Extracto
La hipoxia, ephrin-A1 y la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) han demostrado jugar un papel crítico en la angiogénesis tumoral. Sin embargo, la forma en ephrin-A1 está regulado por la hipoxia y si ephrin-A1 coopera con la eNOS en la modulación de la angiogénesis aún no se han abordado en detalles. Aquí hemos demostrado que tanto ephrin-A1 en células de carcinoma de células escamosas (SCC-9) y especialmente soluble en ephrin-A1 en los sobrenadantes fueron reguladas bajo condiciones hipóxicas. Se observó un aumento de la producción de óxido nítrico (NO) en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) en la angiogénesis inducida por ephrin-A1 que se invirtió después de co-cultivo con eNOS inhibidor específico, N-nitro-L-arginina hidrocloruro de éster metílico de (L -NOMBRE). Western blot confirmó que tanto la fosforilación de Akt
Ser473 y eNOS
Ser1177 fueron reguladas en HUVEC estimulada por ephrin-A1, con la total expresión de eNOS sin cambios. El inhibidor específico de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), LY294002, significativamente las reguladas expresión inducida ephrin-A1 de Akt fosforilada
Ser473, así como la fosforilación de la eNOS
Ser1177. Estos resultados revelaron un posible mecanismo mediante el cual novela ephrin-A1 se regula en el microambiente del tumor y promueve la angiogénesis a través de una diafonía coordinada con /activación eNOS Akt dependiente de PI3K que puede relacionarse con el desarrollo vascular normal y la neovascularización tumoral.
cita: canción y, Zhao XP, canción K, Shang ZJ (2013) Efrina-A1 está regulado por la hipoxia en las células cancerosas y promueve la angiogénesis de HUVEC a través de un coordinado Cross-Talk con la eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10.1371 /journal.pone.0074464
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 18 Enero, 2013; Aceptado: 3 Agosto 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172570 y Nº 30872893). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una variedad de factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos participar en el control de la angiogénesis que juega un papel esencial en el crecimiento tumoral y la metástasis [1] - [3]. Ephrin-A1 y su receptor primario, EphA2, no sólo se expresan en múltiples tumores malignos, pero también juegan un papel vital en la neovascularización tumoral y normal de la angiogénesis [4]. La sobreexpresión de ephrin-A1 en las células tumorales pueden promover el proceso angiogénico, mientras que derribar de ephrin-A1 en las células tumorales contribuye significativamente a la reducción de la migración de células endoteliales inducida por tumor en la densidad microvascular vitro e in vivo [5]. Nuestro estudio anterior mostró que sobre-expresan EphA2 puede contribuir a la angiogénesis tumoral y tienen valor pronóstico en el carcinoma de lengua [6]. Hay suficiente evidencia experimental que sugiere que la activación de EphA2 en las células endoteliales (EC) se requiere para ephrin-A1 para ejercer sus efectos angiogénicos in vitro e in vivo [7]. Sin embargo, los factores de regulación y mecanismos por los que ephrin-A1 /EphA2 promover la angiogénesis tumoral no fueron bien aclarados.
Se ha informado de que varios factores de crecimiento y citoquinas pueden inducir la expresión de ligandos ephrin, tales como necrosis tumoral factor α (TNF-α), la interleucina-1β (IL-1β), et al [8]. La hipoxia es una de las características más comunes e importantes en microambiente tumoral, y contribuye a la inducción de varios factores angiogénicos [9]. Recientemente, HIF-1α, un factor de transcripción inducible por hipoxia, se ha encontrado que un máximo de regular efrinas y los receptores de Eph en piel de ratón [10]. En los cánceres de cabeza y cuello, el aumento de expresión ephrin-A1 se asoció con pO
2 en microentorno del tumor [11]. Aunque ephrin-A1 desempeña un papel crítico en la angiogénesis tumoral y parece estar implicado en respuesta a la hipoxia, la mayoría de los estudios anteriores se han centrado principalmente en ephrin-A1 como una proteína unida a la membrana. A nuestro entender, hay relativamente poca evidencia directa de si la hipoxia puede inducir a las células cancerosas para producir ephrin-A1, en especial la forma soluble, o no.
