Extracto
La transición epitelio-mesenquimal (EMT) inducida por EGF promueve la progresión del cáncer de cuello uterino; sin embargo, los mecanismos subyacentes a la EMT inducida por EGF no están claros. En este estudio, se informó de que la sobreexpresión suprime miR155 EMT inducida por EGF, disminución de la capacidad de migración /invasión, inhibe la proliferación celular y el aumento de la sensibilidad a la quimio-DDP en células de cáncer de cuello uterino Caski humanos. Además, la sobreexpresión de miR155 aumento de la expresión TP53 pero redujo SMAD2, y los niveles de expresión del gen CCND1. Estos datos sugieren que miR155 regula negativamente EMT inducida por EGF. Concluimos que miR155 no actúa como un oncogén, sino como un supresor de tumores en las células Caski
Visto:. Lei C, Wang Y, Huang Y, Yu H, Huang Y, Wu L, et al. miR155 (2012) hasta reguladas Invierte la transición epitelio-mesénquima inducida por EGF e incrementa la sensibilidad a la quimio-cisplatino en células de cáncer cervical Caski humano. PLoS ONE 7 (12): e52310. doi: 10.1371 /journal.pone.0052310
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Agosto, 2012; Aceptado: 16 de noviembre de 2012; Publicado: December 20, 2012
Derechos de Autor © 2012 Lei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hubei (concesión no. 2011CDB181), Fondo de Investigación Independiente, Universidad de Wuhan (n. ° 201130302020016). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no hay intereses en competencia exsit
Introducción
el cáncer cervical es el segundo tipo de tumores malignos para las mujeres, y que pone en peligro la salud de las mujeres, especialmente en los países en desarrollo. La metástasis y la invasión son las razones principales de muerte en los casos de cáncer de cuello uterino, por lo que es importante aclarar los mecanismos moleculares de estos fenómenos. Se ha informado de que la transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso importante implicado en la metástasis tumoral y la invasión [1]. Las principales características de EMT incluyen la disolución de uniones estrechas epiteliales, la remodelación del citoesqueleto, la pérdida de la polaridad apical-basal, y la adquisición de marcadores mesenquimales, tales como N-cadherina y vimentina. EMT dota células tumorales con mayores capacidades invasivos /metastáticos, tallo características similares a células, la resistencia a la apoptosis, y la tolerancia inmune [2].
EGF (factor de crecimiento epitelial) es uno de los factores de regulación de EMT más importantes que desencadena EMT en una variedad de tumores sólidos, incluyendo cáncer cervical. Se ha informado de que los tumores con expresión del receptor de EGF alta tienen mal pronóstico clínico y EMT EGF inducida puede ser una razón para este [3] - [5]. Por lo tanto, la prevención de la EMT inducida por EGF podría ser un método adecuado para inhibir la invasión y la metástasis.
Los estudios recientes han sugerido que los miRNAs juegan un papel importante en la regulación de la EMT [6], [7]. miRNAs son los ARN no codificantes de 18 a 25 nucleótidos de longitud que pueden regular la expresión génica mediante la aceleración de la degradación y la inhibición de la traducción de ARNm diana. Entre los miRNAs identificados hasta la fecha, miR155 se asocia con la proliferación tumoral y se sobreexpresa en muchos tumores humanos [8]. Un estudio ilustra que la expresión anormal de miR155 fue un evento temprano en el cáncer de páncreas y estrechamente relacionado con una baja tasa de supervivencia [9]. En el cáncer de endometrio, la ocurrencia de EMT fue acompañado por elevados niveles de expresión miR155 [10]. Aún no está claro si miR155 está involucrado con la aparición de la EMT en el cáncer de cuello uterino. En este estudio, el uso de EGF como un factor EMT-inducir en células de cáncer cervical humano, exploramos las funciones de regulación de miR155 en el proceso de EMT, la proliferación celular, la sensibilidad celular a fármacos quimioterapéuticos, y se evaluó el valor potencial de miR155 como una diana molecular para la prevención temprana de la invasión del cáncer de cuello uterino y la metástasis.
