Extracto
eventos epigenéticos son contribuyentes importantes a la patogénesis del cáncer, y la focalización mecanismos epigenéticos representa una nueva estrategia en la terapia contra el cáncer. agentes demetilantes clásicos, tales como 5-Aza-2'- desoxicitidina (decitabina), tienen el potencial para reprogramar las células cancerosas somáticas que demuestran una alta eficacia terapéutica en tumores hematológicos. Por otro lado, el tratamiento de tumores sólidos epigenética a menudo da lugar a efectos secundarios citotóxicos no deseados. sistemas de suministro apropiados capaces de enriquecer decitabina en el sitio de acción y mejorar su biodisponibilidad que reduciría la incidencia de la toxicidad en los tejidos sanos. En este trabajo proporcionamos evidencias preclínicas de una terapia epigenética seguro, versátil y eficiente dirigido a tratar la hormona sensible (LNCap) y los cánceres de próstata refractario a hormonas (DU145). Una nueva formulación decitabina, basado en el uso de eritrocitos diseñados (eritro Magneto-hemaglutinina virosomas, EMHVs) sistema de administración de fármacos (DDS) que lleva este medicamento, ha sido refinado. Dentro de las EMHVs, el medicamento estaba protegido del ambiente y fosforilada en su forma activa. La novela magnético EMHV DDS, dotado de proteína fusogénica, mejoró la estabilidad de la droga transportada y exhibió una alta eficiencia en el confinamiento de su entrega en el lugar de acción
in vivo
por aplicación de un campo magnético estático externo. Aquí mostramos que Decitabine carga en EMHVs induce una reducción de la masa tumoral significativa en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata a una concentración, que es setecientas veces más baja que la dosis terapéutica, lo que sugiere un farmacocinéticos mejorados /farmacodinámica de los fármacos. Estos resultados son relevantes para los y discutido a la luz del desarrollo de terapias personalizadas autólogas y enfoque clínico innovador para el tratamiento de tumores sólidos
Visto:. Naldi I, Taranta M, L Gherardini, Pelosi G, F Viglione, Grimaldi S , et al. (2014) Novela Terapia epigenética objetivo para el cáncer de próstata: un estudio preclínico. PLoS ONE 9 (5): e98101. doi: 10.1371 /journal.pone.0098101
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Diciembre, 2013; Aceptado: 28 de abril de 2014; Publicado: 22 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Naldi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) financiación y financiada por la Comunidad Europea para pOR CREO FESR 2007-2013, BANDO UNICO R & amp; S-ANNO 2012 de la Región Toscana-Proyecto siglas Título: ACTILA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Caterina Cinti es miembro del consejo editorial de PLOS ONE, pero esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es un tumor maligno comúnmente diagnosticado en los países desarrollados y su incidencia aumenta dramáticamente con la edad [1], [ ,,,0],2]. A pesar del éxito probado de la terapia hormonal, la castración quirúrgica [3], [4] y la radioterapia [5] - [7], sin embargo después de haber sido administrado un subgrupo de pacientes progresión de la enfermedad manifiesta y se convirtió en la resistencia a la manipulación adicional hormonal [8] - [10]. Hasta un 20% de los pacientes tratados con PC prostatectomía radical tienen la probabilidad de progresar a cáncer invasivo con condiciones metastásicos recaída dentro de 5 a 10 años [11]. La mediana de supervivencia de los pacientes con CP metastásico es de 12-16 meses desde el momento del diagnóstico hasta la muerte [12]. No hay tratamientos curativos están disponibles en esta etapa de la enfermedad. A pesar de intensos esfuerzos de investigación, los mecanismos moleculares por los cuales las células del cáncer de próstata se vuelven resistentes a la terapia hormonal siguen siendo poco caracterizados.
Alteraciones epigenéticas, que implican la hipermetilación de los genes en las vías críticas, tales como la reparación del ADN, el metabolismo, y la invasión /metástasis, se han encontrado en el cáncer de próstata proporcionar nueva información de la patogénesis de este tumor [13], [14]. Las modificaciones postraduccionales debilitamiento de la estructura de la cromatina alteran la expresión génica y células conducen a la diseminación metastásica. Sin embargo, como las modificaciones epigenéticas no requieren el cambio en la secuencia de ADN que son potencialmente reversible. metiltransferasas de ADN (DNMTs) que participan en el silenciamiento epigenético de la expresión génica se convierten por lo tanto, un objetivo adecuado para los tratamientos epigenéticos [15] - [17].
