Extracto
Existe una significativa necesidad de identificar nuevas dianas farmacológicas cáncer de próstata porque las terapias hormonales actuales terminan por fallar, lo que lleva a una enfermedad resistente a los medicamentos y fatal denominado cáncer de próstata resistente a la castración. Para identificar los genes funcionalmente que, cuando se silencia, disminuyen la proliferación de células de cáncer de próstata o inducen la muerte celular en combinación con antiandrógenos, se empleó una pantalla de código de barras de horquilla corta de ARN basado en la interferencia de ARN en células de cáncer de próstata humano LNCaP. Se identificaron y validaron cuatro genes candidatos (
AKT1
,
PSMC1
,
STRADA
, y
TTK
) que el crecimiento alterada cuando silenciado en los receptores de andrógenos positivo las células de cáncer de próstata y el aumento de los efectos antiproliferativos de los antiandrógenos. La inhibición de AKT con un inhibidor farmacológico también indujo apoptosis cuando se combina con antiandrógenos, consistente con la evidencia reciente para PI3K y AR diafonía vía en células de cáncer de próstata. La recuperación de las horquillas dirigidas a una vía de cáncer de próstata conocido valida la utilidad del shRNA biblioteca de detección de cáncer de próstata como una estrategia amplia para identificar nuevos objetivos farmacológicos candidato
Visto:. Dahlman KB, Parker JS, Shamu T, Hieronymus H, Chapinski C, Carver B, et al. (2012) Los moduladores de la proliferación de células de cáncer de próstata y viabilidad identificados con el escrutinio de corto horquilla ARN Biblioteca. PLoS ONE 7 (4): e34414. doi: 10.1371 /journal.pone.0034414
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2011; Aceptado: 27 Febrero 2012; Publicado: 11 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Dahlman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la AACR-Amgen, Inc. Fellowship en Investigación clínica y traslacional (KBD); Prostate Cancer Foundation (www.pcf.org) (BSC); Instituto Médico Howard Hughes (www.hhmi.org) (CLS); Instituto Nacional del Cáncer (www.cancer.gov) (CLS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. CLS es un co-inventor de MDV3100 y posee acciones de Medivation. KBD fue apoyada por AACR-Amgen, Inc., mientras se llevaba a cabo este trabajo. JSP es empleado de Análisis de Expresión. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. El resto de autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses con un estimado de 217.730 nuevos casos y más de 32.000 muertes por la enfermedad en 2010 [1]. Mientras que la mayor enfermedad localizada en etapa temprana puede ser tratada exitosamente con radioterapia y /o cirugía, los hombres que se presentan con cáncer metastásico de la última etapa tienen una supervivencia media de 3-7 años [2]. Además, hasta el 50% de los pacientes tratados con enfermedad localizada tendrá recurrencia local o metástasis a distancia [2].
Los tratamientos actuales para la enfermedad recurrente o metastásica incluyen dirigido a un receptor de andrógenos (AR) de señalización a través del uso de antiandrógenos , tales como bicalutamida, y los fármacos que impiden la producción de andrógenos en los testículos y glándulas suprarrenales, tales como agonistas de la hormona liberadora de gonadotropina y ketoconazol [3]. Aunque estas terapias hormonales actuales tienen efectos iniciales en la reducción de la carga tumoral, muchos hombres se vuelven resistentes a estas terapias y desarrollar el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Los hombres con CPRC tienen un mal pronóstico y dar cuenta de la mayoría de las muertes por esta enfermedad.
Los hombres con CPRC menudo exhiben un aumento de los receptores de andrógenos de tumores (AR) niveles [4]. AR es una kDa receptor de la hormona nuclear 110 que, en respuesta a los andrógenos, activa la transcripción de genes diana implicados en la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia. En el epitelio luminal de la próstata, AR regula la diferenciación y la proliferación, y AR en células de cáncer de próstata promueve la progresión del ciclo celular [5]. El trabajo previo en nuestro laboratorio muestra que este aumento de nivel de AR es necesaria y suficiente para la progresión del cáncer de próstata para CRPC y su función es esencial para mantener el crecimiento del tumor [6]. Además de CRPC,
AR
se expresa en casi todos los tumores de próstata y es necesario para el mantenimiento del tumor [4], [7], [8]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la señalización AR desempeña un papel crítico en la hormona sensible y CRPC y sigue siendo un objetivo importante para la terapéutica del cáncer de próstata.
