Extracto
migran dentro de un microambiente 3D son capaces de adoptar o bien un mesenquimales o el modo ameboide de la migración. migración ameboide se caracteriza por formación de ampollas en la membrana que depende de los efectores Rho, Rock1 /2. Identificamos LIMK2 como el sustrato preferido para Rock1 pero encontramos que LIMK2 no indujo la formación de ampollas en la membrana, lo que sugiere que una vía LIMK2 no está implicado en la migración en modo ameboide. En apoyo de esta hipótesis, la novela FRET datos demuestran una interacción directa entre Rock1 y LIMK2 en células polarizadas, pero no la formación de ampollas. Nuestros resultados apuntan a un papel específico para la Rock1:. LIMK2 vía de migración en modo de mesenquimales
Visto: Shea KF, Wells CM, Garner AP, Jones GE (2008) Rock1 y LIMK2 Interact en el margen pero no la formación de ampollas Células cancerígenas. PLoS ONE 3 (10): e3398. doi: 10.1371 /journal.pone.0003398
Editor: Carl-Philipp Heisenberg, Instituto Max Planck de Biología Celular Molecular y Genética, Alemania |
Recibido: 8 de Julio, 2008; Aceptado: September 16, 2008; Publicado: 14 Octubre 2008
Derechos de Autor © 2008 Shea et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación médica (MRC), y la concesión de una beca de caso de BBSRC /AstraZeneca plc
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metástasis de cáncer de mama depende de la migración celular, un proceso complejo regulado espacialmente como temporalmente por la familia Rho GTPasas Rho, Rac y Cdc42 [1]. Estas GTPasas provocan una respuesta a señales extracelulares en el citoesqueleto de actina a través de una variedad de proteínas efectoras. En un microambiente 3D células cancerosas pueden adoptar tanto mesenquimales y ameboide como son los fenotipos migratorias [2]. migración ameboide se caracteriza por formación de ampollas en la membrana [3] - [5] una forma especializada de la protrusión celular que es reversible y puede ocurrir durante la migración celular o durante el inicio de la citocinesis [6]. formación de ampollas en la membrana se ha demostrado ser inducida por la Rho proteína efectora ROCA [7] y el movimiento ameboide-como es completamente dependiente de la interacción entre Rho y Rock [2], [5].
ROCK-1 y el rock -2 son serina /treonina quinasas que tienen un número de sustratos celulares, incluyendo la cadena de miosina Luz y LIM quinasa (LIMK) [8]. migración ROCK-dependiente de las células cancerosas es conocido para ser accionado por contracciones actomiosina [9], [10]. Sin embargo, no se sabe si la locomoción ameboide dependiente de células de cáncer Rock requiere una roca:. LIMK interacción
limk proteínas activadas fosforilan e inactivan la F-actina proteína de corte, cofilina y esto proporciona un mecanismo alternativo para la señalización de Rho-ROCK para mediar sus efectos sobre el citoesqueleto de actina F [11]. señalización ROCK-LIMK se considera que promueve la retracción de las neuritas mediante la regulación de la actividad de la cofilina [12]. Además, el papel de las proteínas del rock-and limk en la epidermis humana se ha identificado [13]. La inhibición de la actividad de la cofilina por ROCK-LIMK parece ser necesario para la compactación de células donde una disminución en la actividad LIMK conduce a un aumento en la actividad de la cofilina y una disminución en la compactación de células [13].
Un aumento en los niveles de ROCA se ha detectado en varios cánceres humanos [14] - [16] y los niveles de LIMK-1 aumento en líneas celulares de mama y de próstata invasivos y metastásicos [17], [18]. Por lo tanto hemos tratado de comprender mejor la contribución de una roca:. LIMK interacción con la migración de células de cáncer por imágenes de la interacción espacial entre el rock y LIMK en células de cáncer de mama que presentan tanto mesenquimales y ameboide (formación de ampollas) morfologías
Materiales y Métodos
Los anticuerpos y reactivos
anti-Rock1 se adquirió de transducción Laboratories, anti-LIMK2, anti-fosfo-LIMK1 /2 (Thr508 /Thr505) de señalización Cell Technology. anticuerpos secundarios conjugados con HRP de Dako y Alexa-faloidina de Molecular Probes. Los plásmidos de expresión que codifican GFP, CFP, YFP y mRFP1 etiquetados LIMK1, LIMK2 y Rock1 se generaron utilizando Technology ™ Gateway (Invitrogen) y se secuenciaron todos los plásmidos. El inhibidor Y27632 ROCA se adquirió de Calbiochem.