Decitabine (5-Aza-2 'dC) es un clásico de desmetilación agente aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes con síndromes mielodisplásicos y la leucemia linfoblástica aguda (ALM) [18]. Sin embargo, el tratamiento beneficioso de Decitabine sigue siendo incierto para los pacientes con tumores sólidos como la falta de estabilidad química en solución acuosa y la alta incidencia de neutropenia se han asociado con su uso.
Recientemente, el efecto antiproliferativo de Decitabine tiene sido probado en diferentes histotypes tumorales tales como testicular [19], pulmonar [20], de mama [21], células de cáncer colorrectal [22], tumores del SNC [23] y el cáncer de próstata [24] - [26]. Estos resultados alentadores indicaron que Decitabine podría ser eficaz en la inhibición de la progresión del cáncer y la inducción de la diferenciación celular. A pesar de estos
in vitro y los informes de, se hizo hincapié en la necesidad de mejorar la estabilidad del fármaco en solución y la entrega de eficacia, para minimizar los efectos secundarios tóxicos y prolongar los resultados epigenéticos
in vivo
.
El notable potencial terapéutico de Decitabine está, de hecho, obstaculizada por su inestabilidad sistémica [27]. Su bajo índice terapéutico y la dificultad para calibrar la concentración en sangre en estado estacionario han afectado a varios estudios clínicos.
En los últimos años, los sistemas de administración de fármacos (DDS) se han desarrollado para mejorar la prestación específica y localizada de agentes terapéuticos para apuntar tumoral tejido evitando al mismo tiempo los efectos secundarios tóxicos graves en órganos sanos [28], [29]. sistemas de liberación de fármacos basados en células tales como eritrocitos son herramientas particularmente atractivos para la entrega de varias clases de agentes terapéuticos. Los eritrocitos son portadores seguros y biocompatibles que pueden acomodar moléculas de diferente tamaño, la naturaleza y la estabilidad y que son particularmente útiles para aquellos agentes que muestran la penetración del tejido limitada o se inactivan rápidamente tras la administración i.v.
in vivo
Administración [30] - [32]. Por otra parte, los eritrocitos circulantes también actúan como biorreactores convertir un pro-drogas en sus formas activas.
Un nuevo sistema de administración de fármacos basado en eritrocitos, dotado con ambas nanopartículas super-paramagnéticas (PN) dentro de los eritrocitos y una glicoproteína fusogénica , la hemaglutinina filamentosa (FHA), se inserta en las membranas citoplasmáticas de eritrocitos (eritro Magneto-hemaglutinina virosomas, EMHVs), fue recientemente patentados (WO2010 /070620 (A1)).
se ha demostrado que estos EMHV mejoró la cinética de compuestos terapéuticos en las células diana
in vitro
. liberación intracelular de drogas eficiente se consigue en las células huésped debido a la presencia de la glicoproteína fusogénica sobre membranas EMHV [33], [34].
La naturaleza magnética de este sistema de administración de fármaco permite EMHV a ser dirigido hacia los tejidos deseados /órganos
in vivo
tras la aplicación de un campo magnético externo.
Aquí hemos probado una "terapia epigenética" objetivo basado en el uso de bajas dosis de 5-Aza-2 'dC cargado en EMHVs en dos modelos de cáncer de próstata. Las células humanas de adenocarcinoma de próstata LNCaP que responden a la terapia hormonal, y DU145, células refractarias hormonales, se han utilizado [35]
in vitro
y
in vivo
en modelos de tumores de xenoinjertos. Se demuestra que la actividad anticancerígena farmacológico de 5-Aza-2 'dC se incrementa notablemente por nuestro sistema de entrega EMHVs tanto
in vitro
y
in vivo
que sugiere su posible aplicación en futuros ensayos clínicos .
Materiales y Métodos
Reactivos
nanopartículas superparamagnéticas (NPS) se adquirieron de nano-screenMAG, Chemicell, Berlín, Alemania. La hemaglutinina filamentosa de
Bordetella pertussis gratis (FHA), 5-aza-2'- deoxicytitidine (5-Aza-2 'dC), acetonitrilo de calidad HPLC, N', N'-dimetilhexilamina (DMHA), citidina sal -5'-trifosfato disódico (CTP) y de 2'-desoxiuridina (dU) se adquirieron de Sigma-Aldrich, Milán, Italia. Metanol y acetato de amonio fueron adquiridos de Carlo Erba, Milán, Italia.
