Extracto
Antecedentes
La incidencia del carcinoma papilar de tiroides (PTC) ha aumentado de forma constante durante las últimas décadas, así como las tasas de recurrencia. Se ha propuesto que la terapia dirigida física ablativo podría ser una modalidad terapéutica en el cáncer de tiroides. bio-afinidad dirigido nanotubos de carbono funcionalizados con paredes múltiples (BioNanofluid) actúan a nivel local, para convertir de manera eficiente la energía de luz externa para calentar por lo tanto específicamente matar las células cancerosas. Esto puede representar una nueva modalidad terapéutica del cáncer prometedor, avanzando más allá de la ablación con láser convencional y otros enfoques de nanopartículas.
Métodos Se seleccionó
receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSHR) como un objetivo para las células de PTC, debido a su amplia expresión. De cualquier TSHr o Thyrogen o TSH purificada (tirotropina) se conjugaron químicamente para nuestra Bionanofluid funcionalizado. Se utilizó un sistema de láser de diodo (532 nm) para iluminar una línea de células de PTC para tiempos de exposición fijados. La muerte celular se evaluó mediante tinción con azul tripán.
Resultados
BioNanofluids
TSHR orientados eran capaces de ablación selectiva BCPAP, una línea celular de PTC TSHR-positivas, mientras que las células no-nulos TSHR NSC-34 . Se determinó que un 2: 1 de células BCPAP: relación de conjugado de α-TSHR-BioNanofluid y una exposición de 30 segundos láser mataron a aproximadamente 60% de las células BCPAP, mientras que 65% y & gt; 70% de las células se realiza la ablación usando Thyrotropin- y Thyrogen- conjugados BioNanofluid, respectivamente. Por otra parte, se observó una mínima muerte no-dirigida utilizando controles selectivos.
Conclusión
Un BioNanofluid plataforma que ofrece un camino terapéutico potencial para el cáncer papilar de tiroides se ha investigado, con nuestro
in vitro
resultados sugieren que el desarrollo de un método potente y rápida de la muerte de células de cáncer selectiva. Por lo tanto, el tratamiento BioNanofluid hace hincapié en la necesidad de una nueva tecnología para el tratamiento de pacientes con recidiva local y metástasis que actualmente están experimentando ya sea de nueva cirugía exploraciones cuello, la administración repetida de yodo radiactivo y como la radiación último recurso de haz externo o quimioterapia, con menos efectos secundarios y una mejor calidad de vida
Visto:. Dotan I, Roche PJR, Paliouras M, Mitmaker EJ, Trifiro MA (2016) Ingeniería de múltiples paredes de nanotubos de carbono terapéutica Bionanofluids selectivamente las células diana papilar del cáncer de tiroides. PLoS ONE 11 (2): e0149723. doi: 10.1371 /journal.pone.0149723
Editor: Valentín Ceña, Universidad de Castilla-La Mancha, ESPAÑA
Recibido: 18 Junio, 2015; Aceptado: 4 Febrero de 2016; Publicado: 22 Febrero 2016
Derechos de Autor © 2016 Dotan y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. ID recibido apoyo salarial del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF)
Conflicto de intereses:. Los autores (ID, PJRR, MP, EJM, y MAT) les gustaría conocer al editor y los revisores que son también inventores en la siguiente solicitud de patente: BIONANOFLUID para su uso como CONTRASTE, imágenes, desinfección y /o la oficina tERAPÉUTICO patente de EE.UU. AGENT-PCT-CA2014 /051094 en el trabajo presentado aquí y en otros desarrollos sobre los desarrollos terapéuticos. Esta solicitud de patente no entre en conflicto con la política de datos abiertos de la revista respecto a los datos presentes en este manuscrito o la solicitud de patente. No hay más patentes, productos en desarrollo, o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
Durante la última década se ha producido una aumento significativo en la incidencia de cáncer de tiroides [1]. Este patrón se explica en parte por un aumento en la detección de pequeños nódulos que se encuentran de paso en las imágenes de cuello, pero una tendencia más inquietante es el aumento de la prevalencia de la tiroides más grande (& gt; 4 cm) tumores junto con metástasis en los ganglios linfáticos ocultas [2]. carcinoma papilar de tiroides (PTC) suponen por sí solos ~ 80% de los carcinomas de tiroides [3, 4]. A pesar de una muy alta tasa de supervivencia a 10 años de más del 90% [3], la recidiva local se produce en hasta el 20% de los casos, lo que lleva a problemas de diagnóstico y tratamiento [4]. Además, las variantes agresivas de PTC, tales como células de altura, de células columnares, insular, trabecular y variantes esclerosante difusa, aunque poco frecuentes, están aumentando en incidencia. Estos tipos menudo requieren terapias agresivas asociadas con numerosos eventos adversos [5, 6].