Los mecanismos que subyacen a la angiogénesis inducida por ephrin no se han comprendido plenamente todavía. Hasta ahora, sólo unos pocos vías de señalización, tales como MAP /ERK y PI3K [12], [13], se han encontrado para ser afectado por ephrin-A1. Además, se observó la promoción, así como la inhibición de la misma vía de señalización por ephrin-A1 en diferentes células o tipos de cáncer. Es bien sabido que la eNOS y no jugar un papel crítico en la migración endotelial y la angiogénesis [14]. suficiente evidencia mostró que la eNOS se expresa predominantemente en las células endoteliales vasculares del tumor, y su producción actúa como molécula efectora NO directa en varios factores de la angiogénesis tumoral inducida angiogénico [15], [16]. Por lo tanto, no se sorprende al suponer que la eNOS /NO también puede mediar en la angiogénesis tumoral inducida por ephrin-A1. Desafortunadamente, no hay información directa está disponible en el enlace cruzado entre ephrin-A1 y eNOS durante la modulación de la angiogénesis en las células endoteliales hasta ahora.
El estudio investigó los mecanismos subyacentes ephrin-A1 modulación de la angiogénesis mediante el examen de la efecto de la hipoxia sobre la expresión de ephrin-A1 y la secreción en las células tumorales y la posible asociación de ephrin-A1 con eNOS /NO en el tumor de la angiogénesis. Nuestros datos confirmaron que tanto la expresión ephrin-A1 y la secreción ephrin-A1 soluble en las células tumorales se incrementaron bajo estimulación hipoxia. La angiogénesis inducida por ephrin-A1 fue acompañado con la fosforilación eNOS y la producción de NO, que fue bloqueada por L-NAME. Estudios posteriores mostraron que se requiere la activación de la vía de señalización PI3K /Akt para la diafonía entre ephrin-A1 y eNOS en la promoción de la angiogénesis. Nuestros resultados sugieren que hasta reguladas ephrin-A1 en el tumor microambiente hipóxico puede promover la angiogénesis a través de la vía PI3K /Akt /eNOS.
Materiales y Métodos
Materiales
recombinante humana ephrin -A1-Fc quimera recombinante y Fc de IgG1 humana se compraron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.). Los anticuerpos contra EphA2, eNOS y ephrin-A1 se compraron desde Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU.), Akt y fosfo-eNOS (Ser1177) (P-eNOS
Ser1177) de Señalización Celular Tecnología (Beverly, CA, EE.UU.), fosfo-Akt (Ser473) (P-Akt
Ser473) de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA, EE.UU.).
Cell Cultura y
SCC-9 línea celular, que fue comprado de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), fue proporcionado amablemente por el profesor Zhang Wen-Feng. Las células se cultivaron en DMEM /F12 (Hyclone, UT, EE.UU.) suplementado con 10% FBS (Gibco, Carlsbad, California, EE.UU.). T-251 línea celular GBM se adquirió de Centro de China para Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, China), que se cultivó en MEM (Hyclone, UT, EE.UU.) suplementado con FBS al 10% (Gibco, Carlsbad, California, EE.UU.). HUVECs primarias fueron amablemente proporcionados por el profesor Yi Fang Zhao y el Dr. Hai-Xiao Zou [17] y se cultivaron en medio EC-2 basal (EBM-2; Lonza, Walkersville, MD) suplementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) y con EGM-2 mezcla de factor de crecimiento (Lonza). HUVECs utilizados en este estudio fueron restringidos en el paso 4 al paso 6. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO
2. Nuestros estudios fueron aprobados por los Comités de Ética de la Escuela y el Hospital de Estomatología (Universidad de Wuhan, el número de referencia 055/2011).