Materiales y Métodos
Líneas celulares
células Caski se adquirió de la célula Banco de China (Wuhan) y se cultivaron a 37 ° C en CO2 5% en RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 unidades /ml de penicilina.
Aislamiento de ARN y de detección de miRNA
ARN de las células cultivadas se aisló con Trizol reactivo (Invitrogen) y luego se utilizó para la síntesis de primera cadena de ADNc. La detección de los miRNAs madurado se realizó con PCR utilizando el SYBR Premezcla Ex Taq
tm (TAKARA). U6 se utilizó como control interno. Los cebadores usados en este experimento se muestran en la Tabla S1.
Construcción de plásmidos y Transfección Estable /transitoria de miR155
Un fragmento de ADN genómico humano de aproximadamente 400 pb que contiene la secuencia de miR155 se clonó en el pcDNA3.1-GFP vector. El plásmido pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 resultante lleva una secuencia de ADN recombinante para GFP y el fragmento que contiene miR155. Para generar una línea celular que expresa de forma estable miR155, las células Caski fueron transfectadas con pcDNA3.1-GFP-miR155 usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de la selección con G418, el clon único que sobreexpresado en miR155 fue identificado. Para miR155 sobreexpresión transitoria, se utilizaron imita miR155 (RIBOBRO) para transfectar las células Caski.
in vitro
Migración y
se utilizó transwell ensayo basado en Matrigel una invasión Ensayos al ensayo de migración celular y la invasión
in vitro
que se describió anteriormente [11]. Para el análisis de las propiedades invasivas, 2 × 10
4 células se sembraron en la parte superior de los insertos de cultivo celular recubiertas con Matrigel en 200 l de medio RPMI-1640 sin FBS y se incubaron durante 24 horas. A continuación, los insertos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en 4% de paraformaldehído. Después de ser teñida con hematina, las células invasoras se contaron bajo el microscopio. El ensayo de migración se llevó a cabo por el mismo camino descrito anteriormente excepto que Matrigel no se revistió en los insertos.
Western Blot (WB)
proteína total fue extraído de las células utilizando tampón de lisis celular (0,5 % NP-40, 0,5% SDS, 1,5 mM Tris-HCl pH 7,4, y NaCl 15 mM). Las muestras de proteína (20 ug /carril) se sometieron a electroforesis, se transfirieron a membranas de PVDF y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios contra E-cadherina (sc-7870, Santa Cruz Biotechnology), N-cadherina (BA0637, BOSTER), MMP1 (130-1- 16, RayBiotech) y Anexina A2 (A2485, Sigma). Las membranas se trataron con anticuerpo de cabra anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Invitrogen). Las bandas de proteína diana se determinaron utilizando los reactivos incluidos en el ECL + plus kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.).
inmuno fluorescencia Análisis
Inmuno fl análisis de fluorescencia se utilizó para analizar los niveles de expresión de e-cadherina con anticuerpos contra la e-cadherina (sc-7558, Santa Cruz Biotechnology), y la expresión de N-cadherina con anticuerpos contra cadherina N (BA0637, BOSTER) como se ha descrito anteriormente [12].
Ensayo de proliferación celular
Caski y CaSki-miR155 fueron sembradas en placas de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron hasta 70% de confluencia. Las células fueron tratadas con DDP (cis-diaminodicloroplatino, DDP) por 0-3 días en un medio RPMI-1640. El medio de cada pocillo se retiró y se añadieron 100 l (metil tiazolilo tetrazolio, MTT) solución (0,25 g /L en medio RPMI-1640). Después de incubación a 37 ° C durante 4 horas, se retiró el medio y se añadió 200 l DMSO a cada pocillo. Se registró la absorbancia (A) a 570 nm. La tasa de velocidad de crecimiento celular y el inhibidor se calcula como sigue:
fueron cosechadas Citometría de Flujo
células Caski y Caski-miR155 en la fase de crecimiento logarítmico y se fijaron durante la noche con 80% de etanol. Después, las células se lavaron con PBS frío, se tiñeron con yoduro de propidio (PI, 0,05 mg /ml) y RNasa A (0,5 mg /ml). Citometría de flujo análisis se utilizó para determinar la distribución de células en el ciclo celular sub-fases y para medir el pico de la apoptosis inducida por DDP (10 mmol /ml) durante 24 horas.