EMHVs Preparación de 5-Aza-2 'cargados-dC (A-EMHVs) guía
Los eritrocitos humanos fueron preparados por gradiente centrifugación a 400 g durante 30 minutos y después se lavó dos veces en 1X PBS (1,37 M NaCl, KCl 57 mM, Na 54
2HPO
4, KH 45 mM
2 PO
4 pH 7,4). 2 × 10
9 eritrocitos se lisaron en 250 l de tampón de lisis 1 (mM TRIS 10, EDTA 0,1 mM, MgCl 1 mM
2 pH 7,2) durante 60 minutos a 0 ° C. A continuación, la isotonicidad se restauró mediante la adición de 130 l de tampón de resellado (65 l de 10X PBS pH 7,4 y 65 l de mM MgCl 15
2 pH 7,4), suplementado con 2 g de FHA, 0,1 mg de 100 nm super-paramagnético NPs y 75 g de 5-Aza-2 'dC.
La suspensión se incubó durante 45 minutos a 37 ° C con agitación suave para promover el resellado y obtener eritrocitos ingeniería cargadas con 5-Aza-2' CC (A-EMHVs). A-EMHVs se recogieron por centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Sucesivamente la suspensión de eritrocitos se lavó dos veces con 1X PBS mediante centrifugación a 8000 g durante 15 minutos a 4 ° C, se resuspendió en PBS 1X y se conserva a 4 ° C hasta su uso.
Cultivo celular
líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y DU145 se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se mantuvieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, en presencia de 100 U /ml de penicilina-estreptomicina, en relación de división de 1:03 dos veces a la semana. Se utilizaron estas células de cáncer de próstata, tanto para
e in vitro
in vivo
experimentos.
Microscopía confocal de barrido láser (CLSM) análisis
células DU145 en una densidad de 1,5 × 10
5 se sembraron en placas de microtitulación de 6 pocillos. En la parte inferior de los cubreobjetos de vidrio placas de cultivo se colocan en el que se permiten a las células crecer hasta 60-80% de confluencia. Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio que contiene 1,5 × 10
8 A-EMHVs. En una muestra, medio fresco fue reemplazado sin la adición de EMHVs para visualizar la estructura celular naïve (control). Después de 6, 24 y 48 horas de incubación, los cubreobjetos se recuperaron y se lavaron las células en tampón PBS 1X y se fijaron con 4% de paraformaldehído. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI contador, se lavaron con PBS 1X y todo el cubreobjetos se monta en un portaobjetos utilizando medio anti-desvanecimiento. Las imágenes de fluorescencia y campo claro fueron capturados por CSLM, Leica TCS SP5 sistema de microscopio invertido, equipado con fuentes que emitan desde el ultravioleta al visible. DAPI fluorescencia se detectó usando excitación a 405 nm y la grabación de la emisión a 454 nm, mientras que la fluorescencia roja de los PN super-paramagnéticas estaba excitado a 543 nm y se detectó la emisión a 613 nm.