Identificación de nuevos enfoques para tratar el cáncer de próstata es un área de desarrollo terapéutico intensa . Recientemente se aprobó acetato de abiraterona basado en un beneficio significativo en la supervivencia en pacientes con CRPC, y los nuevos antiandrógenos, MDV3100 y ARN-509, se han introducido con resultados prometedores; Sin embargo la mayoría de los tumores adquirido resistencia a estos agentes terapéuticos [9] - [13]. Hasta la fecha entre los agentes quimioterapéuticos sólo el docetaxel y taxanos cabazitaxel se ha demostrado que mejora la supervivencia global en pacientes con CRPC [14] - [16]. Como resultado de la falta de agentes que mantienen la regresión del cáncer de próstata, nuevas dianas terapéuticas del cáncer de próstata merecen una investigación adicional.
Para descubrir posibles dianas terapéuticas del cáncer de próstata, se realizó una pantalla imparcial shRNA multiplex que identificado moduladores de cáncer de próstata la viabilidad celular en presencia de bicalutamida. Cuatro genes fueron validados para amplificar los efectos antiproliferativos de antiandrógenos en una línea celular de cáncer de próstata cuando silenciada. Estos datos proporcionan una estrategia general para identificar dianas terapéuticas del cáncer de próstata.
Resultados
pantalla múltiplex shRNA para identificar moduladores de la sensibilidad bicalutamida
Con el fin de identificar los genes que, cuando se silenció , reducir la viabilidad celular por sí solo o en combinación con el antiandrógeno, bicalutamida, hemos utilizado una pantalla shRNA basado en la interferencia de ARN multiplex usando una biblioteca previamente validado (Figura 1A). Esta tecnología emplea de forma única con código de barras shRNAs, expresada a partir de un vector retroviral, cuya abundancia después de la manipulación de células se pueden identificar por microarray [17]. La biblioteca se compone de ~6,000 shRNAs dirigidos quinasas, genes implicados en la regulación del ciclo celular, y otros genes conocidos por estar involucrados en el cáncer [17]. Análisis de los datos de expresión de 147 muestras de tumor de próstata [18] mostró que el 97% de los genes dirigidos por shRNAs en la biblioteca se detectan en al menos 50% de los tumores. Hemos utilizado la línea celular LNCaP -positivo receptor de andrógenos (AR) para la pantalla porque se someten a la detención del crecimiento cuando son tratados con el antagonista de AR bicalutamida, crecer de forma relativamente rápida, y son fácilmente infectados con retrovirus (Figura S1). células de cáncer de AR-negativo PC3 de próstata humano sirvió como un control negativo de sensibilidad antiandrógeno (Figura S1). Correlación entre replicar los experimentos biológicos en cada línea celular fue alta y no cambió en momentos posteriores o con el tratamiento con bicalutamida (Tabla S1).
(A) Esquema de la pantalla shRNA. Los detalles se pueden encontrar en la sección Materiales y Métodos. (B) Un mapa de calor generado por el agrupamiento basado en sondas que se agotaron o enriquecido (log2 bicalutamida /vehículo ≤ +/- 0,58 y un p-value≤0.01) en la bicalutamida (0,4 uM y 1,0 uM) tratados con células LNCaP en T = 1 y T = 2 en comparación con las células tratadas con vehículo en los mismos puntos de tiempo. El gen diana shRNA asociado con cada sonda se indica a la derecha de la carta térmica. Los genes diana que aparecen más de una vez en el mapa de calor indican que más de una sonda anotó para ese gen.