Análisis estadístico
todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). El análisis estadístico entre los grupos se evaluó mediante la prueba t y ANOVA de dos colas de Student. Los valores de P inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
EMT EGF induce en células Caski
Se ha informado de que el receptor de EGF es muy elevada en el células de cáncer cervical, lo que sugiere que la exposición EGF pueden inducir EMT en las líneas de células del cuello del útero [13], [14], [15]. En este experimento, las células Caski se cultivaron en condiciones de rutina con o sin EGF (50 ng /ml) durante 1, 3, o 5 días, y se determinaron los cambios relacionados con la EMT. El cambio morfológico se visualizó primero en este proceso. Después de la estimulación de EGF, las células Caski se hicieron más fusiforme y la conexión entre las células disminuyó (Figura 1A). Cuando la E-cadherina (E-cad) expresión fue ensayada por el BM, los resultados ilustran que la exposición EGF downregulated la expresión de E-cad en comparación con las células control (Figura 1B). La regulación a la baja similar de la expresión de E-cad se verificó por un ensayo de IF en la que las células Caski se trataron con EGF (50 ng /ml) durante 3 días (Figura 1C). En el mismo punto de tiempo, también se detectó la expresión de otros factores relacionados con la EMT-(N-cadherina, MMP1 y anexina A2) por WB y encontramos que los tres factores se upregulated (Figura 1D). Estos datos indican que el EGF puede inducir EMT en las células Caski. Se cultivaron
células Caski en condiciones de rutina con o sin EGF (50 ng /ml) durante 1 a 5 días. A. Los cambios morfológicos causados por EGF se observaron por microscopía. B. La regulación por disminución de la E-cadherina por tratamiento con EGF se determinó por Western blot. El análisis densitométrico de tres transferencias de Western por triplicado independientes. C. E-cadherina regulación a la baja en respuesta a EGF tratamiento (50 ng /ml) durante 3 días se verificó por IF. D. Regulación al alza de N-cad, MMP1 y anexina A2 en el proceso de EMT como investigado por transferencia de western. El análisis densitométrico de tres transferencias de Western por triplicado independientes. Los valores son la media de determinaciones triples con el S.D. indicada por barras de error. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01, comparado con el control
miR155 está regulada positivamente en la EMT inducida por EGF
El ARN total se purificó a partir del mesenchymal- inducida por EGF como las células normales y células Caski Caski. Los niveles de expresión de miR155 o miR200c se detectaron mediante la realización de PCR en tiempo real en estos ARN totales. Los resultados mostraron que en comparación con las células normales Caski, miR155 se upregulated en gran medida en las células Caski mesenquimales, pero no se observó cambio de nivel de expresión de miR200c, que fue encontrado ser downregulated durante el proceso de EMT en muchos tumores sólidos por otros estudios [ ,,,0],16], [17] (Figura 2).
A. Los niveles relativos de expresión de miR155 y miR200c fueron detectados por PCR en tiempo real. miR155 se upregulated con 3 días de tratamiento con EGF (50 ng /ml), y ningún cambio se encontró en el nivel de expresión miR200c bajo estimulación EGF. La expresión proporción relativa en miR155 EGF tratamiento /control es 12.21. Los experimentos se repitieron 3 veces. Se utilizó la prueba T para el análisis estadístico; ** P & lt; 0,01. B. El upregulated nivel de expresión miR155 se verificó por PCR de transcripción inversa. U6 se utilizó como un control interno, Lane 1 y 2 son el tratamiento de EGF, carril 3 es el control negativo, 4 carril está marcador, carril 5 y 6 son de control (sin EGF).
