Extracto
Se describe el uso de cebadores "superselectiva" que permiten la detección y cuantificación de mutaciones somáticas cuya presencia se relaciona con el diagnóstico de cáncer, el pronóstico y la terapia, en ensayos de PCR en tiempo real que potencialmente pueden analizar fragmentos de ADN raras presentes en muestras de sangre (biopsias líquido). El diseño de estos cebadores desoxirribonucleótidos incorpora tanto un " 'secuencia de anclaje que se hibrida fuertemente a orientar fragmentos de ADN, y un muy corto, física y funcionalmente independiente," 3 5 "' relativamente larga secuencia de pie" que es perfectamente complementaria a la secuencia diana mutante , pero no coincide con la secuencia de tipo salvaje. Tan sólo diez fragmentos mutantes fiable pueden ser detectados en presencia de 1.000.000 de fragmentos de tipo salvaje, incluso cuando la diferencia entre el mutante y el tipo salvaje sólo es un polimorfismo de nucleótido. ensayos de PCR múltiple que emplean un conjunto de cebadores superselectiva, y un conjunto correspondiente de las sondas de baliza molecular de diferentes colores, se pueden utilizar en situaciones en las que las diferentes mutaciones, aunque se producen en diferentes células, se encuentran en el mismo codón. Estas en tiempo real ensayos de PCR multiplex no simétricas contienen concentraciones limitadas de cada cebador superselectiva, lo que permite la determinación simultánea de la abundancia de cada mutación mediante la comparación de su valor de umbral para el valor de umbral de un gen de referencia presente en la muestra.
Visto: DY Vargas, Kramer FR, Tyagi S, Marras SAE (2016) Multiplex PCR en tiempo real ensayos que miden la abundancia de extremadamente raras mutaciones asociadas con el cáncer. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10.1371 /journal.pone.0156546
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 23 Marzo de 2016; Aceptado: 16-may de 2016; Publicado: 31 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Vargas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:. esta investigación, el cargo de acceso abierto a la publicación de este documento, así como los salarios de todos los autores de este manuscrito fueron apoyados por el laboratorio (Instituto de investigación de Salud Pública, Universidad de Rutgers) la proporción de los ingresos recibidos de la concesión de licencias no exclusivas de la tecnología de balizas moleculares por PHRI Properties, Inc., que es una corporación sin fines de lucro en su totalidad propiedad de la Universidad de Rutgers. Ni PHRI Properties, Inc., ni ninguno de sus cerca de 75 licenciatarios balizas moleculares, tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. FRK , ST, y SAEM recibir regalías de la concesión de licencias no exclusivas de la tecnología de balizas molecular mediante Propiedades PHRI, Inc. las patentes de Estados Unidos con licencia relevantes son: "Dual marcado de forma detectable Conformación sondas de oligonucleótidos, ensayos y kits" 5.925.517; y "Detección de sondas de ácido nucleico que tiene para no FRET extinción de la fluorescencia y kits y ensayos que incluyen dichas sondas" 6.150.097. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La entrada ha sido un objetivo largamente buscado médica para poder detectar a un muy las primeras etapas de mutaciones extremadamente raras cuya presencia en una muestra clínica es útil para el diagnóstico de cáncer, el pronóstico, lo que indica la elección de una terapia efectiva [1]. La evaluación de la detección y cuantitativa de mutaciones somáticas pertinentes tiene varios usos, incluyendo: (i) la detección de cáncer en una etapa tratable en pacientes que heredan genes que hacen más probable el cáncer; (Ii) la detección de mutaciones en las células de cáncer benignos que indican que ahora pueden hacer metástasis; (Iii) la medición de la abundancia de células de cáncer durante el tratamiento; y (iv) la determinación de si las células cancerosas resistentes a los fármacos han surgido durante el tratamiento, por lo que la terapia se puede ajustar. Un objetivo adicional es desarrollar métodos que permitan ensayos multiplex que pueden medir simultáneamente la abundancia de diferentes mutaciones raras. Si tales ensayos eran en estar disponible, el cáncer potencialmente podría ser convertida de una enfermedad a menudo mortal a una condición crónica que puede ser gestionado por las pruebas frecuentes combinado con ajustes terapéuticos individualizados.