Espectrometría
cromatografía líquida de masas ( HPLC-MS) análisis de la 5-aza-2 'dC cargado en EMHVs
Para cuantificar la cantidad total de 5-Aza-2' de CC dentro de los eritrocitos modificados, 2 × 10
9 recién preparado a-EMHVs se lisaron en 200 l de tampón de lisis 2 (155 NH mM
4Cl, mM de KHCO 10
3, EDTA 0,1 mM, pH 7,2) durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugó a 12.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a un dispositivo de filtro centrífugo Microcon con MWCO 30.000 Da (Amicon YM-10, Millipore, Vimodrone MI, Italia) y después se centrifugó a 14.000 g durante 2 horas a 4 ° C. Las muestras filtradas se mantuvieron a -80 ° C hasta su análisis. El sistema de HPLC usado fue un Dionex 3000 última serie LC (Sunnyvale, CA, EE.UU.) conectado a una trampa de iones del espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap lineal (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), equipado con una fuente de iones por electrospray. Los datos fueron adquiridos y se procesan con un software Excalibur 2.1. Los compuestos se separaron en una columna Mediterranea Sea18 de fase inversa (150 mm, 2,1 mm de diámetro interno y tamaño de partícula 5 micras) de Teknokroma (Analytical Technology S.r.l., Brugherio Milán, Italia). La columna se ajustó a un caudal de 0,25 ml /minuto, a una temperatura de 36 ° C, y se inyectaron volúmenes de muestra de 10 l. La fase móvil consistía en acetato de amonio 5 mM (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B). Los primeros 13 minutos fueron de una carrera isocrática con un disolvente; entre 13 y 20 minutos, el porcentaje de fase móvil B se aumentó a 35%, mantenido durante 2 minutos y luego la inicial la fase móvil se restableció en 2 minutos. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de electrospray positivo y la energía de colisión fue de 35 eV. Las transiciones monitorizados fueron m /z 229 --- & gt; 113 para 5-Aza-2 'dC; m /z 219 --- & gt; 103 para guanilurea derivados; m /z 247 --- & gt; 131 para los derivados formulados de 5-Aza-2 'dC. Para buscar posibles formas fosforiladas de 5-Aza-2 'dC, 2 × 10
9 recién preparadas A-EMHVs se dejaron a 37 ° C durante 24 horas. Sucesivamente, las muestras se lisaron y se filtraron como se ha descrito anteriormente y 400 ng de CTP se añadieron a las muestras como estándares internos. La fase móvil consistió en 20 mM pH 7,0 DMHA (disolvente A) y metanol-agua 80:20 (disolvente B). Los primeros 12 minutos fueron un barrido isocrático con un 10% de disolvente B; entre 12 y 15 minutos, el porcentaje de fase móvil B se aumentó a 80%, se mantuvo durante 1 minuto y luego la inicial de la fase móvil se restableció en 2 minutos. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de electropulverización negativa y la energía de colisión era 15 eV. Las transiciones fueron monitoreados m /z 482 --- & gt; 384 para la CTP; m /z 467 --- & gt; 369 para 5-Aza-2 'dC trifosfato; m /z 387 --- & gt; 289 para 5-Aza-2 'dC difosfato; m /z 307 --- & gt; 208 para 5-Aza-2 'dC monofosfato correspondiente a la eliminación de una molécula neutra de H
3PO
4. Para la curva de calibración, se utilizaron seis soluciones estándar CTP diferentes. La relación de área de pico de la muestra /CTP se usó para la cuantificación.
citofluorimétrico (FACS) análisis
células LNCaP y DU145 a una densidad de 1,5 × 10
5 fueron sembradas en 6- así placas de microtitulación para ensayos de ciclo celular. Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio que contiene: ningún fármaco (CTRL); libre de 5-aza-2 'dC en dosis de 6,8 mg o 120 ng; 1,5 × 10
8 A-EMHVs (que contiene aproximadamente 120 ng de 5-Aza-2 'dC).
Después de 24, 48 y 96 horas de incubación, el control y las células tratadas se recogieron y se analizaron por FACS. Los núcleos se tiñeron con 10 mg /ml de yoduro de propidio (PI) en una solución hipotónica (1X PBS que contenía 0,1% de citrato de sodio y 0,1% de Triton X-100) durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad para la evaluación de las fases del ciclo celular.
apoptóticas se detectaron mediante la prueba de Anexina V (Biovision). Las células tratadas y no tratadas se suspendieron en tampón de unión 1X y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos con Anexina V-FITC y se añadió yoduro de propidio (PI) para los núcleos de tinción siguiendo las instrucciones del fabricante.
citometría de flujo se llevó utilizando Becton-Dickinson FACScan CentroII y los datos se analizaron mediante el software FlowJo.
Animales
en los experimentos llevados a cabo en las instalaciones de animales de la Universidad de Marshall, atímicos Balb /c ratones desnudos congénitas, homocigotos para
nu
/
nu
alelo, fueron criados en casa. La colonia de ratones machos de 8 a 12 semanas de edad, fue desarrollado a partir de cría obtenidos de Charles Ríos Laboratories (Wilmington, MA). Estos animales fueron utilizados para experimentos de xenoinjertos LNCap.
Los animales utilizados en el experimento llevado a cabo en las instalaciones de los animales "Toscana Ciencias de la Vida" eran atímicos Nude-Foxn1
nu
ratones machos, 6 semanas de edad, comprados de Harlan Laboratories (Udine, Italia). Estos animales se utilizaron para xenoinjertos de DU145.
