en
Materiales y Métodos
. Después de 24 h, las células que invadieron a través de la membrana se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia y se representan como un número medio de células en cada campo. Los datos representan la media ± SD (n = 4). *
P
. & Lt; 0,05 frente a células control sin tratar
ouabaına Reduce Filopodios Formación en células H292
plasma protuberancias de la membrana llamada incremento filopodios durante el movimiento celular, y la formación de filopodios está implicado en la migración de células de cáncer y la metástasis [25]. Después de haber demostrado que inhibe ouabaına la migración y la invasión de las células, se determinó aún más el efecto de esta sustancia en la presencia de filopodios en células H292. Las células se cultivaron en presencia o ausencia de ouabaína (30 pM) durante 24 h, y la protrusión de filopodios fue capturado en los modos de fluorescencia y contraste de fase de un microscopio usando ensayos faloidina y sulforrodamina B, respectivamente. Higo. 3A muestra que las células H292 en el estado en movimiento exhiben un número considerable de salientes filopodios que se redujo dramáticamente en respuesta a los tratamientos ouabaína. Estos resultados sugieren que la reducción de filopodios en las células puede, al menos en parte, jugar un papel en el papel regulador negativo de ouabaína. suficiente evidencia ha indicado que la formación de filopodios en las células cancerosas implica la proteína Cdc42 [26] - [28]. Debido a que el nivel de expresión de Cdc42 se demostró estar estrechamente asociado con la formación de filopodios, se investigó aún más el mecanismo de ouabaína en la regulación de filopodios en estas células mediante la determinación de la expresión celular de Cdc42. Los resultados indican que el nivel de expresión de Cdc42 se redujo dramáticamente en respuesta a los tratamientos ouabaína (Fig. 3B). Aunque se detectó un nivel adecuado de esta proteína en las células no tratadas, 30 pM ouabaína casi abolió la expresión Cdc42. Esta información sugiere que la ouabaína puede reducir la actividad migratoria de estas células a través de Cdc42 atenuación
A:. Células H292 se trataron con 30 pM ouabaína (OB) o se deja sin tratar como control de las células durante 24 h. Las células se tiñeron con sulforrodamina B, ya sea o faloidina y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia a 40 ×. protuberancias filopodios se indican mediante flechas y se representan como un número medio de filopodios por célula en cada campo en relación con las células no tratadas. Los datos representan la media ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células control sin tratar. B: Después de que el tratamiento indicado, se recogieron y analizaron para el ciclo de división celular 42 (Cdc42) expresión por transferencia Western de las células. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría, y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Las barras son la media ± SD (n = 4). *
P
. & Lt; 0,05 frente a células control sin tratar
ouabaına reduce la activación de FAK, Akt y ERK a través de un mecanismo dependiente de ROS-
Para dilucidar los mecanismos de inhibición de la motilidad de células de cáncer por ouabaína, el presente estudio determinó la expresión y los niveles activados de las proteínas implicadas en la migración celular. Las células fueron tratadas con concentraciones no tóxicas de ouabaína o se dejan sin tratar, y Akt, Akt activado (Akt fosforilada en Ser473) [29], FAK, activan FAK (FAK fosforilada en Tyr-397) [24] y los niveles de Cav-1 se determinaron por análisis de transferencia Western. Higo. 4 muestra que el tratamiento de las células con ouabaína (0-30 pM) sustancialmente reducido regulado la expresión de Akt activado y activado FAK preservando al mismo tiempo sus homólogos no activados. Estos resultados sugieren que la ouabaína interfirió con el nivel activado de las proteínas y la migración celular y la invasión posiblemente regulada mediante la inhibición de Akt y FAK vías aguas abajo. Recientemente, nosotros y otros han indicado la considerable papel de Cav-1 en el cáncer de pulmón invasivo y actividades migratorias. Además, la prueba de si ouabaına atenúa la motilidad celular a través de los niveles de Cav-1 disminuyó. Inesperadamente, el nivel de Cav-1 en respuesta al tratamiento ouabaína no fue alterada (Fig. 4)
A:. Células H292 se trataron con ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. Las células se recogieron y se analizaron para quinasa de adhesión focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr397), ATP-dependiente de tirosina quinasa (Akt), fosfo-Akt (p-AKT, Ser473), y la caveolina-1 ( Cav-1) la expresión por transferencia Western. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. B: Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría, y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Las barras son la media ± SD (n = 4). *
P
. & Lt; 0,05 frente a células control sin tratar