La base del tratamiento primario PTC es la tiroidectomía total [3, 7, 8], por lo general seguida de la ablación con yodo radioactivo (RAI) en el compuesto intermedio y los pacientes de alto riesgo [3, 7-10], y la terapia con levotiroxina de toda la vida. Aunque profiláctica central de disección de ganglios linfáticos del cuello (PCND) sigue siendo controvertido, disecciones ganglionares terapéutica se realizan rutinariamente [2, 11]. Para recurrente /avanzado PTC, la extirpación quirúrgica es la mejor opción. Sin embargo, la remisión bioquímica completa con los niveles de tiroglobulina negativos sólo se alcanza en el 27% de los pacientes (a menudo después de múltiples intervenciones) [12], con una tasa de supervivencia a 20 años tan bajo como 36% [13]. El importante número de pacientes que no son candidatos para la cirugía pueden estar sujetos a las opciones de tratamiento adyuvante, como la radioterapia de haz externo (RHE), que predisponen a morbilidades irreversibles [7, 14-18]. Por lo tanto, es necesario encontrar opciones de tratamiento más precisos y específicos que permitan lograr resultados similares para la enfermedad primaria, y mejorar los beneficios clínicos de la enfermedad recurrente, minimizando al mismo tiempo la morbilidad.
Por desgracia, hay limitaciones inherentes con nuestro arsenal actual de estrategias para erradicar la recurrencia del tumor y hay una necesidad de descubrir nuevas técnicas cuando se trata de la enfermedad recurrente. La nanomedicina se refiere al uso de la nanotecnología en el dominio de la atención sanitaria, y que por lo general utiliza materiales desarrollados en dimensiones nanométricas y que ya ha demostrado ser extremadamente eficaz como una plataforma para la entrega de cualquiera de energía física o drogas, y también en aplicaciones de imagen [19] . Por lo tanto, el concepto de la terapéutica del cáncer basados en nanopartículas es evitar problemas con la farmacocinética de fármaco convencional y resistencia mientras limita el daño, sistémicamente o al tejido adyacente normal. También se extiende para incluir a pacientes que se basan inoperable en los métodos convencionales. Sobre la base de agentes quimioterapéuticos actuales, aumento de la presión selectiva a través de la aplicación de agentes quimioterapéuticos potenciales a los aumentos en la resistencia del tumor [20 a 22]. Además, las terapias físicas convencionales utilizados para la ablación de tejido, tal como los tratamientos de radiación o láser de alta intensidad, también dañar el tejido sano. Las nanopartículas se utilizan como agentes físicos que son capaces de amplificar o la conversión de energía de entrada, para inducir daño celular en una escala selectiva. Esto es a sus propiedades únicas fotónicos y el comportamiento plasmónica, sobre todo de nanotubos de carbono, en donde dichas partículas absorben la luz de manera muy eficiente ya través de la resonancia plasmónica convierten su absorción de energía en generación excesiva de calor en el que la superficie [23, 24].
nanopartículas Bio-afinidad, descritos en este documento como BioNanofluid, deben ser capaces de: 1) convertir de manera eficiente la luz en calor la energía, 2) ser fácilmente modificado con ligandos y /o biomoléculas para conferir especificidad, 3) prevenir la muerte celular no específica, y 4) tener una distribución de tamaño por debajo de 1 micra para permitir la perfusión tisular. El nanomaterial que mejor se ajusta a esta descripción es nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNTs), que son estructuras cilíndricas de [25, 26] láminas de grafeno concéntricos. La estratificación de la longitud del tubo de grafeno y relación de aspecto grande da un área de superficie significativa para varios archivos adjuntos biomoleculares, la creación de partículas multi-dentados, donde los anticuerpos u otros ligandos pueden reconocer múltiples receptores de la superficie celular. Los nanotubos de carbono de paredes múltiples ofrecen excelentes ganancias de temperatura localizados en virtud de su alta capacidad para absorber la luz y la convierten en calor, sin dejar de ser en buen estado [27-29]. El calor generado en escalas nanométricas por nanomateriales adheridas a las células, se causa suficiente hipertermia local sin calentamiento mayor de tejido no canceroso [30]. Por otra parte, dado que el cuerpo humano es transparente al infrarrojo cercano (NIR), dichas partículas con un brazo de orientación, pueden ofrecer una enorme cantidad de calor a nivel local cuando se expone a la luz NIR. NIR ya posee una excelente penetración en profundidad humana, pero se puede ampliar aún más por la fibra avances /endoscópicas realizadas en el campo de las imágenes médicas que pueden traer fuente de luz NIR casi cualquier parte del cuerpo [31].