En ambos casos, los animales fueron alojados en micro-aisladores en jaulas autoclave con cubiertas de filtro de fibra de poliéster, en condiciones libres de gérmenes. Toda la comida, agua y ropa de cama se esterilizaron y los animales se mantuvieron a una temperatura ambiente de 23 ± 2 ° C en las habitaciones tiene un ciclo de 12 horas de luz /oscuridad.
De imágenes
de rayos X
atímicos Balb /c ratones desnudos fueron inyectados con 1,5 × 10
8 EMHVs suspendido en 150 ml de 1X PBS.
Después de la inyección en vena de cola EMHVs, un grupo de animales fueron expuestos al campo magnético externo mediante la colocación de dos imanes de tierras en la región abdominal lateral inferior durante 30 minutos (EMHVs-MF), mientras que los ratones se mantuvieron bajo anestesia con isofluorano al 2%. imanes Neodinium (forma redonda 5.0 mm) con una fuerza coercitiva de aproximadamente 1.000 KOersted, se utilizaron. Un grupo control de ratones fue inyectado vena de la cola con EMHVs como se describe anteriormente, pero no hay ningún campo magnético externo se aplicó (EMHVs-NMF). Una hora después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia y la acumulación de perlas ferrosos se evaluó por formación de imágenes de rayos X. El análisis de imágenes se realizó con un sistema de radiografía digital de Philips DigitalDiagnost directa con la tecnología de detector plano (Philips, Hamburgo, Alemania) con una dosis de 60 kVp a los 5 Mas.
tumorales de xenoinjertos procedimientos
Tanto atímicos BALB /c desnuda y desnuda-Foxn1
nu
los ratones fueron anestesiados por 2,5% de isoflurano durante la manipulación
La configuración de los modelos:. células LNCaP o DU145 se concentraron a 7 × 10
6 o 4,5 × 10
6 respectivamente en 1X PBS y se inyectaron por vía subcutánea 01:01 con matriz de membrana basal MatrigelTM (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en el flanco izquierdo de cada ratón (Total l volumen 200). Una vez xenoinjertos comenzaron a crecer, sus tamaños (mm
3) se midieron dos veces a la semana con un calibrador digital y el volumen se calcula utilizando la fórmula estándar: largo x ancho
2/2. xenoinjertos de tumores se dejaron crecer aproximadamente hasta 100 mm
3 y este volumen fue seleccionada como la etapa inicial para comenzar el tratamiento. Los ratones se asignaron al azar (n = 6), anestesiadas y se prepararon para la inyección en vena de cola con el tratamiento seleccionado. Antes de cada inyección, se midieron los tumores y se compararon con los volúmenes iniciales correspondientes, con el fin de normalizar los datos (X = 100 x volumen
1 /volumen
0). Aleatorización: Los ratones fueron asignados a siete grupos diferentes en los dos parámetros experimentales (LNCap o DU145 xenoinjertos) y fueron tratados como sigue: 1X PBS (CTRL); 85 mg 5-Aza-2 '-dC (2,5 mg /kg) (A1); 120 ng de 5-Aza-2 '-dC (A2); 1,5 × 10
8 EMHVs descargadas en ausencia de campo magnético estático (EMHVs-NMF); 1,5 × 10
8 EMHVs descargadas y el campo magnético estático aplicado sobre el tumor (EMHVs-MF); 1,5 × 10
8 EMHVs que contienen 120 ng 5-aza-2'- dC (A-EMHVs-NMF); 1,5 × 10
8 EMHVs que contienen 120 ng de 5-Aza-2 'dC y el campo magnético estático aplicado en tumor (A-EMHVs-MF)
protocolo de inyección:. Los ratones se administraron cada dos semanas por vía intravenosa con 150 l tratamiento por inoculación, más de 3 semanas. Después de cada inyección en los grupos seleccionados a ser tratado también con el campo magnético estático (EMHVs-MF y A-EMHVs-MF), dos imanes de tierras (1000 KOersted) se aplicaron a la masa de xenoinjerto durante 30 minutos para asegurar la acumulación intra-tumor. Los ratones se dejaron recuperar y monitorizarse para detectar cualquier señal de socorro. Al final del curso de tratamiento o cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 400 mm
3, los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia y la masa del tumor de próstata, el hígado, los riñones se recogieron y se almacenaron a -80 ° C hasta El análisis adicional.