análisis de microarrays reveló que 23 sondas, asociados con los 15 genes, se agotaron única en tratados con bicalutamida células LNCaP, en comparación con las células tratadas con vehículo (log2 bicalutamida /vehículo-≤ 0.58, p≤0.01) (Figura 1B, Tabla 1 y Figura S2). No se observaron diferencias en las sondas reducida a lo largo de bicalutamida dosis altas y bajas o principios y finales de los puntos de tiempo (día 8 o 21 días); Por lo tanto, los datos se combinaron para el análisis. De los 15 genes identificados, 11 eran quinasas (
TTK
,
MAST3
,
CIT
,
PRKACG
,
IGF1R
,
TSSK2
,
VEGFβ
,
MAPKAPK5
,
ABL2
,
PLK2
, y
AKT1
) conocida tener funciones en la regulación del ciclo celular o la viabilidad celular (Tabla 1). Esta alta frecuencia de recuperación de los accesos de la quinasa puede ser relevante para la biología de las células de cáncer de próstata, pero también probablemente refleja un sesgo en la selección de genes para la biblioteca shRNA. Los restantes 4 hits de genes tienen funciones diferentes: unión a calmodulina (
STRN3
), la activación GTPasa (
RABGAP1
), adaptadores de quinasas (
STRADA
), o involucrado con el proteasoma (
PSMC1
). Una pantalla paralelo también se realizó en la línea celular independiente de los andrógenos, PC3, y, en particular, ninguna de las sondas empobrecido en células LNCaP se agotaron en las células PC3 en presencia de bicalutamida utilizando el mismo corte, proporcionando evidencia de la especificidad en las células sensibles antiandrógenos (Tabla S2).
Validación de los genes candidatos
Para examinar más a fondo estos 15 genes candidatos, se empleó la tecnología desmontables independientes (siRNA transfección utilizando siRNAs dirigidos a secuencias distintas de las utilizado en la pantalla shRNA) en una segunda línea de células dependientes de AR (VCAP), que se ha demostrado que es resistente a la bicalutamida pero sensible a la segunda generación antiandrógeno MDV3100 [19]. El silenciamiento de los genes fue confirmada por qRT-PCR (Figura 2B). Como control positivo, las células fueron transfectadas con VCAP AR siRNAs y, como se esperaba, el silenciamiento de AR reduce la viabilidad celular (Figura 2A). El silenciamiento de
AKT1
,
STRADA
,
PSMC1
, y el panel de
TTK
aumentó el efecto inhibidor del crecimiento de células en el MDV3100 VCAP (Figura 2A, izquierda ), consistente con los efectos observados con bicalutamida en la pantalla original en las células LNCaP. Curiosamente, silenciando
AKT1
y
PSMC1 Hoteles en células VCAP también disminuyó la viabilidad celular en ausencia de antiandrógeno (Figura 2A, panel izquierdo).
Candidato genes diana de pantalla LNCaP sondas que se agotaron en presencia de bicalutamida se dirigen selectivamente usando siRNAs. (A, panel izquierdo), las células fueron transfectadas con VCAP siRNAs que anotó en la detección de drogas en LNCaP y se incubaron con 1 uM MDV3100 o vehículo, y el número de células viables se midió 6 días después del tratamiento. (A, panel derecho), se transfectaron células VCAP y se trataron como en (A, panel izquierdo), excepto la caspasa 3/7 actividad se midió después de 3 días de tratamiento.
Plk1
transfección siRNA se utilizó como control positivo. Las líneas discontinuas indican el nivel de inhibición del crecimiento o la apoptosis inducida por MDV3100, para la comparación. NT, no director siRNA. (B) El silenciamiento génico (10-50%) se confirmó mediante RT-qPCR 6 días después de la transfección de las células VCAP con el siRNA SmartPools. Las reacciones se realizaron por triplicado y se normalizó para RPL27 para cada ADNc y luego normalizada a tratado con vehículo NT. Se calculó el error estándar de la media. Bic, bicalutamida.