El objetivo de este estudio es diseñar y preparar BioNanofluids conjugados para la ablación de PTC
in vitro
, mediante la creación de un enfoque específico con la intención de causar daño físico a las células del cáncer a nivel celular. Además, la eficacia de una nueva terapia dirigida foto-térmica PTC para el uso de estos nanotubos funcionalizados conjugados de carbono de pared múltiple (BioNanofluid) en un modelo de línea celular de cáncer de tiroides serán evaluados.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
La línea papilar carcinoma de tiroides celular (BCPAP) [32-34] se adquirió de DMSZ (Braunschweig, Alemania). El ratón híbrido de neuroblastoma neurona motora NSC-34 [35] línea celular fue donado por el Dr. Neil R. Cashman.
Cultivo de células
BCPAP células fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de FBS. células NSC-34 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FBS y 20% de L-glutamina. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 aire humidificado en matraces de cultivo de plástico (VWR, Canadá). Una vez confluentes, las células se recogieron usando una solución Versene (EDTA 0,48 mM en PBS), se centrifugaron y se diluyeron en medios de comunicación para una concentración de 2,5 a 3,5 x 10
5 células /ml.
Los anticuerpos y químico reactivos
Los anticuerpos anti-TSHR fueron adquiridos de Novus Productos Biológicos, Canadá y Acris anticuerpos Inc, EE.UU.. La tirotropina (TSH humana purificada phTSH) se adquirió de Bioworld, EE.UU.. Thyrogen (TSH recombinante o rhTSH) se adquirió de Genzyme Canada Inc, Canadá. Thiolyated PEG 5000 (polietilenglicol, PM 5.000 kD) se adquirió de Bio Laysan, EE.UU.. NHS (
N
hidroxisuccinimida) y EDC (etil dimetilaminopropil carbodiimida) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, EE.UU..
Western Blot
BCPAP y NSC-34 células se recogieron usando tripsina al 0,05% y se lisaron usando tampón 1 X Reportero de lisis. Para el análisis Western blot, 20 g de lisado-total compensado celular se cargó en un gel de SDS-PAGE 10%. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1: 1000 y se usan con los protocolos sugeridos por el fabricante. La expresión de la proteína se visualizó utilizando el kit ECL y se expuso a película.
Preparación de Conjugados BioNanofluid
COOH-funcionalizado MWCNTs Au-decorada se obtuvieron de la Universidad McGill, Canadá, y se diluyó con d
2H
2O a una concentración de trabajo de 18 a 20 mg /L antes de la conjugación, para asegurar mono-dispersidad. COOH funcionalización se logró por tratamiento con plasma, un método general para la adición de grupos funcionales en defectos en las estructuras de grafeno [36, 37]. Au decoración se llevó a cabo mediante la ablación por láser de impulsos usando un láser de Nd: YAG centrado en el objetivo MWCNT a una fluencia del orden de 1 J /cm
2. El proceso puede decorar rutinariamente CdSe, Au, Ag, Si, Sn y en los MWCNTs. El material creado tenía islas recubiertos con Au (tamaño variable de entre 1 nm y 5 nm, según lo observado y medido de SEM en la figura 1A) para la unión de PEG y se expusieron grupos COOH donde Au estaba ausente. La consistencia de las soluciones de proceso por lotes se evaluó mediante espectrometría UV-Vis, usando el pico de 260 nm para determinar la concentración consistente.
A. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de imágenes bionanofluids derivados tiol de carbono marcado-Au funcionalizados-COOH, en dos aumentos diferentes. Partículas de Au han definido estructuras esféricas, destacado por la punta de flecha. química de acoplamiento B. EDC-NHS para unir moléculas bio-afinidad, ya sea anticuerpo o proteína /mitogen en el tiol-PEG-CNT. PEGilación del tiol-CNT se describe en los Materiales y Métodos.