Ensayo de Migración Celular
La migración celular se examinó utilizando el ensayo cero herida . Confluentes HUVEC en placas de 24 pocillos se mantuvieron en ayunas durante la noche en un 0,1% de BSA EBM-2 hasta que una herida se hizo mediante el uso de una punta de pipeta de 200 l. Después de aclarar con PBS tres veces para eliminar las células desprendidas y restos celulares, medio libre de factor de crecimiento con ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) solo o junto con L-NAME (100 M) o LY294002 (10 mM) era añadido en cada pocillo. Crecimiento medio libre de factor de con o sin IgG1 Fc recombinante (1 mg /ml) se tomó como control. Imágenes en la misma posición a lo largo de la herida cero se tomaron a las 0 h, 24 h. El porcentaje de cierre de la herida en cada punto temporal se calculó mediante la siguiente fórmula: [1- (área de la herida actual /área de la herida inicial)] x 100
in vitro tubo de ensayo Formación
Sub. HUVECs -confluent se resuspendieron en factores de crecimiento libre de EBM-2 que contiene ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) solo o junto con L-NAME (100 M) o LY294002 (10 mM), y se sembraron en la pre-solidificado BD matrigel (BD Bioscience) en placas de 96 pocillos (3 × 10
4 células /pocillo). Las placas se incubaron a continuación a 37 ° C, 5% de CO
2 de 6 h. Las imágenes fueron tomadas de cada grupo. Todos los puntos de ramificación de las estructuras de tubo en cada pocillo se contaron para cuantificar el grado de formación de tubos. Crecimiento medio libre de factor de con o sin IgG1 Fc recombinante (1 mg /ml) se tomó como control. El porcentaje de formación del tubo se calcula tomando el grupo de control IgG1 Fc recombinante como la formación de tubos 100%. Los experimentos se repitieron al menos tres veces en condiciones similares.
NO Concentración de detección del ensayo
La concentración total de NO en medio de cultivo se detectó mediante la medición de la concentración de nitrato y nitrito por el método de reacción de Griess modificada. Se utilizó total de óxido nítrico Kit de ensayo (Beyotime, China). Las densidades ópticas a 540 nm de longitud de onda se registraron utilizando un lector de microplacas (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y las concentraciones de NO se calcularon de acuerdo con la curva estándar
Ensayo de bloque.
Bloque de ensayo se llevó a cabo para evaluar la función de eNOS en ephrin-A1-inducida HUVECs angiogénesis y efecto ephrin-A1 en la P-eNOS
Ser1177 través de vía PI3K-Akt. se añadió L-NAME (100 M) o LY294002 (50 mM) en el medio de cultivo para bloquear eNOS o PI3K. HUVECs de los grupos de control se cultivaron en el medio libre de factor de crecimiento con o sin IgG1 Fc recombinante (1 mg /ml).
ensayo de inmunofluorescencia
HUVECs creciente en cubreobjetos se incubaron en 2% FBS EBM-2 que contiene 1 mg /ml ephrin-A1-Fc para 0 h, 8 h y 24 h. Los cubreobjetos se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% frío durante 10 min. Tras el tratamiento con 5% BSA-PBS a 37 ° C durante 30 min, las células se incubaron con el anticuerpo primario de conejo contra polyclone eNOS (dilución 1:600) o EphA2 (dilución 1:400) a 4 ° C durante la noche. Después, las células se lavaron con PBS tres veces durante 15 min y se expusieron a Alexa Fluor 488 cabra conjugado con IgG anti-conejo (dilución 1:300) durante 1 hora a 37 ° C. Los núcleos se tiñeron durante 2 minutos en Hoechst (dilución 1:10000) (Sigma, EE.UU.), seguido por tres lavados en PBS durante 15 min. Todos los cubreobjetos fueron cubiertos con toboganes y montados en microscopio de fluorescencia (Leica DM4000B, Alemania) para la detección. Los controles negativos fueron tratados en el mismo procedimiento, pero omitiendo el anticuerpo primario.
Ensayo de proliferación celular
HUVECs en placas de 96 pocillos (1 x 10
3 en 100 l /pocillo) expuesto a ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) durante 0 h, 24 h y 48 h. La tasa de proliferación celular se midió mediante el uso de un Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Tokio, Japón) mediante la adición de WST-8 10 l en cada pocillo a los tiempos indicados. Absorbancia a 450 nm de longitud de onda se registró usando un lector de microplacas (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).
Reacción en Cadena de la Polimerasa
ARN total fue extraído de grupos del ensayo . cDNA fue sintetizado con RevertAid ™ Premium primera cadena de cDNA de síntesis Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, EE.UU.). PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando el kit de Maxima ™ SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas, Glen Burnie, MD, EE.UU.) y espectrofluorimétrico térmica iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Para la eNOS, son secuencias de cebadores 5 'GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3' (hacia delante) y 5'-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3 '(hacia atrás), el tamaño del producto 121 pb. deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato Humano (GAPDH) fue tomada como un control interno. El nivel de expresión de ARNm de cada grupo se calculó mediante la ΔΔCt comparativa.