A continuación, examinamos el efecto de silenciar
AKT1
,
STRADA
,
PSMC1
, y
TTK
sobre la apoptosis, utilizando
Plk1
siRNAs como un control positivo. El silenciamiento de
AR
,
AKT
, y
STRADA Hoteles en combinación con el tratamiento MDV3100 inducida por apoptosis de las células VCAP sobre el control de siRNAs (NT) tratados con MDV3100 (Figura 2A, panel derecho ). Con la excepción de AR, ninguno de los siRNAs ensayados indujo apoptosis en ausencia de MDV3100 (Figura 2A, panel derecho). A pesar de que el silenciamiento de
TTK Hoteles en combinación con MDV3100 no indujo apoptosis en las celdas de NT con MDV3100, la combinación redujo el número de células viables más que MDV3100 solo en las células NT (Figura 2A, panel izquierdo). Tomados en conjunto,
AKT
,
STRADA
, y
TTK
siRNAs sinergia con MDV3100 para reducir la viabilidad celular VCAP. Mientras que
AKT1
y
STRADA
silenciamiento reduce la viabilidad celular, al menos en parte, debido al aumento de la apoptosis cuando se combina con el MDV3100,
TTK
parece que funciona a través de un mecanismo inhibitorio de crecimiento alternativo . Aunque
PSMC1
no anotó en las células PC3 en la pantalla inicial shRNA biblioteca, siRNA desmontables de
PSMC1
deteriorado viabilidad de las células PC3, aumentando la posibilidad de que estos efectos antiproliferativos pueden no ser específicas para las células del cáncer de próstata AR-positivo (Figura S3). Por esta razón, no continuamos con la caracterización adicional de
PSMC1
.
La sobreexpresión de
TTK
se asocia con una mayor probabilidad de recurrencia bioquímica
Para explorar si
AKT1
,
STRADA
, y
TTK ¿Cuáles son alterados en el cáncer de próstata humano, se evaluó el número de copias y la expresión estado de estos genes en una próstata humana previamente informado cáncer de conjunto de datos [18]. De los 218 tumores de próstata, el 34,4% había una expresión reducida de
STRADA
, el 18,3% mostraron sobreexpresión de
TTK
, 11,7% ya sea sobreexpresada o habían expresión reducida de
AKT1
, y el 15,6% de los tumores sobreexpresan o se había amplificado
AR gratis (Tabla 2). La sobreexpresión se define como z-score≥2 y la reducción de expresión se define como z-score & lt; 2, en comparación con la expresión en muestras normales de la próstata. A diferencia de
AR
,
STRADA
,
TTK
, y
AKT1
mostró poca evidencia de la amplificación de genes o pérdida en los tumores de próstata humanos. El gran número de tumores de próstata con alteraciones en
STRADA
,
TTK
, y
AKT1
expresión nos llevó a mirar a su correlación con la recurrencia bioquímica. Curiosamente, la sobreexpresión de
TTK
mostró una asociación significativa con la recurrencia bioquímica (p = 0,003) (Figura 3). TTK expresión no se correlacionó significativamente con las siguientes características clínicas:. margen quirúrgico, los ganglios linfáticos, vesícula seminal, la puntuación de Gleason, antígeno específico de tratamiento de la próstata (PSA), con una media de PSA, o la extensión extracapsular (Tabla S3)
gráfico de Kaplan Meier del riesgo de recurrencia bioquímica en los pacientes (n = 131) con tumores de próstata sobreexpresan TTK (n = 20; línea verde) frente a los que no sobreexpresan TTK (n = 111; línea azul) tumores (p = 0,003, log rank test).
bloqueo AKT coopera con bicalutamida para inducir la apoptosis de las células LNCaP
para investigar más a fondo el papel potencial de estos genes como dianas terapéuticas en el cáncer de próstata, giramos a los inhibidores farmacológicos. Se evaluó el número de células LNCaP viables utilizando un inhibidor de AKT1 /2, en presencia y ausencia de la bicalutamida. El tratamiento con bicalutamida o el inhibidor de AKT redujo el número de células viables por 10% y 45%, respectivamente (Figura 4A). En contraste, la combinación de los compuestos reduce la proliferación de células en un 100% y se indujo la apoptosis como se muestra por un aumento de PARP de escisión (Figura 4B). Estos datos sugieren que AKT puede ser una diana terapéutica para el cáncer de próstata en combinación con la terapia antiandrógeno, consistente con la evidencia reciente utilizando inhibidores de PI3K [20].
(a) Número de células LNCaP viables tratadas más de 5 días con vehículo , bicalutamida (1 uM), Akt1 /2 inhibidor (1 uM), o una combinación de bicalutamida y el inhibidor de AKT. (B) La apoptosis se midió en células LNCaP por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo PARP en las células LNCaP tratadas como en (A). La inhibición de Akt fosforilada (pAkt (Ser473)) y fosforilado S6 (PS6) también se midió. Actina se utilizó como control de carga.