Estimular estos esfuerzos en la comprensión de que es el las células cancerosas, sin importar en qué parte del cuerpo se encuentran, se dividen con frecuencia, sufren apoptosis y necrosis, y, como consecuencia, los fragmentos de ADN genómico de las células cancerosas están presentes en el plasma sanguíneo de cada paciente [2]. Esta realización ha abierto la posibilidad de que la presencia de mutaciones raras indicativas del diagnóstico de cáncer, el pronóstico y el tratamiento puede ser detectado y cuantificado en un estadio muy temprano, mediante la realización de "biopsias líquidos," DNA utilizando aislado de plasma [3-5] . El desafío que enfrentan los diseñadores de ensayo es encontrar un medio de detección selectiva y la cuantificación de estos raros fragmentos de secuencias mutantes en ADN de plasma, a pesar de la presencia de abundantes fragmentos de la secuencia de tipo salvaje se originan a partir de células normales en todo el cuerpo, ya pesar del hecho de que diferentes mutaciones relevantes Sin embargo, originarios de diferentes células, a menudo se producen en el mismo o adyacentes codones. El éxito de "próxima generación" de secuenciación para la detección de fragmentos de secuencias raras mutantes en el ADN de plasma [6-8], aunque complejo y costoso, se ha ilustrado el valor de este enfoque.
ensayos de diagnóstico molecular basada en la amplificación exponencial de las secuencias diana de ácidos nucleicos, tales como las reacciones en cadena de la polimerasa, son de bajo costo y suficientemente sensible para generar señales de tan poco como una única molécula de plantilla. El reto es diseñar estos ensayos a ser extraordinariamente selectiva, de modo que permiten la amplificación exponencial de fragmentos de ADN mutante, mientras que suprime al mismo tiempo la generación de amplicones a partir de fragmentos de ADN de tipo salvaje mucho más abundantes, incluso cuando la única diferencia entre la secuencia mutante y la secuencia de tipo salvaje es un polimorfismo de un solo nucleótido.
enfoques prometedores utilizan cebadores de amplificación que están diseñados para ser altamente selectiva. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de sistema de amplificación de mutación refractaria (ARMS) cebadores [9] son perfectamente complementarias a las secuencias diana mutante, pero contienen un "nucleótido de interrogación" en su extremo 3 'que no es complementaria al nucleótido correspondiente de tipo salvaje secuencias diana. Los híbridos de tipo salvaje no coincidentes resultantes son mucho menos propensos a activar la síntesis de amplicones, ya que las ADN polimerasas requieren un par de bases 3'-terminal para iniciar la síntesis. Aquí, el mecanismo selectivo es enzimática. Por otra parte, la doble oligonucleótido de cebado (DPO) primers [10], cebadores MYT [11], imprimaciones horquilla [12, 13], y los cebadores PASS [14], utilizan un mecanismo diferente. Ellos también poseen una secuencia de cebado que es perfectamente complementaria a una diana mutante, pero contienen un nucleótido de interrogación interna que no coincide con la secuencia de tipo salvaje correspondiente. La longitud de su secuencia de cebado se elige de manera que, en condiciones de hibridación, los híbridos mutantes perfectamente complementarios son propensos a formar, y son, por tanto, puede dar lugar a la generación de amplicones, mientras que no coinciden los híbridos de tipo salvaje son mucho menos propensos a formar, y por lo tanto son mucho menos propensos a conducir a la generación de amplicones. Los enfoques alternativos, que implican PCR-apriete [15] o el uso de bloqueadores de la horquilla de oligonucleótidos [16], utilizar una mezcla que contiene ambos cebadores de ADN convencionales que se unen a secuencias mutantes, y "anti-cebadores" que están diseñados para unirse selectivamente a salvaje secuencias de tipo, impidiendo de este modo la iniciación de la síntesis de amplicón de tipo salvaje. Sin embargo, todos estos enfoques, aunque por lo general aplicable para la detección de secuencias mutantes, son o bien no lo suficientemente sensible para detectar mutantes extremadamente raras [12-15], no compatible con PCR en tiempo real debido a la presencia de nucleótidos no naturales en su secuencia [10], o no se ha demostrado que permitirá a las determinaciones cuantitativas en ensayos multiplex PCR en tiempo real cuando se producen diferentes mutaciones de destino en el mismo codón [9, 11, 16].