BioNanofluid se modificó usando tiolado PEG (MW 5000) durante 1 hora con la formación del grupo -SH del enlace Au-S, que forman el base para la prevención de absorción no específica. El material creado tenía dos cepillos de PEG que rodean las islas delgadas recubiertas de oro y grupos COOH expuestas donde el oro estaba ausente. Una solución madre de 150 mM thiolyated PEG se preparó en agua destilada a pH 4,5. MWCNT [500 l solución madre (1 g)] se incubó con 200 l de tiolado PEG5000 150 M solución de stock en un volumen final de 700 l a temperatura ambiente durante una hora a pH 5. Después, la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 RPM, se descartó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 350 l de PBS (pH 7,4). El tiol-PEG-CNT se conjugó posteriormente a la molécula dirigida a diana. La mezcla de conjugación incluye 350 l de PEG-BioNanofluid, 90 l (36,8 mM) de NHS, 90 mu l (22,1 mM) de EDC, y 4 g de uno de los siguientes ligandos: a-TSHR, tirotropina o Thyrogen, con un pH final de 5,5 (véase la figura 1B). La conjugación se dejó proceder durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de completar la conjugación, la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y se lavaron los gránulos BioNanofluid conjugados (3 veces) con PBS y después se resuspendió en 300 l de PBS.
Cell la orientación y el tratamiento con láser
100 a 200 l de células recién recogidas (que contienen 250.000-350.000 células por ml) se mezclaron con 100-200 conjugados mu l, tiol-PEG-CNT /BioNanofluid o PBS, de acuerdo con el experimento , en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Las muestras se incubaron a continuación a 37 ° C en un estante de rotación durante 1 hora. A continuación, las muestras se lavaron 3 veces con PBS para eliminar BioNanofluid no unido y restos de células extrañas. Después del lavado, las células se dividen en 25 alícuotas de 200 l eppendorfs estériles, y se trataron con un 532 nm 2,7 W /cm
láser 2 de alimentación. Los tratamientos con láser se realizaron mediante incubaciones individuales de α-TSHR, tirotropina o Thyrogen conjugado-BioNanofluid. Los experimentos se repitieron con un mínimo de 3 réplicas por concentración o la exposición al láser tiempo. Los experimentos de control se realizaron con conjugado IgG-desnudo BioNanofluid, tiol-PEG-CNT (sin ligandos) o con PBS y las células solo. El propósito de los controles fue investigar los efectos de cada modificaciones químicas y biológicas, la absorción y el tiempo de exposición no específica al láser en las células, y también para limitar o eliminar los efectos secundarios que podrían causar la muerte celular de tal manera que sólo se produce cuando el láser interactúa con los nanotubos de carbono
Inmediatamente después de la exposición al láser, se añadió azul de tripano en una relación 1:. fractura celular relación de 1 volumen en cada microtubo, y el blanco (en vivo) se contaron las células utilizando un hemocitómetro. Los conteos se realizaron por triplicado, y cada experimento se realizó en 3 ocasiones diferentes. El porcentaje de muerte celular (células vivas restante) se calculó de acuerdo con la ecuación:
BioNanofluid experimentos de estabilidad
4 ° C
Los conjugados fueron preparados en el día 1, y se mantiene. a 4 ° C hasta el día 21. los experimentos se llevaron a cabo durante toda una semana (días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7), y luego continuó en los días 10, 14 y 21. las células fueron expuestas a BCPAP la 532 nm láser durante 30 segundos a una relación 2: células proporción de 1: BioNanofluid. Las concentraciones de los BioNanofluid conjugada y no conjugada se midieron usando el espectrómetro UV-VIS, para garantizar la equivalencia de concentración mediante el uso de una solución de igual absorbancia.
-20 /-80 ° C.
conjugados creados en el día 1 se dividen en partes alícuotas y se mantuvieron a -20 ° C o -80 ° C. Los experimentos se realizaron en los días 1, 5, 7 y después cada semana durante un máximo de 6 semanas. células BCPAP fueron expuestas al láser 532 nm durante 30 segundos en un 2: Célula 1: relación de conjugado. Del mismo modo, las concentraciones de los BioNanofluid conjugada y no conjugada se midieron usando el espectrómetro UV-VIS.