Discusión
Las terapias actuales para el cáncer de próstata incluyen antiandrógenos tales como bicalutamida y MDV3100. A pesar de que casi todos los pacientes tienen respuestas iniciales a estos fármacos, muchos tumores se vuelven resistentes a estas terapias, lo que resulta en CRPC. Debido al papel importante que desempeña AR en el cáncer de próstata primario y CRPC, AR sigue siendo un objetivo terapéutico relevante. Identificación de nuevos enfoques para el tratamiento del cáncer de próstata, incluyendo el desarrollo de terapias de combinación con antiandrógenos, es un área de desarrollo terapéutico. Por lo tanto, hemos ejecutado una pantalla imparcial shRNA múltiplex para identificar moduladores de la viabilidad de las células del cáncer de próstata. Nuestro objetivo fue identificar los genes que podrían ser aprovechadas para la novela terapia dirigida.
En la pantalla de shRNA y
in vitro
siRNA experimentos de validación en una línea celular independiente, se identificaron y validaron
AKT1
,
STRADA
, y
TTK
como genes candidatos que actúan en sinergia con antiandrógenos (Figura 1 y Figura 2). Aunque
AKT1
,
STRADA
, y
TTK
anotó como inhibidores de la proliferación de células LNCaP en el contexto de la bicalutamida, validación con siRNAs en la misma línea celular reveló que puedan disminuir la viabilidad celular en ausencia de la bicalutamida (Figura S4A). Este efecto era específico para LNCaP y no se observó en las células PC3 AR-negativo. Una explicación para esta diferencia en el fenotipo es la fuerza de shRNA caída en la pantalla en comparación con el ARNsi en los experimentos de validación, ya que generalmente siRNAs lograr una mayor caída de la shRNAs a una MOI≤0.5. De hecho, los siRNAs exhibieron un alto nivel de silenciamiento de genes en los experimentos de validación (Figura S4B).
Será de interés para comprender el mecanismo por el que la inhibición de
AKT1
,
STRADA
o
TTK
aumenta la actividad antiandrógeno. Una posibilidad es a través de la regulación de la transcripción AR-dependiente, pero que no ha observado una disminución en los niveles de mRNA de
AR
o genes (AR-destino
TMPRSS2
,
FKBP5
,
Nkx3.1
, o
KLK3
) cuando estos genes fueron silenciadas en las células LNCaP (datos no mostrados). Otra posibilidad es la interrupción de la señalización crosstalk vía, como se ilustra por la evidencia reciente para la regeneración negativa recíproca como una explicación de la sinergia observada con la inhibición de la vía PI3K /AR combinado [20].
TTK, también conocido como husillo monopolar 1 (Mps1), es una quinasa de serina /treonina y tirosina que se ha implicado en el mantenimiento del puesto de control conjunto de husillo y es necesario para la segregación de cromosomas durante la mitosis apropiado [21], [22]. TTK es de particular interés ya que otros han informado de que la reducción de los niveles de
TTK
células tumorales humanas sensibilizadas a dosis subletales de taxol, mientras que las células nontumorigenic no pudieron ser sensibilizados con el taxol [23]. Aquí nos encontramos con que el silenciamiento de que
TTK
dio lugar a la sensibilización de las células VCAP a un potente antiandrógeno. El hecho de que 18% de los tumores de próstata humanos sobreexpresan TTK y que estos tumores tienen un resultado clínico diferente sugiere que los inhibidores TTK en combinación con antiandrógenos pueden ser de interés.
Relacionado con STE20-adaptador quinasa alfa, o Strada, es un pseudoquinasa que se informa que se requiere para la actividad propia del supresor de tumores, hígado quinasa B1 (LKB1) [24].
se requiere para la función del supresor tumoral LKB1 STRADA
; por lo tanto, el silenciamiento de
STRADA
se podría esperar que la promoción de tumorigénesis. Nuestro hallazgo de que
STRADA
exhibido reducción de la expresión en un gran porcentaje de cánceres de próstata humanos es consistente con un papel supresor de tumor (Tabla 2). Sin embargo, es posible que STRADA tiene funciones independientes de la señalización de LKB1 /AMPK que promueven la inhibición del crecimiento en ciertos contextos celulares. El papel potencial de STRADA en la progresión del cáncer de próstata y la posibilidad de funciones de LKB1 /AMPK-independiente merecen atención adicional.