Este informe describe los experimentos que exploran la Estructura y funcionamiento de los cebadores de PCR "supraselectiva" que permiten la cuantificación de los objetivos de mutantes raros. Significativamente, una vez que estos cebadores iniciar la síntesis de fragmentos de ADN mutante, los amplicones resultantes se amplificaron de forma exponencial con una alta eficiencia en ciclos térmicos posteriores, y los datos en tiempo real proporcionan un medio convencional de la evaluación de la abundancia de las plantillas de mutantes en la muestra original. Además, este informe describe diseños particulares para los cebadores superselectiva, y modificaciones en el formato de PCR, que permiten ensayos de PCR multiplex en tiempo real para llevar a cabo que medir la abundancia de diferentes secuencias diana mutante con respecto a la abundancia de una referencia de tipo salvaje secuencia de tipo presente en cada muestra.
Materiales y Métodos
los cebadores y sondas fluorescentes
supraselectiva secuencias de los cebadores fueron examinados con la ayuda del servidor web Mfold [17] y la programa informático OligoANALYZER (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) para asegurar que bajo condiciones de ensayo no es probable que formar estructuras de horquilla internos, y es poco probable para formar auto-dímeros o heterodímeros con los cebadores inversos convencionales. Los cebadores se compraron a Integrated DNA Technologies; y las sondas de baliza molecular de diferentes colores para la detección de los amplicones fueron adquiridos de Biosearch Technologies (Petaluma, CA).
plantillas de ADN
plásmidos que contienen
EGFR
secuencias (ya sea el L858 secuencia mutante o la secuencia de tipo salvaje) se prepararon mediante la inserción de un fragmento del gen de par 115-base en un pGEM
®-11Zf (+) vector (Promega, Madison, WI). Las secuencias de estos plásmidos se confirmó mediante análisis de secuencia. ADN genómico humano que codifica la
EGFR
mutación L858R fue aislado de la línea celular H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) y ADN genómico humano que contiene la secuencia de tipo salvaje correspondiente se adquirió de Coriell Cell repositorios (Camden, Nueva Jersey). La de tipo salvaje y mutante
EGFR
plásmidos, y los ADNs genómicos humanos, se digirieron mediante incubación con endonucleasa de restricción Mse I (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las mezclas de 20-l de digestión contenían 4 g de ADN, 10 unidades de Mse I, NaCl 50 mM, MgCl 10 mM
2, 100 mg /ml de albúmina de suero bovino, y 10 mM Tris-HCl (pH 7,9). Estas reacciones se incubaron durante 120 min a 37 ° C, seguido de incubación durante 20 min a 65 ° C para inactivar la endonucleasa.
plásmidos que contienen
secuencias BRAF
(ya sea la secuencia mutante V600E, la secuencia mutante V600R, o la secuencia de tipo salvaje) se compraron a Integrated DNA Technologies, y se prepararon mediante la inserción de un fragmento del gen de 200 pares de bases en vectores pIDTSmart amplificador. El
BRAF
plásmidos fueron digeridos por incubación con endonucleasa de restricción Sca I (New England Biolabs). Las mezclas de 20-l de digestión contenían 4 g de ADN, 10 unidades de Sca I, NaCl 100 mM, MgCl 10 mM
2, ditiotreitol 1 mM, y 50 mM Tris-HCl (pH 7,9). Estas reacciones se incubaron durante 120 min a 37 ° C, seguido de incubación durante 20 min a 80 ° C para inactivar la endonucleasa.