La física óptica de nanotubos de carbono se han estudiado
Resultados
BioNanofluid características
y descrito en otra parte [38]. En pocas palabras, tienen la mayor absorbancia coeficiente de especies de nanopartículas y una absorbancia de banda ancha que se ajusta a las reglas de diseño. La estratificación de la longitud del tubo de grafeno está en el intervalo de micrómetros, que confiere una relación de aspecto muy grande para varios archivos adjuntos biomoleculares, la creación de partículas multi-dentados, en los que múltiples receptores de la superficie celular pueden ser reconocidos por anticuerpos u otros ligandos. Los nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNTs) ofrecen un excelente método de generación de calor altamente localizado en virtud de su alta capacidad para absorber la luz y convertirla en calor, sin dejar de ser en buen estado [27-29]. Esta es una propiedad de los materiales basados en el grafeno, ya que presentan absorbancia de banda ancha de la luz, siendo capaz de absorber un gran espectro de colores de luz y ser capaz de convertir esta energía con alta eficiencia. Esto se demuestra por el color negro que los nanotubos de carbono de exposiciones. Con la absorbancia de la luz, la energía del fotón promueve un electrón a un nivel de energía más alto del estado fundamental, la pérdida de esa energía puede ocurrir ya sea en la debilidad de las emisiones de foto-luminiscentes y procesos entre sistemas pequeños pero la transferencia fundamental de la energía a los alrededores materiales de carbono se encuentra en la forma de energía de calor. De este modo, el calor generado en escalas nanométricas por MWCNTs bio-funcionalizado adheridas a las células selectivas /dirigidas, causará una rápida y suficiente hipertermia local sin necesidad de "calentamiento mayor" de los tejidos cercanos potencialmente sensible. Anteriormente, las nanopartículas de oro con sus propiedades de absorción plasmónica se han utilizado para convertir la luz en calor e inducir la muerte celular en los tumores [25]. La flujos de luz o modulaciones de pulsos ultracortos de luz necesarios para lograr altas temperaturas grande [39] necesitan una exposición prolongada de 5 a 15 minutos [40] y causar daños perjudiciales para la rodea las células no cancerosas.
El material de base de la BioNanofluid es COOH funcionalizado nanotubos de carbono de pared múltiple (longitud que va de 0,25 micras a 10 micras con un diámetro de 25 a 50 nm) de oro (Au) que se reviste escasamente como una modificación adicional, se generó a través de amida & amp; vínculos tiol para ligandos químicos y biológicos. Imágenes de MWCNTs decoradas Au-funcionalizados-COOH se realizaron mediante microscopía electrónica de barrido (Figura 1A).
TSHR focalización de BioNanofluid de líneas celulares PTC
tiroides receptor de hormona estimulante (TSHR) fue elegido para su robusta expresión en tanto normal, así como en células de cáncer de tiroides diferenciados [41-44] como se evidencia por los estudios que no muestran la baja regulación de TSH-R en células de cáncer de tiroides diferenciados [45], mientras que otros demostraron TSHR ser sobre-expresa en carcinomas de tiroides y adenomas benignos como comparación con el tejido normal de la tiroides [43]. La unión de TSH a su receptor estimula el crecimiento y la proliferación de células, ayudando de esta manera en PTC progresión [46]. Esto proporciona una explicación de por qué la levotiroxina se prescribe en dosis que suprimen TSH, es decir, con el fin de prevenir el crecimiento de micro-metástasis y /o tejido tiroideo remanente después de la terapia convencional para el cáncer de tiroides. Además, la expresión robusta de la TSHR, siendo ubicuo a la tirocito, todavía sirve como un regulador importante y persistente y un marcador fisiológico en la enfermedad primaria y metastásica con la posibilidad de orientar los conjugados BioNanofluid para un potencial terapéutico.