Akt1 es una quinasa de serina-treonina que transmite señales de fosfatidilinositol 3 'cinasa (PI3K) por su fosforilación de objetivos de abajo y la desregulación de esta vía se sabe que contribuyen a la progresión del cáncer de próstata [25], [26]. Es bien sabido que la vía PI3K /Akt juega un papel importante en la viabilidad celular de cáncer de próstata y la tumorigénesis y está siendo actualmente siendo investigado como un objetivo terapéutico [27], [28]. Los informes anteriores han demostrado que la vía AKT /PI3K regula el crecimiento celular LNCaP y que la expresión de AKT constitutivamente activa puede bloquear la inhibición del crecimiento inducida por la bicalutamida [27], [29], [30]. Además, Akt1 se ha demostrado que interactúan con AR [31]. La pérdida de función de la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN), un regulador negativo de la vía PI3K /AKT, se produce en al menos 50% de cáncer avanzado de próstata humano [32] - [34]. Esta pérdida de resultados de la función PTEN en aumento de la expresión de Akt fosforilada y la posterior activación de abajo objetivos implicados en la supervivencia y la proliferación [35] de células, [36]. La inhibición de AKT usando siRNAs o una apoptosis inhibidor farmacológico inducido en combinación con bicalutamida o MDV3100 en células de cáncer de próstata dependientes de AR (Figura 2A, panel de la derecha y la Figura 4). Como resultado de los papeles notificados de Akt1 en la tumorigénesis del cáncer de próstata, la vía PI3K /AKT está siendo estrechamente examinada como una diana terapéutica [25]. Nuestros datos apoyan el uso de los inhibidores de Akt en combinación con antiandrógenos para tratar el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y antiandrógenos
líneas celulares de carcinoma de próstata humano (LNCaP, PC3, y VCAP) y células de riñón embrionario humano (293T) se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se mantuvieron por debajo de 20 pasajes en el laboratorio. Las células se cultivaron de acuerdo con las directrices de la ATCC. No se observan alteraciones en el crecimiento o la morfología de cualquier línea celular bajo sus respectivas condiciones de crecimiento. La bicalutamida se adquirió de AstraZeneca Pharmaceuticals LP (Wilmington, DE) y MDV3100 se sintetizó en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering por el Fondo Síntesis orgánica Core [19].
Preparación de ADN biblioteca de ARN de horquilla corta y el virus
Una biblioteca de plásmidos (PLMP) que expresa ~6,000 RNAs cortos horquilla (shRNAs), quinasas dirigidas a genes implicados en la regulación del ciclo celular, y otros genes que se sabe están involucrados en el cáncer se utilizó en la pantalla actual [17]. La biblioteca de plásmidos agrupado se amplificó en células electrocompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y de ADN del plásmido se aisló a partir de al menos 1.000 transformantes por horquilla. El virus se produce en las células 293FT por la co-transfección del vector de expresión pUMVC3-Gag-Pol (Addgene, Cambridge, MA), VSVG sobre pantrópica (Addgene), y se aisló el ADN de la biblioteca shRNA anteriormente.
pantalla shRNA interferencias
La pantalla de interferencia shRNA se representa en la figura 1A. células LNCaP y PC3 se infectaron con el virus de 6K shRNA agruparon biblioteca (MOI≤0.5) por triplicado para generar un total de 6 millones de células infectadas por repetición, por línea celular. La infección de las células diana en MOI≤0.5 se confirmó por microscopía de fluorescencia y de células activadas por fluorescencia (FACS) 48 h después de la infección. Se seleccionaron las células LNCaP y PC3 con 3 ug /ml de puromicina y se contaron y se sembraron en medio de crecimiento que contiene 0,4 uM bicalutamida, 1,0 uM bicalutamida, o vehículo (DMSO) a las células. Las células se pasaron, y bicalutamida y reponen vehículo, cada 4 días sin permitir confluencia. LNCaP y PC3 células de cada réplica se recogieron y los sedimentos celulares se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C en múltiples puntos de tiempo durante la pantalla. Las células se recogieron 48 h después de la infección (T = 0), y después de 8 días (T = 1) y 21 días (T = 2) de la exposición a vehículo o bicalutamida.