ensayos de PCR
Se llevaron a cabo reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real Monoplex en volúmenes de 30 l que contenía KCl 50 mM, MgCl 3 mM
2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 250 mM dATP, 250 mM dCTP, 250 mM dGTP, 250 M dTTP, 1,5 unidades de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 120 nM de cada cebador, y 1x SYBR
® verde (ThermoFisher Scientific) para la abundancia de monitoreo de amplificación durante la fase de elongación de la cadena de cada ciclo térmico.
verdadera Duplex reacciones en cadena de la polimerasa -time se realizaron en volúmenes de 30 l que contenía KCl 50 mM, MgCl 2,5 mM
2, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 250 mM dATP, dCTP 250 mM, 250 mM dGTP, dTTP 250 mM , 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa Platinum (ThermoFisher Scientific), ya sea 500 nM (PCR simétrica) o 60 nm (PCR no simétrica) de cada
BRAF
imprimación supraselectiva, 1,000 nM de lo convencional
BRAF
cebador común inverso, y 300 nM de cada baliza molecular para el seguimiento de la abundancia de cada tipo de amplicón durante la etapa de recocido de cada ciclo térmico.
Triplex en tiempo real las reacciones en cadena de la polimerasa contenían los mismos reactivos que las reacciones dúplex, excepto que contenían 60 nM de cada
BRAF
imprimación supraselectiva, 60 nM de la
EGFR
imprimación supraselectiva, 1,000 nM de lo convencional
BRAF
reverso común cebador, y 500 nM de la
EGFR convencional
cebador inverso. Hemos utilizado
EGFR
plásmidos de tipo salvaje como el objetivo gen de referencia en estos ensayos modelo de triple hélice, ya que estaban disponibles en nuestro laboratorio.
Todas las amplificaciones se llevaron a cabo en 200 l de polipropileno blanco PCR tubos (EE.UU. Scientific, Ocala, FL) en un termociclador spectrofluorometric IQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 min a 95 ° C para activar la ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Monoplex reacciones) o se incubaron durante 2 min a 95 ° C para activar la ADN polimerasa Taq Platinum (reacciones multiplex), seguido de 55 o 60 ciclos consistentes de 95 ° C de desnaturalización durante 20 s, 60 ° C de recocido durante 20 seg, y elongación de la cadena 72 ° C durante 20 seg.
Resultados
cebadores superselectiva son oligodesoxirribonucleótidos cuya función en una ensayo de PCR se ha dividido en dos partes [10, 14, 18]. La función de unión de manera eficiente para un gen de interés se asigna a un "segmento relativamente largo 5 de secuencia (que denominamos" ancla "), y de la función de unirse selectivamente a una subsecuencia de cerca dentro de ese gen que contiene la mutación de interés, y luego iniciar la síntesis de un amplicón, se asigna a una ", segmento de secuencia separada corta 3 (lo que llamamos el" pie "). El pie contiene un "nucleótido de interrogación" que es complementario al nucleótido correspondiente en la secuencia diana mutante, pero no coincide con el nucleótido correspondiente en la secuencia diana de tipo salvaje. En cebadores supraselectiva, el ancla está separado del pie por un segmento adicional, relativamente larga secuencia de desoxirribonucleótidos (lo que llamamos el "puente"). El puente se elige a fin de asegurar que no forma estructuras secundarias y no es complementaria a la "secuencia intermedia" en la molécula plantilla que se une a la secuencia diana de anclaje a la secuencia diana pie. En consecuencia, cuando el cebador se hibrida con una molécula de plantilla, la secuencia de puente en el cebador y la secuencia de intervención en la plantilla forman una monocatenario "burbuja" que separa funcionalmente la formación eficiente del híbrido de anclaje de la formación del híbrido pie . Los cebadores resultantes son bifuncional: en condiciones de recocido, la larga 5 'secuencia de anclaje permite que el cebador de unirse de manera eficaz y selectivamente a la región genómica de interés presente en los fragmentos de ADN diana, mientras que el corto 3' secuencia de pie (que posee el nucleótido interrogar ), porque está atado a la secuencia de anclaje por la secuencia de puente, es capaz de formar un híbrido débil (perfectamente complementaria) con la secuencia diana mutante; sin embargo, debido a su corta longitud, el pie es poco probable para formar un híbrido considerablemente más débil (mal) con la secuencia de tipo salvaje correspondiente.