para evaluar el potencial de dirigir el TSHR, una línea celular que expresa PTC TSHR-positivos (BCPAP) se encontró y se incubaron con dos diferentes α-TSHR-BioNanofluid utilizando anticuerpos TSHR de diferentes proveedores (Fig 2). Ambos anticuerpos proveedor mostraron velocidades de células de matar similares y significativas de 62 ± 5,6% (Ab#1 -Acris anticuerpos) y 62 ± 5,1% (Ab#2 -Novus biológicos), con valores de p de 0,000148 (Ab#1); y 5,74 x 10
-5 (Ab#2), en comparación con IgG-BioNanofluids. Los anticuerpos solos, IgG-BioNanofluid, o no conjugados tiol-PEG-CNT mostraron una posibilidad mínima de matar células
Dos anticuerpos específicos TSHR, comprados a diferentes suministros (Ab#1, Acris anticuerpos;. Ab#2, Novus Productos Biológicos ) se conjugaron con nuestra tiol-PEG-CNT, junto con el conejo y de IgG de ratón-tiol-PEG-CNT conjuga como controles no específicos para la orientación muerte celular de las células de PTC BCPAP. Otras condiciones de control incluyen PBS, las partículas de CNT y los anticuerpos solos. Los resultados se muestran como% de células vivos, después del tratamiento con láser seguido de tinción con azul de tripano para definir muerto de células vivas. α-TSHR-Bionanofluid conjugados significativamente (Ab#1, p = 0.000148; Ab#2, p = 5,74 x 10
-5) células muertas BCPAP vs. conjugados IgG-bionanofluid. Todos los demás controles no mostraron significativos células que matan las tasas frente a IgG-bionanofluids.
BioNanofluid optimizaciones
Con el fin de alcanzar una velocidad máxima de muerte celular con un mínimo de ocurrencia de células no específica muerte, se procedió a optimizar nuestras condiciones para tener en cuenta la concentración de células a BioNanofluid y la longitud de tiempo de exposición del complejo de células bionanofluid al láser
en primer lugar, se evaluaron cuatro relaciones diferentes (4:. 1, 2 : 1, 1: 1 y 1: 2) de las células a BioNanofluid conjugados. A 2: 1 celular a la proporción de BioNanofluid rindió 58,9% (± 2,3) muerte celular tasa por α-TSHR-BioNanofluid, el 65,1% (± 2,1) para la tirotropina BioNanofluid, y el 72,4% (± 3,52) para tiroglobulina BioNanofluid (figura 3A ). Además, la Thyrogen-BioNanofluid superó tanto α-TSHR- y tirotropina BioNanofluid en la proporción de 2: 1. El aumento del contenido BioNanofluid a una relación 1: 1 o 1: 2 (celular: BioNanofluid) Relación causó el 47,1% (± 7,65) y 69,0% (± 4,52) la muerte celular, respectivamente, de las tasas de matanza no específica de células en la CNT nanopartículas de control sola grupo. Este aumento de la muerte celular, a concentraciones más altas de las nanopartículas no conjugados se refiere a un aumento en la retención de partículas en la celda por las asociaciones de la superficie celular no específicos que son frecuentes en todas las concentraciones MWCNT. Por lo tanto, una concentración /proporción más alta del grupo de partículas de retención no específica es lo suficientemente numerosas como para generar efectos de calentamiento mayor no deseados matando así las células. Por otra parte, la muerte relativo adicional de células de orientación no específica de los conjugados α-TSHR-BioNanofluid en el 1: 1 [56,2% (± 8,70), p = 0,1501] o 1: 2 [61,8 (± 21,2), p = 0.681] grupo relación no fue significativa.