Hipoxia Experimento
SCC-9 células fueron expuestas a condiciones de hipoxia (1% O
2) o normoxic condiciones ( 21% de O
2) durante 0 h, 6 h, 12 h, 24 hy 48 h. Las células se recogieron y se lisaron en tampón de muestra de SDS para el ensayo de transferencia de Western. Se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron a 3000 xg durante 10 min para eliminar los restos. Una cantidad igual de sobrenadante se cargó para detectar la forma soluble de ephrin-A1 por análisis de transferencia Western [18].
Cell redondeo Ensayo
Los sobrenadantes (24 h) anterior se tomaron como medio acondicionado (CM) y se concentró 6 × celular antes de redondeo experimento utilizando 10 kDa MWCO Amicon Ultra dispositivos de filtro centrífugo (Millipore). las células U-251 GBM fueron tratadas con CM o 1 mg /ml humano ephrin-A1-Fc recombinante. Microscopio invertido se utiliza para observar células redondeo en 15 min, 30 min, y 2 h después del tratamiento.
análisis de transferencia Western
HUVECs en 90% de confluencia se trataron con ephrin-A1-Fc ( 1 mg /ml) en 2% FBS EBM-2 durante los tiempos indicados. La proteína se recogió en tampón de lisis que contenía cóctel inhibidor de proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa (Roche, Alemania). La misma cantidad de proteína (30 mg) se cargó y se separó en 8% SDS-PAGE. Y luego, las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Millipore Co., Billerica, MA, EE.UU.) a 200 mA durante 2 h (100 mA, 1 h para ephrin-A1) a 4 ° C, se bloquearon en TBS que contenía 5% de BSA (w /v) y 0,1% de Tween-20 durante 1 h, y se incubaron con anticuerpos primarios apropiados a 4 ° C durante la noche. La dilución de anticuerpos fue el siguiente: ephrin-A1 (1:500), eNOS (1:600), P-eNOS
Ser1177 (1:1000), Akt (1:1000), P-Akt
Ser473 (1:1000) y β-actina (1:2000). Después de cinco lavados de 5 min, los bloques se incubaron con anticuerpo de rábano picante conjugada con peróxido secundario (dilución 1:10,000) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 1 h a temperatura ambiente. Por fin, las bandas fueron examinados mediante el uso de reactivos de detección ECL plus Western Blot (Beyotime, China). Western blot se repitió al menos tres veces en condiciones similares.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) para comparar la diferencia entre los grupos de prueba.
P
los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativamente diferentes.
Resultados
Efrina A1-Enhanced angiogénesis in vitro
receptor de EphA2 en expresa positivamente en nuestras HUVEC cultivadas (Figura S1A-C). La no pre-agrupado humano recombinante ephrin-A1-Fc se utilizó para determinar los efectos de ephrin-A1 sobre la proliferación, la migración y la formación de tubos en HUVECs. Nuestros resultados mostraron que ephrin-A1-Fc podría aumentar significativamente la migración HUVEC (Figura S2A, B) y la formación de tubos en Matrigel (Figura S3A-D), sin afectar en la proliferación celular (Figura S4). Estos resultados fueron consistentes con los informes anteriores [19], lo que confirma ephrin-A1 modulación de la angiogénesis.
Efrina A1-inducción de la angiogénesis está mediada por la activación de la eNOS y NO
Producción
A pesar de la eNOS /NO tiene sido considerado como un efector vital en la angiogénesis tumoral, los estudios anteriores no han abordado si eNOS /nO mediar la angiogénesis inducida por ephrin-A1. NO ensayo de detección mostró un aumento espectacular de la producción de NO en el sobrenadante de HUVECs cultivadas después de la incubación con 1 mg /ml ephrin-A1-Fc durante 24 h (Figura 1). Hubo una diferencia estadística significativa en la producción de NO entre el grupo de control (10,4 ± 3,4 M) y el grupo ephrin-A1-Fc-estimulación (42,1 ± 4,1 M). Cuando la producción de NO se inhibió con L-NAME (100 mM), la velocidad de cierre de la herida se suprimió drásticamente (Figura 2A) (Figura S2A, B), y menos intacta se observaron estructuras de tubo y puntos de ramificación en HUVECs estimuladas con ephrin-A1 (figura 2B) (Figura S3A-D), que muestra una disminución significativa en la migración celular y la formación del tubo (Figura 2C, 2D). Estos resultados sugieren que la eNOS /NO puede jugar un papel clave en el proceso angiogénico inducido por ephrin-A1.