Fig 1A muestra un ejemplo de un cebador superselectiva unida a su secuencia diana mutante. Este cebador particular fue diseñado para amplificar selectivamente fragmentos de ADN que contienen el
BRAF V600E
polimorfismo de un solo nucleótido, cuya presencia en las células predispone a los pacientes a poliposis cáncer colorrectal hereditario [19, 20]. Nos referimos a este cebador como "
BRAF V600E
24-14 /14-5: 1: 1", lo que indica que la secuencia de anclaje es de 24 nucleótidos de longitud, la secuencia de puente es de 14 nucleótidos de largo (a través de una secuencia de intervención en la plantilla que también es de 14 nucleótidos de largo), y la secuencia de pie es de 7 nucleótidos de largo, con el nucleótido de interrogación situado en la penúltima posición desde el extremo del cebador 3 '.
(a) primer superselectiva
BRAF V600E
24-14 /14-5: 1: 1 contiene una larga secuencia 5'-ancla que se une fuertemente a cadenas de molde, una corta secuencia 3'-pie que incluye un nucleótido de interrogación que es perfectamente complementaria a el nucleótido correspondiente en una plantilla mutante (pero no coincide con el nucleótido correspondiente en una plantilla de tipo salvaje), y una secuencia de puente que une la secuencia de anclaje a la secuencia de pie, y que se elige para que no sea complementaria a la secuencia de intervención correspondiente en el cadena molde, formando de este modo una monocatenario burbuja que separa la función del anclaje de la función del pie. (B) en tiempo real ensayos de PCR que emplean supraselectiva imprimación
BRAF V600E 24-14 /14-5
: 1: 1. Seis reacciones iniciaron con 10
6
BRAF: plantillas de tipo salvaje, además de diferentes cantidades de plantillas mutantes (10
1, 10
2, 10
3, 10
4 , 10
5 y 10
6) se representan en azul; una reacción inició con sólo 10
6 plantillas de tipo salvaje se representa con una línea punteada de color naranja; y una reacción de control que no contiene ADN de la plantilla se representa en rojo. (C) El ciclo umbral medido para cada reacción que contenía plantillas mutantes se representa gráficamente como una función del logaritmo del número de plantillas de mutantes inicialmente presentes en cada reacción. La línea naranja de puntos indica el umbral del ciclo de la reacción que contiene sólo las plantillas de tipo salvaje.
ensayos de PCR en tiempo real con cebadores supraselectiva
En tiempo real ensayos de PCR se llevaron a cabo, cuya única diferencia con respecto a un tiempo real convencional ensayo de PCR fue la sustitución del cebador directo convencional con la
BRAF V600E
superselectiva cebador directo se muestra en la Fig 1A. Estos ensayos Monoplex contenían un cebador inverso convencional que estaba presente en la misma concentración que el cebador superselectiva. Se prepararon ocho ensayos de 30-l de PCR. Siete de las reacciones contenían fragmentos de ADN de 10
6 plásmidos que poseen la
BRAF
secuencia de tipo salvaje y los fragmentos de ADN de cualquiera de 10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, 10
1 o 0 plásmidos que poseen el polimorfismo de un solo nucleótido en el
BRAF V600E
secuencia mutante. Un octavo de reacción que no contenía fragmentos de ADN sirvió como control. Todas las reacciones contenían el colorante de ADN intercalantes, SYBR
® Green, cuya intensidad de fluorescencia durante la fase de elongación de la cadena de cada ciclo térmico refleja el número de amplicones sintetizados.