La sobreexpresión de miR155 inhibe la EMT
a pesar de miR155 se reguló en gran medida en el proceso de EMT inducida por EGF, es posible que esto es sólo un evento de compensación o un fenómeno relacionado. Para aclarar aún más el papel de miRNA155 en el proceso de EMT, una línea celular Caski con sobre-expresado miR155 (Caski-miR155) fue creado mediante la transfección de plásmido pcDNA3.1-GFP-miR155 en las células Caski, con la expresión miR155 revisada por un verdadero PCR-tiempo (Figura 3A). El uso de esta línea celular como un modelo, se encontró que la sobreexpresión de miR155 inhibió el crecimiento celular e interfirió con el ciclo celular por la disminución de la proporción de células en la fase S (17% en las células de control Caski, 5,4% en Caski-miR155) pero aumentando la proporción de células en la fase G1 (63,7% en las células de control Caski, 81,4% en Caski-miR155), como se muestra en la Figura 3B. La regulación a la baja inducida por EGF de la expresión de E-cadherina se invirtió en parte por imita miR155 transitoriamente transfectadas (Figura 3C). Con miR155 sobreexpresión, la morfología de las células se hizo más cuboidal. Después de 3 días de tratamiento con EGF (50 ng /ml), sólo una pequeña porción de las células Caski-miR155 se transformaron a fusiforme células (Figura 3D). Estos resultados indican que la sobreexpresión de miR155 inhibida EMT inducida por EGF.
A. Después de pcDNA3.1-GFP-miRNA-155 de la transfección, el nivel de expresión miR155 aumentó más de 12 veces, pero no se observó diferencia significativa para la expresión miR200c. El experimento se repitió 3 veces de forma independiente. ** P & lt; 0,01 en comparación con las células de control. B. La proliferación celular se ensayó mediante MTT. Los resultados muestran que la sobreexpresión miR155 inhibió significativamente la tasa de crecimiento celular. P & lt; 0,05 en comparación con las células de control. La citometría de flujo se utilizó para probar los efectos de la sobreexpresión miR155 sobre el ciclo celular. Los resultados muestran una disminución en la proporción de células en fase S (17% en las células de control Caski, 5,4% en Caski-miR155), pero una proporción de células aumentado en fase G1 (63,7% en las células de control Caski, 81,4% en Caski-miR155). El experimento se repitió 3 veces de forma independiente. P & lt; 0,01 en comparación con las células de control. C. E-cad expresión fue probado por Western blot. nivel de expresión de E-cadherina se redujo en gran medida por los 3 días de EGF (50 ng /ml) la exposición de las células Caski. El análisis densitométrico de tres transferencias de Western por triplicado independientes. Los valores son la media de determinaciones triples con el S.D. indicada por barras de error. * P & lt; 0,05. Este efecto fue impedido en parte por la transfección con imita miR155. D. Los cambios morfológicos causados por la sobreexpresión miR155. células Caski-miR155 son más cúbica que las células normales Caski. Cuando son tratados con EGF (50 ng /ml) durante 3 días, sólo una pequeña fracción de células Caski-miR155 se transformaron en las células fusiformes similares.