Los datos mostraron un aumento significativo en la producción de NO en el grupo EA1-Fc. (*,
P Hotel & lt; 0,05, n = 3) guía empresas
A:. Ensayo de migración celular mostró que la L-NAME y LY294002 inhibieron la migración estimulada por ephrin-A1 de HUVECs ( 200 ×). B: ensayo de formación de tubo mostró que la L-NAME y LY294002 inhibieron la formación de tubos estimulada por ephrin-A1 de HUVECs (200 ×). Las puntas de flecha presentaron la HUVEC que se extendía insuficientemente. C: La cuantificación de A. D: La cuantificación de B. (*,
P Hotel & lt; 0,05, n = 3) guía empresas
Para un estudio adicional, eNOS expresión y fosforilación estado fuera. examinado en ephrin-A1-estimulado HUVEC. Como se muestra en la Figura 3A, 3B, 3C, no hay eNOS significativos los cambios de expresión se detectaron por inmunofluorescencia, PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western. Sin embargo, la estimulación ephrin-A1-Fc produjo un aumento dependiente del tiempo en la fosforilación rápida eNOS en el sitio de Ser1177 (Figura 3D) (Figura S5). P-eNOS
Ser1177 comenzó a elevar significativamente en aproximadamente 10 min y llegó al efecto máximo en 30 min y disminuyó después (Figura 3E). Estos datos sugirieron que la P-eNOS
activación Ser1177 pero no aumenta la expresión de la eNOS es el principal responsable de la elevada producción de NO en la angiogénesis inducida por ephrin-A1.
La inmunofluorescencia (A), PCR en tiempo real ( B) y análisis de transferencia Western (C) demostraron que ephrin-A1-Fc no tuvo ningún efecto sobre la expresión de eNOS de HUVECs (#,
P
& gt; 0,05, n = 3). D: transferencias de Western que demuestran que la P-eNOS
Ser1177 y P-Akt
Ser473 fueron reguladas bajo la estimulación ephrin-A1-Fc de una manera dependiente del tiempo. E: Cantidad de análisis de P-eNOS
Ser1177. F: Cantidad de análisis de P-Akt
Ser473. (*,
P Hotel & lt; 0,05, n = 4).
PI3K /Akt se requiere para inducida por ephrin-A1 P-eNOS
Ser1177 en HUVECs
como se muestra en la figura 3D, 3F, ephrin-A1 dependiente de P-eNOS
Ser1177 también fue acompañado por una fosforilación rápida similar y la activación de Akt
Ser473, lo que sugiere Akt puede actuar como un importante modulador de aguas arriba que contribuye a P-eNOS
Ser1177 en este proceso. Mientras PI3K se ha tomado como un controlador directo de Akt [20] - [22], LY294002 (50 M) se aplicó en nuestro estudio para confirmar su efecto sobre la fosforilación de Akt y eNOS. Nuestros resultados mostraron que no sólo P-Akt
Ser473 pero también P-eNOS
Ser1177 fue atenuada por el tratamiento con LY294002 (Figura 4A-C) (Figura S6), el descubrimiento de que PI3K es fundamental para la fosforilación de Akt por ephrin- A1 y, a su vez fosforila la eNOS en el sitio Ser1177. Además, con el fin de determinar si la activación de PI3K /Akt estaba involucrado en funciones celulares inducidas-A1 ephrin, LY294002 se añadió al medio de cultivo y sus efectos en ECs se evaluaron mediante el ensayo cero herida y ensayo de formación de tubo. Como se muestra en la Figura 2A, 2B, después de la exposición a LY294002, la tasa de cierre de la herida se redujo significativamente en comparación con el grupo EA1-Fc (Figura 2C); HUVEC en Matrigel se extendía insuficientemente, se registraron menos puntos de ramificación y no se observó un menor número de estructuras de tubos intactos en el grupo EA1-Fc + LY294002 (Fig. 2D). Estos resultados sugirieron que la fosforilación de Akt juega un papel crítico en HUVECs inducidas ephrin-A1 funciones angiogénicas. Tomados en conjunto, podríamos llegar a una conclusión que ephrin-A1 induce la activación de la eNOS a través de la vía de señalización PI3K /Akt-dependiente en sus funciones pro-angiogénicos
A:. Transferencias de Western representativos para P-eNOS
Ser1177 y P-Akt