Figura 1B muestra los resultados de este experimento . La reacción de control que no contenía ADN molde no produjo ningún amplicones falsas, tales como dímeros de cebadores, a pesar de la mayor longitud de los cebadores supraselectiva. La reacción que contiene 1.000.000 plantillas de tipo salvaje y mutantes no hay plantillas fue suprimida hasta el punto de que no produjo un importante número de amplicones hasta alrededor de 50 ciclos de amplificación se han llevado a cabo. Sin embargo, las seis reacciones iniciadas con 1.000.000 plantillas de tipo salvaje y diferente número de plantillas de mutantes tuvieron significativamente menos ciclos de amplificación para generar un número significativo de los amplificados. Cuando el ciclo umbral (Ct) de cada uno de estos seis reacciones se representó gráficamente frente al logaritmo del número de plantillas de mutantes en cada reacción, el resultado fue una línea recta (figura 1C). Esta relación lineal inversa entre el logaritmo del número de dianas mutantes originalmente presentes en una muestra y el valor de Ct observado para esa muestra es el sello de los ensayos de amplificación exponencial cuantitativos [21, 22]. De manera significativa, el valor Ct de la muestra que contiene 10 plantillas de mutantes en presencia de 1.000.000 de plantillas de tipo salvaje era fácilmente distinguible del valor Ct generada por la muestra que contiene sólo 1.000.000 plantillas de tipo salvaje (que se muestra en la figura como una línea naranja de puntos) .
en estos ensayos, la etapa selectiva se produce cuando un cebador superselectiva se une a un ADN (-) plantilla de hebra que está presente en que se analiza la muestra original. Una vez que la secuencia de pie de un cebador superselectiva inicia la síntesis de un amplicón, toda la secuencia del cebador superselectiva (incluyendo la secuencia de puente "artificial") se incorpora en que amplicón (+). En ciclos térmicos posteriores, los amplicones resultantes se amplifican de manera eficiente de la manera normal, con toda la secuencia del cebador superselectiva que sirve como una larga imprimación convencional de que es completamente complementaria a las (-) amplicones, que incluyen el complemento de la secuencia de puente de la imprimación en el lugar de la secuencia de intervención que estaba presente en la plantilla original (Fig 2)
el paso selectivo se produce sólo cuando un cebador superselectiva se hibrida a un ADN. (-) fragmento de plantilla presente en la muestra. Debido al pequeño tamaño de la secuencia de pie, la probabilidad de inicio de una amplicón (+) es significativamente mayor si la secuencia diana del pie en el (-) fragmento de plantilla es una secuencia mutante completamente complementaria, que si la secuencia diana de los pies en el (-) fragmento de plantilla es una secuencia de tipo salvaje no coincidentes. Si se produce (+) la síntesis de amplicón, entonces la resultante (+) amplicón sirve como una plantilla para un cebador inverso convencional, y se copia de manera eficiente durante el siguiente ciclo térmico, la generación de un (-) amplicón en el que el complemento de la puente único secuencia que estaba presente en el cebador superselectiva se sustituye por la secuencia de intervención que estaba presente en el original - fragmento de plantilla (). Como resultado, en ciclos térmicos posteriores, toda la secuencia del cebador superselectiva es complementaria a las (-) hebras de amplicón, y se produce la amplificación exponencial de manera eficiente, y se puede seguir en tiempo real
Optimización de. el diseño de cebadores supraselectiva
las tres partes de una imprimación supraselectiva sirven para diferentes funciones. La secuencia de anclaje 5 'está diseñado para que sea lo suficientemente largo y lo suficientemente fuerte para que a la temperatura de recocido del ensayo de PCR se une a la secuencia diana, con independencia de si o no la secuencia diana es de tipo mutante o silvestre. La corta secuencia 3 'del pie, por otro lado, está diseñado para ser capaz de unirse a la secuencia diana mutante completamente complementaria a la temperatura de recocido del ensayo de PCR, pero no se unen a la secuencia de tipo salvaje no coincidentes en las mismas condiciones . El papel de la burbuja, formado por la secuencia de puente en el cebador y la secuencia de intervenir en la plantilla, es doble: (i) mediante la separación de la secuencia de anclaje de la secuencia de pie, la presencia de la burbuja de cadena simple hace que el formación de la débil híbrido pie a ocurrir independientemente de la formación del fuerte híbrido de anclaje; y (ii) por la inmovilización de la secuencia de pie en el cebador a la secuencia diana potencial en la plantilla, la probabilidad de que la secuencia de pie corto (6, 7, u 8 nucleótidos de longitud) en realidad formar un híbrido se incrementa notablemente. Una secuencia de libre flotación del tamaño del pie sería casi nunca formar un híbrido con una secuencia diana en condiciones de hibridación de la PCR. Con el fin de comprender mejor el papel que juegan los diferentes segmentos de secuencias de cebadores supraselectiva, y con el fin de entender mejor manera de diseñar estos cebadores por lo que son altamente selectivos para cualquier secuencia diana dada, se llevó a cabo una serie de ensayos de modelo que exploró el diseño óptimo de la secuencia de pie, y el diseño óptimo de la burbuja.