Microarray
ADN genómico fue extraído de las células utilizando condiciones estándar. Los códigos de barras y medias horquillas de ADN plásmido de la biblioteca (utilizado originalmente para hacer el virus) y LNCaP y ADN genómico de células PC3 aislado anteriormente fueron amplificados mediante PCR los siguientes cebadores: 5'-TAGTGAAGCCACAGATGTA-3 'y 5'-AAAGCGCATGCTCCAGACTGCC-3' . Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en gel y los 350 pb bandas resultantes se purificaron en gel usando el kit de extracción de gel QIAEX II (QIAGEN, Valencia, CA) fragmentos de ADN .Purified (1,5 ug) de LNCaP o células PC3 se etiquetaron y se microarray de hibridación fue llevado a cabo usando chips de Agilent personalizados como se describe anteriormente [17].
microarrays de análisis de datos
Affymetrix datos exón serie de 147 muestras de tumor [18] se utilizaron para determinar los niveles de expresión de los genes diana shRNA representados en la pantalla de la biblioteca. Se consideraron las sondas con fondo ajustado intensidad normalizada superior a 50 como se detectó
.
Feature Extractor de software Agilent se utilizó para escanear imágenes de microarrays. Extractor de características de intensidad Cy3 normalizado para cada matriz fue compilado y todo el procesamiento ulterior se realizó utilizando el paquete de software estadístico R 2.8.1. La calidad se evaluó a lo largo usando análisis de componentes principales y más formalmente mediante la comparación del rango intercuartil entre arreglos. Las muestras con un log2 transformado rango intercuartil menos de 6 fueron considerados valores atípicos y no considerados en el análisis adicional. Cuando las muestras duplicadas (técnica repeticiones) permanecen, se utilizó la más reciente repetición de cada. Las muestras restantes fueron objeto de cuantil normalización. Las sondas que corresponden a horquillas que no están presentes en la biblioteca se utilizaron como controles negativos. La intensidad de la señal percentil 95 de los controles negativos se utilizó como la medida de fondo y se estimó a partir de preselección (T = 0) muestras. Las sondas fueron retirados de un análisis más detallado cuando no superaron la estimación fondo específico de la muestra en la mayoría de las muestras de preselección. la prueba estadística se realizó para identificar las horquillas cuya abundancia variado con el tiempo en las muestras no tratadas. Se utilizó el análisis de curso de tiempo aplicado en la extracción de software expresión diferencial de genes (EDGE) para este análisis [37]. Para identificar las horquillas donde la abundancia se asoció con la presencia de bicalutamida se utilizaron los modelos lineales para la biblioteca de microarrays en I 2.8.1 [38]. En concreto, un modelo lineal se construyó con términos para el tratamiento, punto en el tiempo, y replicar. Este modelo se ajusta a cada sonda, y doblar los cambios y valores de p que ofrezcan el efecto del tratamiento se utilizaron para identificar sondas de interés. Las dos dosis de bicalutamida (0,4 uM y 1,0 uM) y los dos puntos de tiempo recogieron después de la selección (T = 1 y T = 2) se combinaron para el análisis de aumentar el poder estadístico. No se observaron diferencias significativas entre las dosis de bicalutamida y los puntos de tiempo. Los candidatos que tuvieron un cambio de la abundancia que se asoció con la presencia fueron seleccionados de bicalutamida que resultó en una log2 bicalutamida /vehículo-≤ 0,58 y un p-value≤0.01. La visualización de los candidatos se realizó con la agrupación jerárquica y mapas de calor. Todos los datos de microarrays es compatible con MIAME. Todos los datos en bruto se ha depositado en la órbita geoestacionaria (serie de identificación del GSE32261).