Ser473 de HUVECs que se mueren de inanición en 0,1% de BSA EBM-2 durante la noche y se estimularon con ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) durante 30 min solo o junto tratados previamente con LY294002. B: Análisis Cantidad de P-Akt
Ser473. C: Cantidad de análisis P-eNOS
Ser1177. (*,
P Hotel & lt; 0,05, n = 4) (#,
P Hotel & gt; 0,05, n = 4)
Hipoxia Hasta regulado. Expresión ephrin-A1 y soluble ephrin-A1 secreción en las células cancerosas Las células cancerosas
se cultivaron bajo condiciones de hipoxia y normoxia. Las células y los sobrenadantes se recogieron para el análisis ephrin-A1 por Western blot. En comparación con las células cultivadas en normoxia, SCC-9 células expuestas a hipoxia se detectaron un marcado incremento en la expresión de ephrin-A1 de una manera dependiente del tiempo, con el efecto máximo aparece a las 24 h (Figura 5A) (Figura S7a, B). Más importante aún, la proteína ephrin-A1 también se detectó positivamente y aumentó significativamente en los sobrenadantes de los grupos de hipoxia, el nivel de la cual fue mucho mayor en comparación con los grupos de normoxia (Figura 5B) (Figura S7C, D), lo que sugiere que las células cancerosas pueden también secretan forma soluble de ephrin-A1 en el microambiente hipóxico del tumor. Curiosamente, como se muestra en la Figura 5A, tanto grupo normoxia e hipoxia tenía tendencia expresión ephrin-A1 similar en SCC-9 células. El ephrin-A1 comenzó a aumentar en aproximadamente 6 horas, llegó a su punto máximo en 12 ha 24 h y luego se redujo más tarde. Un posible mecanismo de retroalimentación negativa podría haber estado involucrado en este proceso especial. endocitosis receptor Efrina inducida se ha estudiado en una serie de sistemas biológicos. Tras la interacción del ligando ephrin-A1 y el receptor de EphA2, los complejos ligando-receptor pueden internalizarse bi-direccionalmente en células tumorales [23], [24]. Esta internalización complejos ligando-receptor puede promover actuar como una motivación de retroalimentación negativa en el control de la expresión de ephrin-A1. Por lo tanto, es posible que el aumento de la activación de EphA2 por tanto unida a la membrana y soluble ephrin-A1 en las células SCC-9 había dado como resultado la baja regulación de ephrin-A1. En cuanto a la razón por la ephrin-A1 se incrementa dramáticamente entre los puntos de tiempo de 6 h y 12 h, incluso en el grupo de normoxia, todavía necesita más investigación
A:. Transferencias de Western que demuestran que la membrana elevada hipoxia unido expresión ephrin-A1 SCC-9 en las células. B: transferencias de Western que demuestra que la hipoxia hasta reguladas solubles ephrin-A1 en sobrenadantes de células SCC-9. SCC-9 densidad celular a 70-80% de confluencia se tomó como 0 h cuando se añadió medio de cultivo fresco. C: Cell redondeo ensayo que demuestra que soluble ephrin-A1 en CM podría activar EphA2 en las células U-251 GBM. Efrina-A1 (S), soluble ephrin-A1; N, normoxia condicionada grupo medio; H, hipoxia condicionada grupo medio.
redondeo celular es una respuesta característica funcional de ephrin-A1 [18], [25]. Las células U-251 con GBM de forma natural sobreexpresan EphA2 y tienen muy bajo nivel de ephrin-A1 [26]. Se investigó la capacidad de los solubles ephrin-A1 en la CM para inducir redondeo celular de las células U-251 GBM. Como se muestra en la Figura 5C (Figura S8), el tratamiento de las células U-251 GBM, ya sea con CM o ephrin-A1-Fc dio como resultado un cambio drástico en la morfología celular, reflejando por células redondeo tan pronto como 15 min, llegando al efecto peek en 30 min y la disminución de 2 h después del tratamiento CM y ephrin-A1-Fc. Aunque no se observaron cambios morfológicos de las células U-251 bajo la estimulación CM, experimentos funcionales adicionales son todavía necesarios para demostrar si solubles ephrin-A1 puede inducir la fosforilación de EphA2 o incluso la angiogénesis tumoral.