Cell Cultura y
células MDA-MB231 se cultivaron en DMEM (Sigma) suplementado con 10% de SFB (Helena Biosciences), L-glutamina y 100 U /ml de penicilina-estreptomicina. Las células fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Invitrogen)
Ensayo de fosforilación
Las células se lisaron en tampón de lisis NP40 (1% v /v NP40;. MM HEPES 50 pH 7,5; 0,5% w /v desoxicolato de sodio; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM). Las muestras fueron resueltas por SDS-PAGE y se inmunotransfirieron. Las autorradiografías se escanearon y se cuantificaron utilizando el software de Adobe. La media y s.e.m. Se calcularon los valores de los datos de 3 experimentos independientes
inmunofluorescencia y análisis
células sembradas en cubreobjetos de vidrio fueron fijadas con 4% paraformaldehído. PBS y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100: PBS como se describe anteriormente [19]. Las células fueron incubadas con faloidina conjugada con TRITC durante 1 h a temperatura ambiente. Imágenes de células se obtuvieron usando un Zeiss LSM510 microscopio confocal de barrido láser (Welwyn Garden City, Reino Unido) y se procesaron en Adobe Photoshop 7.0 ™. Se utilizó la prueba t de Student pareado para comparar las diferencias entre los grupos. La significación estadística fue aceptada por P £ 0,05
FRET: Flim Microscopía
Las células se microinyecciones con los plásmidos apropiados 24 horas antes de la colocación. Las células fueron fijadas como anteriormente y se incubaron con borohidruro de sodio fresco (1 mg /ml en PBS) para extinguir la fluorescencia de fondo, como se describe anteriormente. FLIM se realizó en un microscopio multifotónica como se describe anteriormente [19]. Flim análisis para calcular la vida GFP y la eficiencia de FRET se realizó utilizando el software TRI2 [19]. se obtuvieron El número de píxeles para cada valor de eficiencia de FRET de TRI2 y normalizado dividiéndolo por la suma de los píxeles para esa imagen. Este número de píxeles normalizado se promedió más de seis células por condición y, a continuación representa frente a la eficiencia de FRET para generar histogramas de eficiencia de FRET.
Resultados
Rock1 fosforila LIMK1 y LIMK2 en células de cáncer de mama
varios laboratorios han sugerido que la roca puede fosforilar y activar LIMK1 y LIMK2 [20] - [26] y por lo tanto hemos tratado de establecer si este es el mismo para las células MDA-MB231. Pre-incubación con el inhibidor Y27632 ROCA reduce el nivel de fosforilación en células con LIMK2 endógeno y sobreexpresa CFP-Rock1. Por el contrario, Y27632 reduce la relación de fosfo a LIMK1 totales en células con sobreexpresión de CFP-Rock1 pero no en aquellos con niveles endógenos de proteína de roca (Fig. 1). El tratamiento de células con Y27632 indujo una pequeña disminución en los niveles de sobreexpresión LIMK1 y LIMK2 (Fig. 1A y B). Sin embargo, mientras que la fosforilación LIMK2 siempre es sensible a la actividad ROCA LIMK1 fosforilación sólo es sensible a la actividad roca cuando se sobreexpresa PPC-Rock1. Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión de Rock1 altera el nivel de fosforilación de ambos LIMK1 y 2, pero sugieren que LIMK2 es el sustrato preferido de Rock1 en estas células.
A) y B) CFP-LIMK1 o 2 y ya sea CFP-Rock1 o CFP solo se transfectaron transitoriamente en células MDA-MB231 y se trataron con 10 mM Y27632 durante 24 horas. Los lisados resultantes se sometieron a inmunotransferencia utilizando anti-fosfo-LIMK, -LIMK1, -LIMK2 y -ROCK1 anticuerpos. (NSB = unión no específica del anticuerpo anti-Rock1 a una proteína /s a 220 kDa). C) Relación de fosfo /total de LIMK1 PPC-LIMK1 y D) Relación de fosfo /LIMK2 total. (* = P & lt; 0,05).