TP53 y SMAD2 se han relacionado con la EMT vía de reglamentación [18], [19]. Cribando TargetScan (http://www.targetscan.org), TCF4, CCND1 y SMAD2 se prevé que sean los genes diana de miR155. Por lo tanto, se investigó TP53, SMAD2, TCF4, CMYC y los niveles de expresión de ARNm en las células CCND1 Caski tratados con EGF (50 ng /ml) durante 3 días con o sin la transfección de imita miR155 (Figura 4). Los resultados mostraron que TP53 se downregulated en el proceso de EMT inducida por EGF y upregulated de miR155 sobreexpresión, pero la expresión inducida por TP53 miR155 se invirtió completamente mediante el tratamiento EGF. miR155 sobreexpresión disminución de la expresión SMAD2. Aunque TCF4 fue verificada como una proteína diana miR155 por otro grupo [20], no se observaron cambios estadísticamente significativos en nuestros experimentos para la expresión TCF4 ARNm en las células inducida por EGF y miR155 imitan transfectadas. Además, no se observaron cambios para CMYC, que es un blanco de abajo y está regulada por TCF4. CCND1 (una proteína reguladora del ciclo celular y otro blanco de abajo TCF4) nivel de expresión de ARNm se downregulated por miR155 sobreexpresión y pueden revertirse parcialmente por tratamiento con EGF. Por lo tanto, se supone que miR155 invierte EMT-EGF inducida por la regulación al alza de TP53, la regulación negativa de Smad2 niveles de expresión, y el control del crecimiento celular mediante la inhibición de la expresión del gen CCND1.
A. sitios en el 3'UTR de Smad2, TCF4 y CCND1 ARNm predicho miR155 vinculante. B. TP53, SMAD2, TCF4, cmyc y mRNA CCND1 niveles de expresión se analizaron por PCR en tiempo real en las células Caski tratados con EGF (50 ng /ml) durante 3 días, con o sin la transfección de imita miR155. TP53 se downregulated por tratamiento EGF pero significativamente upregulated por miR155 sobreexpresión. Esta expresión TP53 aumento fue revertido por el tratamiento de EGF. SMAD2 se downregulated por tanto el tratamiento y la sobreexpresión de EGF miR155. El tratamiento de las células que sobreexpresan miR155 con EGF resultó en una disminución adicional de Smad2. No se observaron cambios significativos en TCF4 o ARNm CMYC entre las células tratadas con EGF y transfectadas-mímica miR155. CCND1 expresión de ARNm se downregulated por la sobreexpresión miR155, y esta regulación a la baja se invirtió parcialmente por tratamiento con EGF.
La sobreexpresión de miR155 inhibe la migración y la invasión Habilidades de células Caski
Para dilucidar la efectos de miR155 sobre la migración y la invasión de las células Caski
in vitro
, transwell invasión /se llevaron a cabo los ensayos de migración (Figura 5). Caski-miR155 y células normales Caski se sembraron en los insertos. Después de 24 horas, se calculó el número de las células que había transferido al lado inferior de la membrana para cuantificar la capacidad de invasión y migración. El número de células que pasa a través de la membrana fue significativamente menor en las células Caski-miR155 que en las células normales Caski. Por lo tanto, se supone que miR155 evita las capacidades invasivas y migración en células Caski
in vitro
.
Células
Caski-miR155 y Caski se sembraron en Transwell inserta con o sin Matrigel. Los insertos fueron fijadas y teñidas después de 24 horas, y luego se contaron las células migratorias /invasores bajo un microscopio. El número de células Caski-miR155 que pasan a través de la membrana fue significativamente menor que en las células normales Caski, ya sea detectado por los ensayos de migración o invasión. Los valores son la media de determinaciones triples con el S.D. indicada por barras de error. * P & lt;. 0,05
miR155 Aumento de la quimio-sensibilidad de las células a Caski DDP
El método MTT se utiliza para detectar el efecto de la sobreexpresión miR155 en la quimio-sensibilidad de Caski células a DDP. Los resultados indicaron que la tasa de inhibición de Caski-miR155 cuando tratada por DDP eran mucho más alta que la de las células Caski normales de una manera dependiente de la dosis. La tasa de proliferación de las células Caski-miR155 cuando son tratados por DDP fue mucho más lento que el de las células Caski normales de una manera dependiente del tiempo (Figura 6 A, B). El tratamiento con DDP (10 mmol /L) durante 24 horas como resultado una proporción de células apoptóticas mucho mayor en las células Caski-miR155 que en las células Caski normales (Figura 6C). El nivel de expresión de la anexina A2, una proteína implicada con la resistencia a la apoptosis, se determinó por WB. Estos resultados no muestran que la anexina A2 se downregulated por miR155 sobreexpresión (Figura 6D).