El análisis morfológico e inmunohistoquímico de xenoinjertos de tumores
Las muestras congeladas almacenadas a -80 ° C fueron equilibrar a -20 ° C durante la noche antes de seccionar por criostato (Microm HM 500 W) después de la incrustación en octubre
criosecciones seriadas consecutivas de 5-6 micras de espesor se obtuvieron de la porción media (más grande) de cada muestra, colocan en portaobjetos cargados positivamente, se secó al aire durante unos pocos minutos y luego se fija con acetona fría . Dos y cuatro secciones fueron teñidas con hematoxilina de Mayer para el examen histopatológico.
Después del lavado en 1X PBS e incubación en H
2O
2 a temperatura ambiente para bloquear la peroxidasa endógena, la sección se incubaron con diluido suero de bloqueo normal, preparada a partir de las especies en las que se hace el anticuerpo secundario. Los portaobjetos se incubaron en cámara húmeda durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios humanos reactivos para Ki67 (SP6 clon, el anticuerpo monoclonal de conejo, Thermoscientific) a una dilución 1:200 y DNMT3b (52A1018 clon, anticuerpo monoclonal de ratón, IMGENEX) a la dilución 1 :150. Después de 30 min secundaria de anticuerpos con biotina y 30 min Vectastain Elite ABC reactivo Las diapositivas fueron incubación con solución de sustrato de peroxidasa (DAB). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Mayer durante 1 min, y se monta en el monte acuosa Rápida (Bioptica). El examen microscópico se llevó a cabo a partir de 2x a 40x aumentos con un microscopio óptico Olympus BX43 interfaz con una cámara de vídeo para la adquisición y análisis de imágenes digitales (DP20 Olympus). Los valores de Dnmt3b y Ki67 núcleos positivos se expresaron como porcentaje de células positivas o negativas sobre el conteo de al menos 500 células totales de 20 aumentos originales.
El análisis estadístico
Las fases del ciclo celular se expresan como media ± desviación estándar de al menos n = 3. las tres maneras de ANOVA se aplicaron para comparar el efecto de diferentes tratamientos (CTRL, 6,8 mg 5-aza-2 'dC; 120 ng 5-aza-2' dC; 1.5 × 10
8 a-EMHVs) en fases del ciclo celular (sub G1, G0-G1, S, se utilizó G2-M) y ANOVA de un factor para comparar el efecto de a-EMHVs tratamiento en puntos de tiempo seleccionados (24 , 48 y 96 horas).
Las células apoptóticas se expresaron como media ± SEM de al menos n = 3. el análisis estadístico se realizó con ANOVA de un factor independiente de la apoptosis temprana y tardía en los datos transformados logarítmicamente que mejore normalización. Las comparaciones por pares se probaron utilizando el criterio de la diferencia honestamente significativa de Tukey
.
El
in vivo
resultados se expresan como media ± SEM de n = 6. Se aplicó ANOVA de un factor para comparar la reducción de la masa tumoral en la evaluación del implante de xenoinjerto después del tratamiento seleccionado usando los datos recogidos en la última inyección. Para describir la tasa de reducción de la masa tumoral (50%) en ratones después de los tratamientos seleccionados, se aplicó el análisis de Kaplan-Meier seguido de la prueba de log-rank.
declaraciones Ética
glóbulos rojos humanos se obtuvieron a partir bolsas de transfusión recogidos de donantes voluntarios sanos anónimos, que han dado su consentimiento informado por escrito a cabo de conformidad con la legislación Gobierno italiano. No fue necesaria la aprobación de un comité de revisión institucional (comité de ética), ya que ni la participación humana directa ni participación de los estudios en humanos han sido previstos en este trabajo. Las muestras han sido proporcionados por Azienda Ospedaliera Universitaria Senese.
El estudio preclínico se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de las directrices internacionales sobre el manejo de animales de laboratorio y la aplicación de las 3R a experimentos (de conformidad con el NIH y recomendaciones de la Comisión Europea)
los protocolos para experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Marshall (Huntington, Virginia Occidental, EE.UU.) (Número de permiso:.#458 /2010) y por los Comités de Ética de las Ciencias de la vida Toscana y el Istituto Superiore di Sanità (ISS) en nombre del ministro italiano de Salud (Número de Permiso:#CNR-270111 exp1 /PROT1). Bienestar animal se controló de acuerdo a Langford et al, 2010. [36] "
Resultados
Caracterización de formulación novedosa contra el cáncer en el sistema de administración de fármacos a base de eritrocitos
Para mejorar el perfil de rendimiento de 5-Aza-2 'dC profármaco, con respecto a la estabilidad química, la farmacocinética y la farmacodinámica, ingeniería eritrocitos portadores magnéticos (EMHVs) fueron utilizados como sistema de administración de fármacos (DDS). la cinética de internalización EMHV DDS y su toxicidad, así como la eficiencia y la eficacia de este novedoso contra el cáncer formulación 5-Aza-2 'dC se ensayaron en primer lugar
in vitro
en la hormona sensible (LNCap) y las células de cáncer de próstata resistentes (DU145).