Ensayos
viabilidad celular y la apoptosis
ON-TARGETplus no director (NT) siRNA y siRNA dirigidos SmartPools
ABL2
,
AKT1
,
AR
,
CIT
,
IGF1R
,
MAPKAPK5
,
MAST3
,
PLK2
,
PRKACG
,
PSMC1
,
RABGAP1
,
STRADα (STRADA)
,
STRN3
,
TSSK2
,
TTK
, y
VEGFβ
fueron adquiridos de Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO). siRNAs dirigidos
Plk1
se utilizó como control positivo para la apoptosis y se obtiene de la planta de filtrado MSKCC de Alto Rendimiento de Drogas. la fase de registro LNCaP, PC3, y las células fueron transfectadas con VCAP 100 nM siRNA utilizando DharmaFECT (Thermo Fisher Scientific). La viabilidad celular se determinó 3 y 6 días después de la incubación con bicalutamida (1 uM), MDV3100 (1 uM), o vehículo con el ensayo de viabilidad celular Titer Glo-Cell luminiscentes (Promega). La apoptosis fue ensayada utilizando el ensayo de la caspasa-Glo 3/7 (Promega) y los valores se normalizaron con el ensayo Día 3 Cell Titer-Glo. Los ensayos se realizaron por triplicado y se informa de errores estándar de la media. Ensayos de proliferación celular también se llevaron a cabo por las células de incubación con vehículo (DMSO), bicalutamida (1 uM), inhibidor de AKT (1 uM) (Merck, Whitehouse Station, NJ), o una combinación de bicalutamida y el inhibidor de AKT y contando las células. Los experimentos se realizaron por triplicado y se indican las desviaciones estándar.
Immunoblotting
Los lisados celulares para análisis de transferencia de Western se prepararon usando tampón RIPA estándar. Los anticuerpos utilizados para el análisis de transferencia de Western e inmunohistoquímica fueron pAkt Ser473 (Cell Signaling Technology, 1:1000 dilución), Akt (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, MA, 1:1000 dilución), ps6 Ser235 /236 (Cell Signaling Technology, 1: 1000 dilución), PARP (Cell Signaling Technology, 1:1000 dilución), y la actina (Cell Signaling Technology, 1:1000 dilución).
PCR con transcripción inversa cuantitativa
LNCaP, PC3, y células VCAP sujetos a siRNA transfección se recogieron 4 días o 7 días después de la transfección para monitorear knockdown del gen (s) diana por cuantitativa con transcripción inversa-PCR (qRT-PCR) (véase la Tabla S4). Las reacciones se realizaron por triplicado y se normalizó para RPL27 para cada ADNc y luego normalizada a tratado con vehículo NT. Se calculó el error estándar de la media.
recurrencia bioquímica
La expresión génica y copiar el estado número de
STRADA
,
TTK
,
AR
,
AKT1
,
SKT22B
,
PSMC1
, y
PRKACG Hoteles en cáncer de próstata humano primario y metastásico (n = 218) se determinó mediante el uso de la MSKCC Genómica del cáncer Camino Portal [18]. Veinte de los 131 tumores tenían
TTK
sobre-expresión se define como Z-score≥2. Los casos fueron clasificados como
TTK
alta y
TTK
normales /bajos. La probabilidad de la ausencia de recurrencia bioquímica después de la prostatectomía radical (BCR define como & gt; 0,2 antígeno ng /ml y el aumento específico de la próstata) se informó mediante el análisis de Kaplan-Meier. P-valor se calculó utilizando la prueba de log-rank.
Apoyo a la Información
Figura S1.
bicalutamida inhibe la proliferación de células LNCaP. Después de la infección con el shRNA biblioteca y selección de puromicina (A) LNCaP y PC3 células (B), se contaron y se sembraron en medio de cultivo conteniendo 0,4 uM bicalutamida, 1,0 uM bicalutamida, o vehículo (0 uM). Se contaron las células y se pasaron cada 4 días para controlar el crecimiento en respuesta a vehículo y bicalutamida. Los resultados se presentan como el número medio de células viables (paneles superiores) o como el porcentaje de células de bicalutamida tratados viables en comparación con las células tratadas con vehículo (paneles inferiores) en cada punto de tiempo en el transcurso de tiempo 21 días para cada tratamiento de drogas ± estándar de error de 3 experimentos replicados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034414.s001 gratis (TIF)
figura S2. sondas
shRNA empobrecido en células LNCaP. Boxplots de la abundancia relativa de las sondas en el vehículo y las células bicalutamide- (fármaco) tratados LNCaP. Los datos de T = 2 y T = 3 se combinaron para el vehículo o diagramas de caja de bicalutamida tratados. Ambas dosis de bicalutamida (0,4 uM y 1,0 uM) también se combinaron para los diagramas de cajas de medicamentos.