se incluyen en estas condiciones experimentales son, α-THSR-, Thyrogen-, y conjugados de PEG-CNT-tirotrofina tiol purificados. condiciones de control incluyeron PBS y CNT solo. A. Determinación de la celda óptima para conjugar relación BioNanofluid para lograr el máximo objetivo la eliminación de células BCPAP específica. tiempo de exposición láser fue de 30 segundos para todas las condiciones. Ratios se representan como volumen: relaciones de volumen, por tanto, para una relación 1: 1, 100 l de células (de 250.000-350.000 células por ml) se mezclaron con 100 l de conjugado-BioNanofluid de 2 mg de concentración /mL. B. La exposición óptima experimento de determinación de tiempo. células BCPAP fueron expuestos a tratamiento con láser para 20, 30, y 40 segundos, en un 2: Célula 1: relación conjugated- o no conjugado-tiol-PEG CNT
experimentos de tiempo de exposición se realizaron con todos. conjugados para determinar la tasa más alta de la muerte celular sin pérdida de especificidad, es decir, altas tasas de muerte no específica de células (figura 3B). Cuarenta segundos de exposición rindió 67,8% (± 4,4) la muerte celular (α-TSHR), 67,8% (± 5,6) (tirotropina), y el 80,1% (± 5,1) (Thyrogen). Treinta segundos de exposición rindió 59,4% (± 1,3) matar (α-TSHR), 64,9% (± 5,8) (tirotropina), y el 75,2% (± 3,5) (Thyrogen). Veinte segundos de exposición rindió 48,5% (± 4,75) (α-TSHR), 52,9% (± 6,8) (tirotropina), y el 65,8% (± 7,5) (Thyrogen). Aunque las tasas de destrucción de células más altos se lograron con tiempos más largos de exposición (40 seg & gt; 30 seg & gt; 20 seg), matanza no específica en el grupo control BioNanofluid con 40 segundos de tiempo de exposición fue de 32,7% (± 11,6), de nuevo lo que refleja la problema de tratar con células no específica matando a través de re-investigación de la PEG-modificación. Por lo tanto, una segunda vez 30 la exposición correspondió a la mayor tasa de muerte celular específica. Sin embargo, cuando la exposición al láser se incrementó en un segundo intervalo de diez, causó aproximadamente 2,5 veces la cantidad (muerte celular 12% a los 30 segundos frente a la muerte celular 33% a los 40 segundos de exposición al láser) de la muerte celular no específica en la ONU grupo de control conjugado CNT. Esto refleja el punto de inflexión entre la entrega de la temperatura a escala nanométrica y el tiempo que le toma a BioNanofluid al calor suficientemente mayor una suspensión celular. Estudios previos han examinado el efecto de la potencia del láser y el tiempo de exposición necesario para transferir suficiente energía que conduce a la destrucción de células. Por ejemplo, un estudio tratado células Daudi con tiempos de exposición de 7 minutos y produjo más de 90% de muerte celular [47]. Otros estudios tratados de cáncer de mama, cáncer de colon, carcinoma hepatocelular y líneas de células Daudi durante 3 minutos o más [48-50]. Aunque algunos de los estudios antes mencionados utilizados nanotubos de carbono de una sola pared (SWCNT) con características fototérmicos definidas, se encontró que incluso con un pequeño incremento de 10 segundos, el uso de MWCNT demostró más daño colateral. Nuestros hallazgos sugieren que la preparación técnica y la partícula de la MWCNT utilizado para este experimento muestran una mayor eficiencia en la foto-térmica de transferencia de calor de una manera específica de la célula.
selectividad y especificidad BioNanofluid TSHR orientada
para evaluar tanto la selectividad y especificidad de la BioNanofluid orientada TSHR, se seleccionaron para llevar a cabo los experimentos de ablación celular simultáneamente en un TSHR positivo y negativo línea celular TSHR. Como BCPAP es un TSHR positivo línea celular que expresa, se encontró que la línea celular de la neurona motora NSC-34 del ratón es nulo para la expresión TSHR (figura 4A). Por lo tanto, hemos probado con α-TSHR-, Thyrotropin- y tiroglobulina BioNanofluids tanto contra BCPAP y NSC-34 células (Figura 4B). El uso de un 2: Célula 1: relación BioNanofluid y 30 segundos, se encontró que nuestra orientación selectiva de TSHR puede discriminar específicamente y de manera significativa entre TSHR expresar y no líneas celulares que expresan
A.. expresión TSHR de BCPAP y células NSC-34 se determinó por análisis de transferencia Western, utilizando el anticuerpo específico TSHR. BCPAP fueron positivos para la expresión TSHR, mientras que el NSC-34 células eran nulas. B-actina se utilizó como control de carga. B. BCPAP y células NSC-34 se incubaron α-THSR-, Thyrogen-, y conjugados con PEG-CNT tirotrofina tiol purificados. las condiciones de control incluyen IgG-tiol-PEG-CNT, PBS y CNT solo. Todas las condiciones se realizaron en 2: 1 de células: relación bionanofluid y 30 segundos de exposición láser. Las células mostraron BCPAP ~ 60 ~% a 73% de muerte celular con todo TSHR dirigida conjugados bionanofluid, mientras que la muerte de una célula mínima se observó con el control de otras condiciones. La línea de células NSC-34 mostró la muerte celular insignificante en todas las condiciones.