la internalización de la portadora EMHVs en células tumorales
in vitro
.
la cinética de EMHVs internalización en ambas células de cáncer de próstata LNCaP y DU145 se confirmó por análisis de microscopía de escaneo láser confocal ( CSLM) mediante el control de la distribución de los NPs fluorescentes liberados (verde) en el citoplasma de las células diana (Fig. 1). Un ejemplo de células ingenuas DU145 se muestra en la Fig. 1A. Internalización ya se está llevando a cabo a las 6 horas después del tratamiento, cuando se encontraron EMHVs dentro del citoplasma de las células DU145. En esta etapa EMHVs todavía conservan su membrana intacta y su contenido de NPs (Fig. 1B). De manera similar a lo encontrado en nuestro trabajo previo [33], después de la internalización de la membrana EMHV se fusiona con la membrana de la célula huésped liberando el contenido fluorescente en todo el espacio citoplásmico (Fig. 1C-E). En los últimos puntos de tiempo (48-96 horas) una amplia difusión de la fluorescencia PN es detectable en el citoplasma aunque las células anfitrionas parecen morfológicamente sanos y ningún efecto citotóxico es visible (Fig. 1D-E).
Representante CLSM imágenes de EMHVs internalización y la distribución de las nanopartículas liberado (señal de fluorescencia verde, B-e) en el citoplasma de la célula huésped en varios puntos de tiempo se representan. células de los animales (A) se presentan como control. En (B), después de 6 horas de tratamiento, un EMHV intacto está presente en el citoplasma (flecha). A las 24 horas (C) las partículas parecían haber sido liberado de las EMHVs. En las fotos tomadas en 48 (D) y 96 horas (E), las nanopartículas parecen haber distribuido homogéneamente por todo el citoplasma. La falta de efecto tóxico de los eritrocitos tratamiento sistema de administración de fármacos se evaluó mediante análisis FACS (F), donde el perfil celular de las células tratadas (EMHVs) en los puntos de tiempo seleccionados no muestran cambios significativos en la distribución de sub-fase con respecto al control (CTRL).
La falta de toxicidad de los portadores EMHV en modelos celulares.
La toxicidad de EMHV DDS contra las células anfitrionas se evaluó mediante el análisis de fases del ciclo celular de las células diana. Cuando se trata con EMHVs sin carga durante 48 y 96 horas, sin cambio en la distribución de fase de células LNCaP y DU145 fue detectable y células retenidas su ciclo normal de las células durante la duración del tratamiento (Fig. 1F). Este hallazgo sugiere que el sistema de administración de fármacos EMHVs no ejerció ningún efecto tóxico sobre las células del cáncer en sí.
Estabilidad química de la 5-Aza-2 'dC en el sistema de biorreactor EMHV (A-EMHVs).
5-Aza-2 'dC es un profármaco y requiere ser activado por fosforilación de un nucleósido trifosfato antes de ejercer inhibición en la metilación del ADN [37].
Recientemente se ha demostrado que eritrocitos actúan como biorreactores debido a sus sistemas enzimáticos [34]. Esto hace que sean adecuadas para la encapsulación de pro-fármacos que posteriormente se transformaron en el fármaco activo [38]. Cargando 5-Aza-2 'dC pro-fármaco en el sistema biorreactor EMHV se consigue de acuerdo con un protocolo normalizado (ver materiales y métodos). HPLC-MS se utilizó para cuantificar la cantidad total de fármaco en el interior del DDS (A-EMHVs) y para detectar la presencia de sus formas fosforiladas activas. El cromatograma de muestras incubadas durante 24 horas a 37 ° C pone de relieve una mezcla de diferentes formas fosforiladas de 5-Aza2'-dC (Fig. 2). Di- y tri-fosfato formas de fosforilados eluyen 5-Aza2'-dC a TA 16,6 y 16,5 respectivamente RT (Fig. 2B y 2C). La figura 2D muestra el pico de thriphosphate citidina (CTP; RT: 16,5), un estándar interno que hemos añadido a nuestras muestras como control. Parece que la forma tri-fosfato del 5-Aza2'-dC overbears las otras formas fosforiladas que demuestran la alta eficiencia de EMHVs como biorreactores. Se encontró que el 1,5 × 10
8 A-EMHVs tiene capacidad para aproximadamente 120 ng de fármaco total y que las formas fosforiladas activas de 5-Aza-2 'dC representa el 50% del total del fármaco cargado en la A-EMHVs.