La cascada de señalización inducida por hipoxia involucrado en angiogénesis inducida por ephrin-A1 se caracteriza de forma esquemática en la Figura 6.
Discusión
El estudio reveló un mecanismo por el que ephrin-A1 modula la angiogénesis y un factor determinante para ephrin-A1 hasta -regulación. la angiogénesis inducida por ephrin-A1 implica un aumento de la producción de NO que es posterior a una PI3K /Akt activación dependiente de P-eNOS
Ser1177 en las células endoteliales. La hipoxia puede inducir activamente la mejora de tanto unida a membrana y soluble ephrin-A1 en las células tumorales. Estos resultados proporcionan la primera evidencia de que la PI3K /Akt /eNOS cascada de señalización puede representar una vía común para la angiogénesis ephrin-A1-dependiente inducible por hipoxia en el desarrollo vascular y la progresión tumoral.
La acumulación de pruebas confirma que la angiogénesis eficaz requiere bioactivo NO sintetizado por la eNOS, que se expresa predominantemente en las células endoteliales vasculares. Se ha informado de que el NO es un mediador crítico de la angiogénesis inducida por VEGF que puede ser bloqueado por L-NAME [27]. Del mismo modo, las estatinas pueden regular por incremento la expresión de eNOS, y promover la angiogénesis dependiente de NO mediante la reducción de la caveolina-1 abundancia [28]. Por primera vez, se encontró que la producción de NO es también esencial para la angiogénesis en respuesta a la pro-angiogénicos molécula de ephrin-A1. la migración celular inducida por ephrin-A1-Fc y montaje capilar se atenuaron cuando ECs fueron tratados con L-NAME. Curiosamente, nuestro estudio mostró además que la elevación de la síntesis de NO inducida en ECS-ephrin-A1 se atribuyó principalmente a la fosforilación de la eNOS en el residuo Ser1177 pero no aumento de la expresión de eNOS. Es bien conocido que la fosforilación es uno de los mecanismos de regulación post-transición más importantes eNOS subyacentes activación [20], [29]. Como evidencia de apoyo de nuestro hallazgo, también se observan muchos tipos de estímulos que promueven la activación de la eNOS para causar la fosforilación en diferentes sitios, como Thr495, Ser633 y Ser1177 [30]. Nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de que ephrin-A1 tiene una diafonía coordinada con eNOS /NO en la promoción de la angiogénesis.
Aunque no se encontró la correlación de aumento de la actividad eNOS con la angiogénesis estimulada por ephrin-A1 en este estudio, la vía de señalización implicada en la mejora inducida por ephrin-A1 de la actividad de la eNOS todavía necesita más investigación. Se ha informado de que la cizalladura inducida por el estrés la producción de NO parece estar controlada por la fosforilación de Akt dependiente de eNOS en cultivos de ECS [31]. Además, Akt proteína quinasa se ha demostrado que funcionan como un factor de supervivencia CE y promover la formación de tubos in vitro [32]. Los estudios previos también han sugerido que vía PI3K /Akt mediar la angiogénesis inducida por varios estímulos angiogénicos tales como VEGF [33], forskolina [34], la microgravedad [35], y así sucesivamente. Para investigar la implicación funcional de la vía PI3K /Akt en ephrin-A1-eNOS diafonía, el efecto de la LY294002 en eventos de señalización inducidos por ephrin-A1 fue determinada. Después de la estimulación con ephrin-A1-Fc durante 30 min, la fosforilación de Akt y eNOS tanto fue significativamente elevado. Este aumento se debía a la fosforilación de Akt
Ser473 y eNOS
Ser1177, como se demuestra por Western blot. La exposición a LY294002 impidió la expresión inducida por ephrin-A1 de P-Akt
Ser473 y P-eNOS
Ser1177 parecer, lo que indica que la vía de señalización dependiente de PI3K /Akt participó en el control de la activación mediada por ephrin-A1 de la eNOS.