Hemos demostrado que la migración de las células del cáncer está estrechamente asociada con el estado oxidativo de las células. Los datos anteriores indican que la actividad migratoria de las células cancerosas se atenuó significativamente en respuesta a los tratamientos antioxidantes [30]. Para aclarar el posible efecto regulador de ouabaína en este contexto, las células fueron tratadas con antioxidantes en la presencia o ausencia de ouabaína y su comportamiento migratorio y los niveles de ROS celulares fueron evaluados. Figs. 5A y 5B muestran que el tratamiento con los antioxidantes conocidos de células permeables a glutatión (GSH) y N-acetilcisteína (NAC) aumentó significativamente la migración de las células ouabaína tratados, lo que confirma el papel de ROS en la actividad migratoria de células que se suprime por ouabaína . Además, los niveles de ROS intracelulares se determinaron en las células incubadas con ouabaína, GSH y NAC. ROS detectado por una sonda específica oxidativo mostró que ROS celular incrementado en respuesta a los tratamientos ouabaína (10 a 30 pM), en comparación con control no tratado, mientras que ni NAC ni GSH solo tuvieron un efecto sobre la motilidad de las células o los niveles de ROS endógeno. Es importante destacar que, la adición de GSH y NAC en las células tratadas con ouabaína suprimió significativamente la producción de ROS provocada por ouabaína (Fig. 1C). Además, proporcionamos un vínculo entre ROS celular y el estado de activación de Akt y FAK. Las células se pre-trataron con GSH o NAC en la presencia o ausencia de ouabaína y los niveles de Akt, Akt activan, FAK y activados FAK se determinó como se ha descrito anteriormente. Los resultados indican que la administración de los antioxidantes invirtió el efecto de regulación hacia abajo de ouabaína en Akt activado y activado FAK, mientras que las formas no fosforiladas de las dos proteínas no se vieron afectados (Fig. 6). Estos resultados no sólo proporcionan evidencia de un efecto pro-oxidante de ouabaína, sino que también indican el posible mecanismo de ouabaína en la inhibición de la migración celular a través de un mecanismo dependiente de ROS-
A:. Monocapas confluentes de células H292 fueron heridos mediante el uso de una punta de 1 mm de ancho y se incubaron con antioxidantes, glutatión 1 mM célula-permeable (GSH) o 5 mM N-acetil cisteína (NAC) en presencia o ausencia de ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. El espacio de la herida se analizó y se representa como el nivel de migración en relación con el cambio de las células no tratadas. B: La migración celular fue capturado utilizando un microscopio. C: Las células se pretrataron con cualquiera de GSH 1 mM o NAC 5 mM durante 30 min en presencia o ausencia de ouabaína 30 pM o ouabaína (0-30 pM) solo durante 0-3 h. Las células fueron incubadas con diclorofluoresceno diacetato (DCFH
2-DA) durante 30 min, y la intensidad de fluorescencia se analizó mediante un lector de microplacas. Intensidad media se normalizó a las células control no tratadas, representado como los niveles de ROS relativos. Los puntos de datos son medias ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células control sin tratar.
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P Hotel & lt; 0,05 frente a células tratadas con ouabaína 30 pm
R: H292 fueron pretratados con cualquiera de GSH 1 mM o NAC 5 mM durante 30 min. en presencia o ausencia de ouabaína (30 pM) durante 24 h. Las células se recogieron y se analizaron para la quinasa de adhesión focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), dependiente de ATP de la tirosina quinasa (Akt) y fosfo-Akt (p-AKT, Ser-473) expresión por Western Blot. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. B: Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría, y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Las barras son la media ± SD (n = 4). *
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. & Lt; 0,05 frente a células control sin tratar
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ouabaına reduce la migración y la invasión de células de NSCLC H460
para probar si ouabaına fue capaz de inhibir la migración en otras células del cáncer de pulmón, se trataron el no microcítico de pulmón de células línea celular de cáncer humano H460 con ouabaína (0-30 pM) y se sometieron las células a un ensayo de migración. En particular, los resultados de MTT utilizando las células H460 indicaron que el tratamiento con ouabaína en 0-30 pM no causó ningún efecto significativo sobre la viabilidad de las células (datos no presentados). En consonancia con los resultados obtenidos a partir de las células H292, el tratamiento de las células H460 con ouabaína a las concentraciones indicadas de migración celular significativamente atenuada de una manera dependiente de la dosis (Fig. 7A). Además, se determinó la expresión de proteínas y sus homólogos activados. resultados de transferencia Western indicaron que el tratamiento con ouabaína parecida altera en activa Akt, activado FAK, y activados ERK, mientras que las proteínas no activadas y Cav-1 en los niveles no se vieron afectados por el tratamiento (Fig. 7B).
A Las monocapas confluentes de células H460 fueron heridos por el uso de una punta de 1 mm de ancho y se incubaron con ouabaína (0-30 pM) durante 24 h. El espacio de la herida se analizó y se representa como el nivel de migración en relación con el cambio de las células no tratadas. Los datos son la media ± SD (n = 4). *
P Hotel & lt; 0,05 frente a células control sin tratar. B. En las mismas condiciones de tratamiento, se recogieron las células y se analizó la quinasa de adhesión focal (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), dependiente de ATP de la tirosina quinasa (Akt), fosfo-Akt (p- AKT, Ser-473) y la caveolina-1 (Cav-1) la expresión por Western Blot. Las transferencias se volvieron a sondar con β-actina para confirmar la igualdad de carga. Las señales de inmunotransferencia se cuantificaron por densitometría, y datos de la media de experimentos independientes se normalizaron a los resultados. Las barras son la media ± SD (n = 4). *
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. & Lt; 0,05 frente a células control sin tratar
ouabaına Suprime el crecimiento tumoral en el tumor 3D esferoide Condición e inhibe el desprendimiento de células
Después de haber mostrado el papel de ouabaına en la migración de células de cáncer, el próximo investigó la posible regulación de la metástasis del cáncer por ouabaína.