cromatogramas (a) para 5-Aza-2 'dC mono-fosfato; (B) di-fosfato (RT: 16.6); (C) tri-fosfato (RT: 16.5) y (D) interna estándar CTP (RT: 16.5).
La actividad anti proliferativa de A-EMHVs
in vitro
.
el efecto antiproliferativo de a-EMHV en la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis se puso a prueba en los dos modelos de cáncer de próstata: la hormona sensibles células LNCaP y el cáncer de próstata línea celular DU145 independientes de andrógenos en los enfoques terapéuticos tradicionales se ven obstaculizados por la la falta de capacidad de respuesta a la terapia hormonal y la expresión del antígeno PSA en la membrana celular.
el efecto de 1,5 × 10
8 tratamiento a-EMHVs, que contiene aproximadamente 120 ng interno 5-Aza2'-dC, ha sido en comparación con la de libre 5-Aza-2 'dC utiliza a la dosis de 2,5 M (un total de 6,8 g) reducido a partir de la dosis terapéutica utilizada en las clínicas. También comparó el efecto de la misma cantidad de 5-Aza-2 'dC contenida dentro de la A-EMHVs (120 ng) se utiliza como solución de fármaco libre.
En las células LNCaP de respuesta de la hormona (Fig. 3A) , el tratamiento a-EMHVs indujo un enriquecimiento significativo en el sub G1 que sugiere una posible activación de la respuesta de apoptosis (Fig. 3A). Este cambio ya era detectable a las 48 horas después del tratamiento (Fig 3A del panel medio.) Y alcanzó significación estadística a las 96 horas (ANOVA p & lt; 0,05). Se obtuvo un cambio similar hacia la distribución G1 sub también Uso de 6,8 g de libre 5-Aza-2 'dC (ANOVA p & lt; 0,05), sin embargo esta dosis es más de 50 veces mayor que el 5-Aza-2' DC cargadas en la A-EMHVs. Por otra parte, el efecto de 6,8 mg libre de tratamiento con 5-Aza-2 'dC parece tener un inicio más tardío en comparación con A-EMHVs. Esto es probablemente debido al hecho de que el 5-Aza-2 'dC, encapsulado en el EMHVs se activa fácilmente en formas fosforiladas mejora de 5-Aza-2'-dC farmacocinética /farmacodinámica. dosis notablemente bajos de libre 5-aza-2'- dC (120 ng) no ejercieron efecto secundario desplazamiento G1 y el perfil de distribución del ciclo celular no difieren de los controles hasta 96 horas.
1,5 × 10
8 tratamiento a-EMHVs, que contiene 120 ng interno 5-aza-2 'dC, fue comparado con 6,8 g libre de 5-aza-2' dC y 120 ng gratuitas tratamientos 5-aza-2'- dC en 24 (arriba) 48 (media) 96 horas (abajo). Se usaron células sin tratar como control (CTRL). En ambos LNCap (A) y DU145 (B) líneas celulares, A-EMHVs tratamiento indujo un enriquecimiento significativo en la distribución de células G1 sub (barras negras) ya detectable a las 48 horas después del tratamiento (A y el panel medio B, respectivamente) que duran hasta a 96 horas (* ANOVA p & lt; 0,05). También se obtuvo desplazamiento similar hacia la distribución sub G1 usando 6,8 g de libre 5-aza-2'- dC (§ANOVA p & lt; 0,05), pero sólo se detecta en 96 horas. No se detectó ningún cambio en la distribución del ciclo celular de forma gratuita 120 ng 5-aza-2 'dC, no difieren de los controles.
línea celular DU145 resistentes Una tendencia similar hacia la fase sub G1 se describe en la hormona