A. células Caski y Caski-miR155 fueron tratados con diferentes dosis de DDP durante 24 horas, y la tasa de inhibición se evaluó mediante un ensayo MTT. Media ± SD, n = 4, P & lt; 0,05 por ANOVA. B. La proliferación celular se evaluó con un ensayo MTT. células Caski y Caski-miR155 fueron tratados con DDP (10 mmol /L) por 0-3 días. Media ± SD, n = 4, P & lt; 0,05 por ANOVA. C. Microscopía se utiliza para observar la apoptosis de las células Caski y Caski-miR155 inducidos por DDP (10 mmol /L) durante 1 día. Las células fueron cosechadas, y FCM se utilizó para analizar la apoptosis. Las flechas indican la ubicación del pico de apoptosis. D. expresión de Anexina A2 se determinó mediante Western blot. La expresión de la anexina A2 no estaba regulado por la sobreexpresión miR155 y podría ser regulada positivamente por el tratamiento de EGF. El análisis densitométrico de tres triplicado Occidental independiente blots.P & gt; 0,05, comparado con miR155- miR155 +, * P & lt; 0,05, comparado con EGF EGF +
Discusión
EMT es una. proceso dinámico que puede ser regulado y revertido por muchos factores, incluyendo miRNAs. En este estudio, hemos utilizado la línea celular de cáncer de cuello uterino Caski humano como modelo para investigar el papel de miR155 en EMT inducida por EGF y trató de responder a la pregunta de si miR155 regula EMT y tiene un papel en la metástasis y quimio-sensibilidad.
se utilizó primera EGF para inducir la EMT en las células Caski, que fue verificada por e-cadherina, N-cadherina, la expresión y la morfología celular. El nivel de expresión miR155 se determinó por RT-PCR. Un aumento de 12 veces del nivel de expresión miR155 se observó después del tratamiento con EGF, pero no se encontró ningún cambio para miR200c, que había sido informado de que se downregulated en el cáncer de páncreas y otros tumores sólidos [16], [17]. Por lo tanto concluimos que miR155, pero no miR200c, está implicado en la EMT inducida por EGF en las células Caski. Similares datos publicados por otro grupo también indican que miR155 está regulada positivamente en EMT observado en carcinosarcoma de endometrio [10].
Para dilucidar el papel de miR155 en EMT, las líneas celulares que sobreexpresan Caski miR155 sobreexpresión se construyeron mediante transfecciones estables y transitorias . Curiosamente, la sobreexpresión aberrante de miR155 proliferación celular drásticamente inhibida, inhibe la migración /invasión, y promovió la quimio-sensibilidad de las células a Caski DDP
in vitro
. Al mismo tiempo, se encontró que las células que sobreexpresan miR155 se hicieron más cúbico, y sólo una pequeña porción de las células se habían transformado en células fusiformes después de 3 días de tratamiento EGF. La regulación por disminución de la E-cadherina causada por el tratamiento de EGF también se invirtió en parte por imita miR155 en células Caski.
Las investigaciones anteriores habían sugerido que el miR-155 era un onco-MIR y que sobreexpresa en una serie de tumores malignos humanos , incluyendo el linfoma de células B y carcinomas de mama, colon, pulmón y ovario [8], [9]. Se ha informado de que el miR-155 reprimida proteína nuclear inducida por p53 1 (TP53NP1) y condujo al desarrollo de tumores de páncreas [21]. En el cáncer de mama, miR155 mejorado las JAK2 /STATS vía y la transfección de imita miR155 señalización promovidos MDA-MB-231 y MCF-7 proliferación celular [22]. Nuestros datos, sin embargo, indican que la sobreexpresión miR155 inhibe la proliferación celular en las células Caski y evita EMT. actitud similar en la función miR155 fue aprobado por otro grupo [20], que demostraron que miR155 impidió EMT disminuyendo el nivel de expresión de TCF-4 en células 4T1 de tumor de mama.