la hipoxia es una de las características más importantes de microambiente tumoral, y modula variedades de factores angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [36]. Efrina-A1 también se conoce como un factor angiogénico, y juega un papel fundamental en la neovascularización en varios tipos de cáncer [4]. Estudios previos han encontrado que el gen ephrin-A1 puede ser inducida por factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) en las células endoteliales [37]. Recientemente, Uemura et al. identificado ephrin-A1 como un candidato posible gen inducible por hipoxia por el análisis de microarrays de muestras de tejido de cáncer colorrectal metastásico [38]. Además, la expresión de ephrin-A1 y genes relacionados se redujeron marcadamente en caída HIF-2α (kd /kd) las células endoteliales, lo que implica el papel de la hipoxia en la regulación ephrin-A1 [39]. En este estudio, hemos proporcionado evidencia directa de que la exposición a la hipoxia como resultado la expresión ephrin-A1 elevada en las células cancerosas por Western blot. Efrina-A1 se identificó por primera vez como una proteína anclada a GPI que requiere unión a la membrana o la agrupación /oligomerización para su activación de EphA2 [40]. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la regulación de membrana ephrin-A1 inducida por hipoxia puede promover la angiogénesis a través de tumor interacción con su receptor de EphA2 en las células endoteliales en microambiente tumoral. Además, hemos documentado en este estudio que la hipoxia regulado hasta una forma soluble de ephrin-A1 liberación de las células cancerosas en el entorno extracelular. De acuerdo con nuestro hallazgo, ephrin-A1 también se ha detectado en el suero de pacientes con carcinoma de hígado [41]. Recientemente, varios estudios han demostrado que soluble monomérica ephrin-A1 es un ligando funcional para EphA2, y que soluble ephrin-A1 liberado de las células HeLa y SK-BR3 es necesario para el crecimiento celular y la transformación [4]. Similar a estos estudios, se observó cambios morfológicos de las células U-251 bajo estimulación CM. Sin embargo, se necesitan más estudios para confirmar si la hipoxia inducida solubles ephrin-A1 puede interactuar funcionalmente con EphA2 para iniciar la angiogénesis.
En resumen, los hallazgos más importantes y novedosas que se presentan en este estudio incluyen que: 1) ephrin -A1 coopera con eNOS en la promoción de la angiogénesis en HUVECs; que 2) la diafonía entre ephrin-A1 y eNOS está mediada por vía /Akt dependiente de PI3K; y que 3) la hipoxia hasta regula tanto la proteína ephrin-A1 unido a la membrana y secretada en las células cancerosas. Ya que sólo unos pocos estudios se han centrado en los eventos moleculares posteriores desencadenados-ephrin-A1, los resultados presentados aquí identifican /Akt dependiente de la eNOS
fosforilación PI3K Ser1177 como un nuevo mecanismo que subyace ephrin-A1modulation de la angiogénesis (Figura 6).
Apoyo a la Información
Figura S1.
expresión del receptor de EphA2 en las HUVECs cultivadas. Inmunofluorescencia (A), RT-PCR (B) y análisis de transferencia Western (C) demostró la expresión de EphA2 positivo en HUVECs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s001
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Figura S2 .
ensayo de migración celular mostró que la L-NAME y LY294002 inhibieron la migración estimulada por ephrin-A1 de HUVECs (200 ×). migración de células endoteliales se midió en HUVECs que se habían muerto de hambre en crecimiento libre de factor de 0,1% de BSA EBM-2 durante la noche y se trató con ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) durante 24 h
doi:. 10.1371 /revista. pone.0074464.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
ensayo de formación de tubo mostró que la L-NAME y LY294002 inhibieron la formación de tubos estimulada por ephrin-A1 de HUVECs. A, B, C: Imágenes representativas de 40 ×. D:. Las imágenes representativas a 200 ×
doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s003 gratis (TIF)
figura S4. la proliferación celular endotelial
se midió en HUVECs tratadas con ephrin-A1-Fc (1 mg /ml) durante 0 h, 24 h y 48 h. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el grupo EA1-Fc y de control. EA1-Fc, ephrin-A1-Fc. (#,
P Hotel & gt; 0,05, n = 3)
doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s004 gratis (TIF)
Figura S5..
Efecto de ephrin-A1-Fc sobre la fosforilación de Akt y eNOS en HUVECs. A, B, C: transferencias de Western que demuestra que P-eNOS
Ser1177 y P-Akt
Ser473 fueron reguladas bajo la estimulación ephrin-A1-Fc de una manera dependiente del tiempo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s005 gratis (TIF)
Figura S6.