Rock1 pero no induce la formación de ampollas en LIMK2 en células de cáncer de mama
Se ha encontrado que, aunque la sobreexpresión de GFP sola causa un pequeño pero estadísticamente significativo aumento en el número de células formación de ampollas en la sobreexpresión de GFP-Rock1 induce un aumento altamente significativo en el porcentaje de células formación de ampollas (Fig. 2A y B). Aunque no se muestra antes en las células MDA-MB231 esto ha sido reportado en otros tipos de células [9], [27] - [30]. En contraste sobreexpresión de GFP-LIMK2 no indujo un alto nivel de formación de vesículas de membrana, también vimos ninguna indicación de formación de ampollas en la célula tras la sobreexpresión de LIMK1 (datos no mostrados). En todos los casos las células vesiculación tenía un núcleo intacto que no lo hicieron fragmento (Fig. 2A) que indica que esto no se membrana blebbing asociado con la apoptosis [31].
) las células MDA-MB231 A fueron transfectadas con GFP-Rock1 o GFP-LIMK2, fijadas y teñidas con Alexa Fluor 594-faloidina y DAPI. 150 células de más de 3 experimentos independientes se anotó para la formación de ampollas visibles +/- E.E.M. P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,001. B) Imágenes representativas de la variación rebanadas ópticas de formación de ampollas en una célula que sobreexpresa GFP-Rock1. (Barra = 20 micras).
Rock1 y LIMK2 no interactúan en las células de cáncer de mama formación de ampollas en
Nuestros resultados muestran que existe una interacción entre Rock1 y LIMK2, pero sugieren que esta interacción no está involucrado en la formación de ampollas de membrana. Hemos tratado de confirmar esta hipótesis mediante la obtención de imágenes directamente la interacción entre Rock1 y LIMK2 en las células de la formación de ampollas y no la formación de ampollas utilizando FRET: microscopía de Flim. Este método no sólo permite una interacción entre Rock1 y LIMK2 a detectar, sino también la localización de dicha interacción que se determinará espacialmente a través de toda la célula. Con el fin de comparar la interacción de Rock1 y LIMK2 en las células de propagación y formación de ampollas en la microinyección se utilizó para moderar el nivel de expresión Rock1. Usando este método, la mayoría de las células, (63%), mostraron una morfología propagación /polarizado, con menor número de células formación de ampollas (23%). En las células de formación de ampollas no detectamos FRET entre GFP-ROCK-1 y mRFP-LIMK-2 (Fig. 3).
células MDA-MB231 con microinyecciones GFP-Rock1 y mRFP-LIMK2, fijo, la imagen y analizada mediante microscopía Flim y el programa de análisis TRI2. A) Las imágenes de la vida útil de GFP y GFP intensidades y MRFP través de una célula típica formación de ampollas se muestran para una célula que expresa tanto el donante GFP-Rock1 y el aceptor mRFP-LIMK2 y para la comparación, sólo el GFP -ROCK1 donante. B) Histograma de el número de cuentas de píxel normalizados detectadas en cada vida GFP. n = 9.
Rock1 y LIMK2 interactúan en las células de cáncer de mama polarizadas
Una vez establecido que Rock1 y LIMK2 no están interactuando en las células de formación de ampollas se analizó la localización y la interacción de Rock1 y LIMK2 en células separadas. En las células difundir la mayoría de LIMK2 y Rock expresión se localiza en el citoplasma, pero la expresión de ambas proteínas se puede detectar en el núcleo (Fig. 4). En las células MDA-MB231 con un diferencial /fenotipo polarizado que hemos detectado una disminución de la vida útil de GFP cuando Rock1 y LIMK2 fueron co-expresada, lo que demuestra que Rock1 y LIMK2 interactúan en las células de propagación (Fig. 4). La disminución GFP vida se ve a través del citoplasma de la célula en una distribución punteada. En comparación, las dos células polarizadas microinyección sólo con GFP-Rock1 no muestran ninguna disminución de la vida útil de GFP (Fig. 4). No hay descenso significativo en la vida GFP debajo de los niveles de control cuando las células que expresan Rock1 y LIMK2 son pre-incubadas con el inhibidor de Y27632 de roca (Fig 4). Curiosamente, en muchas células hay una falta de cualquier interacción detectable entre Rock1 y LIMK2 en la periferia de la célula (resaltado por puntas de flecha en la Fig. 4).