Para dilucidar el mecanismo exacto de miR155 en la proliferación celular y la EMT en las células Caski, que ensayaron los niveles de expresión de algunos factores relacionados con el crecimiento celular y EMT (Figura 7). Los resultados mostraron que la expresión de TP53 se upregulated por miR155 sobreexpresión y downregulated de EGF. Curiosamente, EGF inducida por la regulación por disminución de E-cadherina se invirtió a fondo por la transfección con imita miR155. Un estudio reciente sugiere que salvaje TP53 controló la eficiencia con la cual las células epiteliales mamarias someterse a EMT en respuesta a TGF [23]. Por lo tanto supone miR155 invierte EMT a través de la regulación positiva de la expresión de TP53.
La vía de señalización SMAD2 está implicada en la regulación de la proliferación, la diferenciación, la apoptosis y la EMT [23]. En este estudio, se encontró que, con sobreexpresión miR155, Smad2 expresión se downregulated. Debido a que hay dos miR155 sitios dentro de la 3'UTR del ARNm SMAD2 de unión, sugerimos que miR155 regula negativamente la EMT a través de la inhibición de la expresión Smad2
.
Nuestros resultados indican que miR155 suprime las capacidades de migración e invasión de Caski células
en
in vitro
. Un resultado similar se ha reportado en otro estudio con células tumorales 4T1 de mama, en el que se encontró miR155 para suprimir directamente la expresión de TCF4 y regular negativamente EMT [20]. En nuestro estudio, no se observaron cambios estadísticamente significativos en el nivel de expresión en las células TCF4 Caski tratados con o sin EGF y miR155 imita. Un estudio reciente sugiere que CCND1 aumentó la capacidad migratoria y la causa de EMT en el cáncer de mama [24]. CMYC y CCND1 son genes abajo regulados por el factor de transcripción TCF4. A diferencia de CMYC, hay un sitio de unión de miR155-en el CCND1 3'UTR. En consonancia con este hallazgo, miR155 sobreexpresión obviamente downregulated nivel CCND1 pero no tuvo ningún efecto sobre la expresión CMYC. Este hallazgo indicó que, además de la vía TCF4, CCND1 podría también ser regulada directamente por miR155.
Anexina A2 fue considerado como un factor potencial para la regulación del crecimiento celular, la invasión y quimio-resistencia [25 ]. Nuestros datos muestran que el plomo tratamiento con EGF a un aumento en la expresión de la anexina A2. Y no hay ningún cambio en la expresión A2 Anexina bajo miR155 sobreexpresión. Se necesitan más estudios para aclarar el mecanismo de regulación de la anexina A2 por EGF.
En resumen, hemos demostrado que, en las células Caski, miR155 no actuó como un oncogén, sino como un supresor de tumores. miR155 regula negativamente la EMT inducida por EGF, disminución de la proliferación, la migración inhibido /invasión y el aumento de la quimio-sensibilidad en las células Caski in vitro. En EMT inducida por EGF, la regulación al alza de miR155 es un evento que las células pueden compensar. Nuestro estudio muestra un nuevo aspecto de miR155 y sus papeles en la proliferación tumoral y la metástasis en el cáncer de cuello uterino.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Los cebadores para PCR en tiempo real.
doi: 10.1371 /journal.pone.0052310.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Liu y Changbai Zhaoqi Liu por su asesoramiento técnico y asistencia técnica en la realización de PCR en tiempo real. También se agradece a la Sra Ma Jielan por su ayuda en la realización de transfecciones de plásmidos y la disponibilidad para el fragmento de ADN de GFP. Agradecemos al personal del Instituto de Biología Molecular de la Universidad de las Tres Gargantas.