la secuencia de tipo salvaje en la que el
se produce la mutación BRAF V600E
es rico en AT (3'-5-TAAAGTG '), asegurando así que los débiles híbrido no coincidente que forma con el pie de la
BRAF V600E
24-14 /14-5: 1: 1 imprimación supraselectiva es muy poco probable que formar en las condiciones de hibridación de la ensayo de PCR [23], que conduce a la supresión significativa de la síntesis de amplicón de tipo salvaje (Fig 1). Sin embargo, cuando llevamos a cabo ensayos similares con una imprimación supraselectiva diseñado para detectar el polimorfismo de un solo nucleótido en el
EGFR
L858R secuencia mutante, cuya presencia en el cáncer de pulmón de células no pequeñas predice la resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa [ ,,,0],24, 25], encontramos que su presencia en una secuencia rica en GC de tipo salvaje (3'-ACCCGAC-5 ') resultó en una menor supresión de la síntesis de amplificación de tipo salvaje. Por lo tanto, hemos llevado a cabo una serie de experimentos con diferentes
EGFR
diseños de cebadores L858R supraselectiva (figura 3) para optimizar la discriminación entre la secuencia mutante y su casi idéntica secuencia de tipo salvaje.
La secuencia de puente dentro de cada cebador supraselectiva se muestra en azul, y el nucleótido de interrogación en cada secuencia del pie se muestra en rojo. El
EGFR
cebadores L858R están dispuestas en grupos que reflejan su uso en experimentos comparativos. El
BRAF V600E
secuencia diana es de 69 pares de bases de longitud; la
EGFR
secuencias diana L858R son entre 79 y 87 pares de bases, dependiendo de la imprimación superselectiva que se utiliza; y el
EGFR T790M
secuencia diana es de 68 pares de bases de longitud.
Efecto de la variación de la longitud de la secuencia del pie
Hemos explorado el efecto de acortar la longitud de la secuencia de pie de la imprimación superselectiva para superar la mayor probabilidad de que el pie se forma un híbrido con la secuencia rica en GC presente en el
EGFR
objetivo de tipo salvaje. Hemos llevado a cabo tres series de ensayos, cada conjunto utilizando un cebador cuya secuencia supraselectiva pie fue de 6, 7, u 8 nucleótidos de longitud. En todos los demás aspectos, el diseño de los cebadores fue la misma: (i) el nucleótido de interrogación se encuentra en la penúltima posición en el extremo 3 'de cada pie; (Ii) la secuencia de anclaje fue de 24 nucleótidos de longitud; y (iii) la secuencia de puente y la secuencia de intervención fueron cada 14 nucleótidos de largo. Las secuencias de estos tres cebadores (
EGFR
L858R 24-14 /14-6: 1: 1;
EGFR
L858R 24-14 /14-5: 1: 1; y
EGFR
L858R 24-14 /14-4: 1: 1) se muestran en la figura 3. Cada conjunto de ensayos de PCR se inició con diferentes cantidades de plantilla mutante (10
6, 10
5, 10
4, 10
3, 10
2, y 10
1 copias) en presencia de 10
6 copias de molde de tipo salvaje. Los valores de umbral resultantes se representan gráficamente como una función del logaritmo del número de plantillas de mutantes inicialmente presentes (Fig 4A).