células MDA-MB231 se microinyectaron con GFP-Rock1 y mRFP- LIMK2, fija, fotografiado y analizado mediante microscopía Flim y el programa de análisis TRI2. A) Las imágenes de la vida útil de GFP y GFP intensidades y MRFP través de una célula alargada típica se muestran para una célula que expresa tanto el donante GFP-Rock1 y el aceptor mRFP-LIMK2 y para la comparación, sólo el GFP -ROCK1 donante. B) Histograma de el número de cuentas de píxel normalizados detectadas en cada vida GFP. C) Un histograma del número promedio de número de píxeles normalizados detectadas en cada vida GFP en las células que expresan tanto GFP-Rock1 donante y aceptor mRFP-LIMK2 en las células de morfologías alargadas o formación de ampollas fue construido junto con las células que expresan sólo el donante GFP-Rock1. 18 celdas más de tres experimentos independientes se obtuvieron imágenes para cada punto de tiempo. D) Un histograma del número de recuentos de píxeles normalizados detectadas en cada vida GFP para las células que expresan tanto GFP-ROCK-1 donante y mRFP-LIMK-2 aceptor en las células MDA-MB231 pre-tratados con Y27632. n = 9.
Discusión
Estudios previos habían identificado no sea una roca: vía LIMK contribuyó a la inducción de la formación de ampollas en la membrana. Proporcionamos aquí por primera vez pruebas de una interacción directa y concreta entre Rock1 y LIMK 2 en células mesenquimales bien repartidas-que está ausente en las células de formación de ampollas redondeadas. Usando microscopía FRET se encontró ninguna interacción entre ROCK-1 y LIMK-2 en las células que muestran un fenotipo formación de ampollas en la membrana, a pesar de nuestra propia evidencia de que LIMK2 es el sustrato preferido ROCA en estas células. Nuestros resultados sugieren que un Rock1: LIMK2 interacción no está implicado en la formación de ampollas en fenotipo /redondeada y no sería necesario para la migración ameboide. De hecho sobreexpresión de LIMK2 no induce la formación de ampollas en la membrana de las células. Informes recientes sugieren que los eventos celulares aguas abajo de la activación de roca son de hecho coordinados por separado aunque MLC y la cofilina fosforilación [32].
A diferencia de nuestros estudios FRET identificaron una interacción directa entre Rock1 y LIMK2 en focos concentrada en el citoplasma de cáncer células con una morfología mesenquimal. La fosforilación de LIMK-2 por ROCK-1 en el centro de la celda sería aumentar el nivel de la cofilina fosforilada, disminuyendo de ese modo de corte F-actina. Esto estabilizar los filamentos de actomiosina presentes en el cuerpo celular y promover la generación de la fuerza de contracción necesaria para la retracción de la cola y la migración celular [33]. En efecto, previamente se ha demostrado que la formación de fibras de estrés de actina inducida por TGF está mediada por una ROCK-1 /LIMK-2 /cofilina vía [26]. Recientemente, una roca: LIMK1 vía estaba implicado en la coordinación de la actividad de la cofilina en la membrana plasmática de las células de carcinoma mamario de ratas invasoras [34], [35]. Nuestros resultados apuntan a una función distinta de LIMK1 y LIMK2 aguas abajo de la roca durante la migración de las células del cáncer de mama. Los autores especulan que la interacción entre Rock1 y LIMK2 no juega un papel importante en la formación de vesículas de membrana asociada a la migración celular ni en la regulación de la fosforilación de la cofilina en la periferia de la célula. Más bien, la interacción entre Rock1 y LIMK2 está restringido al cuerpo celular de las células bien extendidas polarizadas donde es contribuye a la estabilización de filamentos de actomiosina y la generación de la fuerza contráctil a través de la inactivación de la cofilina.