BioNanofluid estabilidad
Se realizaron experimentos para evaluar la actividad de los BioNanofluids orientados TSHR, mediante la evaluación de su estabilidad bajo las condiciones de almacenamiento prolongado. Un lote de α-TSHR-BioNanofluid se ha creado y almacenado a 4 ° C durante 21 días, o -20 ° C y -80 ° C durante 6 semanas. El lote de α-TSHR-BioNanofluid se almacena a 4 ° C se evaluó por su actividad para la ablación de células BCPAP todos los días durante un período de 1 semana, y luego repite en días 10, 14 y 21 (Fig 5A). α-TSHR-BioNanofluid comenzó a perder eficacia por día 5, con su capacidad para la ablación de células BCPAP pasando de 60% a 40%, mientras que los conjugados de Thyrogen-BioNanofluid pierden eficacia en día 6. Tanto α-TSHR- y Thyrogen-BioNanofluid parecían meseta de ser 40% efectiva hasta la conclusión del experimento, lo que sugiere continuó pero obstaculizado la selectividad celular. Puede ser la hipótesis de que el rendimiento disminuirá con la desnaturalización de los ligandos de proteínas en un corto período de tiempo cuando se almacena a condiciones inestables de 4 ° C. Sin embargo, aunque nada puede inferirse directamente como a Thyrogen o estructura α-TSHR, las concentraciones de la BioNanofluid almacenadas a 4 ° C fueron estables, medido por el espectrómetro UV /VIS antes de la mezcla con las células. Como ligando-BioNanofluid UV /VIS absorbancia se mantiene constante independientemente de la desnaturalización potencial, se sugiere que la administración de la absorbancia de la estructura combinada en 260 nm (absorbancia a esta longitud de onda es común a las proteínas y los CNT) que poca o ninguna pérdida de ligando o CNTs debido a la responsabilidad de unión amida o degradación del CNT son razones de la caída de la actividad (ver Tabla S1).
a. α-TSHR- y tiroglobulina tiol-PEG-CNT conjugados se prepararon en el día 1 y se mantuvieron a 4 ° C durante hasta 21 días. actividad conjugados se evaluó mediante el ensayo de muerte celular de las células BCPAP (como se describe más arriba). B. Del mismo modo, α-TSHR- y tiroglobulina tiol-PEG-CNT conjugados se prepararon el día 1 y se mantuvieron a -20 ° C o -80 ° C durante un máximo de 6 semanas. la actividad de los conjugados se evaluó mediante el ensayo de muerte celular en el día 5, día 7, y cada semana durante un máximo de 6 semanas.
Un experimento similar se llevó a cabo durante 6 semanas, con el BioNanofluid almacenado a -20 ° C o -80 ° C (Fig 5B). BCPAP experimentos de ablación celular se realizaron en los días 1, 5, 7 y semanales, para un máximo de 6 semanas. Los resultados revelan estabilidad de la actividad BioNanofluid en ambas condiciones de -20 ° C y -80 ° C de almacenamiento, como se observa por porcentajes de ablación celular para la α-TSHR-BioNanofluid y que todavía mantiene & gt; 60% de eficacia, y la Thyrogen-BioNanofluid poseer & gt; 65% de eficacia, en el transcurso de 6 semanas del experimento. Las concentraciones MWCNT conjugados y no-conjugados se midieron en paralelo para cada experimento, y todos mostraron concentraciones estables.
Discusión
Existen limitaciones inherentes en el tratamiento del cáncer de tiroides recurrente. Aunque la mayoría de los casos son tratados con tiroidectomía, seguido de tratamiento supresivo de TSH con levotiroxina y yodo radioactivo en casos seleccionados; cáncer de tiroides recurrente presenta un reto terapéutico. El paradigma del tratamiento del cáncer de tiroides y la recurrencia proporciona un marco adecuado para estudiar la aplicación de agentes físicos dirigidos molecularmente. terapia fototérmica nano-mediada está ganando impulso en forma de agentes físicos específicos que tratan una variedad de cánceres. El reto fundamental para el cáncer de tiroides es entregar un agente que no sólo actúa sobre las células tumorales, sino que también dirige a las células tiroideas normales remanentes. En este estudio, se intentó evaluar la eficacia de una terapia física dirigida innovadora utilizando bio-afinidad de nuevo diseño nanotubos de carbono funcionalizados, o conjugados BioNanofluid, con el fin de demostrar
in vitro
, la eficacia de la focalización y la ablación de TSHR