La linealidad de la relación entre el ciclo umbral y el logaritmo del número inicial de plantillas mutantes presente en las reacciones que contiene 10
6 plantillas de tipo salvaje y diferentes cantidades de plantilla mutante se determinó por ensayos de PCR iniciados con diferentes diseños de cebadores supraselectiva. (A) Las reacciones de PCR con cebadores iniciaron
EGFR
L858R supraselectiva que poseen secuencias pie de diferente longitud. reacciones (B) PCR iniciaron con
cebadores EGFR
L858R supraselectiva que se forman burbujas simétricas de diferente circunferencia.
Los valores de Ct obtenidos con el cebador que posee la longitud del pie más corto (seis nucleótidos, 4: 1: 1) todos caen en una línea recta, lo que demuestra que a pesar de que el
EGFR
secuencia diana es rica en GC, tan pocos como 10 plantillas mutantes podrían ser cuantificados sin intervención de las plantillas de 1.000.000 de tipo salvaje que estuvieron presentes. Cebadores que poseen longitudes de pie más largo (siete nucleótidos, 5: 1: 1; u ocho nucleótidos, 6: 1: 1), sin embargo, dio lugar a una divergencia de la linealidad cuando los objetivos mutantes son más raros, debido a la supresión inadecuada de la síntesis de amplicón en las abundantes plantillas de tipo salvaje. Estos resultados demuestran que más cortas longitudes de pie, a pesar de la reducción de la abundancia de equilibrio de los híbridos del pie, lo que resulta en un retardo más largo antes de alcanzar el umbral del ciclo, conducen a la selectividad mejorada. Desde un punto de vista termodinámico, la selectividad mejorada a longitudes de pie más corto es debido a la mayor proporción de la abundancia de equilibrio de los híbridos perfectamente complementarios pie mutantes en comparación con la abundancia de equilibrio de híbridos no coincidentes pies de tipo salvaje.
Efecto de la variación la ubicación de los nucleótidos de interrogación
también investigó el efecto de variar la ubicación del nucleótido de interrogación en la secuencia de pie en la capacidad del cebador para discriminar plantillas de mutantes a partir de plantillas de tipo salvaje. Hemos llevado a cabo una serie de ensayos de PCR en la que se utilizaron seis cebadores supraselectiva diferentes, cada una con un nucleótido de interrogación en una posición diferente dentro de una secuencia de 7 pies-nucleótidos de longitud. Las longitudes de la secuencia de anclaje, la secuencia de puente, y secuencia de intervención se mantuvieron a 24, 14, y 14 nucleótidos, respectivamente. Las secuencias de estos seis
EGFR
cebadores L858R se muestran en la Fig 3. Dos reacciones se llevaron a cabo con cada cebador, uno iniciado con 1.000.000 de copias de la plantilla mutante, y uno iniciados con 1.000.000 de copias de molde de tipo salvaje. Los ciclos de umbral que se observaron se enumeran en la Tabla 1. Los resultados muestran que la ventana de la discriminación (Ct) entre el ciclo umbral para el mutante y el ciclo umbral para el tipo salvaje es más amplia cuando la ubicación del nucleótido de interrogación está más cerca de el extremo 3 'del cebador. Porque sólo hay una pequeña diferencia en? Ct entre el cebador cuya nucleótidos interrogar fue localizado en el extremo 3 'de los pies (Ct = 18,8), y el cebador cuya nucleótidos interrogar estaba situado en la penúltima posición desde el extremo 3' de la pie (Ct = 18,2), llegamos a la conclusión de que la colocación de los nucleótidos de interrogación en cualquiera de las posiciones funciona bien. Desde el nucleótido de interrogación en la penúltima posición del extremo 3 'del pie no forma un par de bases con el nucleótido correspondiente en la secuencia de tipo salvaje, en condiciones de hibridación de la PCR, el nucleótido 3'-terminal del pie es muy poco probable para formar un par de bases con su nucleótidos complementaria correspondiente en la secuencia de tipo salvaje.
efecto de la variación de la circunferencia de la burbuja
también investigamos el efecto de la variación de la circunferencia de la burbuja de una sola cadena que separa funcionalmente el híbrido de anclaje del híbrido pie (ver figura 1).