Extracto
Antecedentes
terapia de privación de andrógenos (ADT) es un tratamiento común para no metastásico, cáncer de próstata de bajo riesgo, pero un efecto secundario potencial de ADT se altera el funcionamiento del cerebro. El trabajo previo con imágenes de resonancia magnética funcional (MRI) mostró alteración de activaciones corticales prefrontales en el control cognitivo, con cambios detectables en el rendimiento de comportamiento. Teniendo en cuenta la utilidad de las imágenes del cerebro en la identificación de los posibles efectos perjudiciales de ADT en las funciones cerebrales, el presente estudio examinó los efectos de ADT en estructuras cerebrales mediante resonancia magnética alta resolución y morfometría basada en voxel (VBM).
Métodos
imagen de alta resolución T1 ponderado de todo el cerebro se adquirieron al inicio del estudio y después de seis meses de ADT para 12 pacientes con cáncer de próstata y 12 participantes de control no expuestas demográficamente emparejados imagen formada en los mismos puntos de tiempo. Las imágenes del cerebro fueron segmentados en la materia gris, la sustancia blanca y ventrículos cerebrales utilizando la caja de herramientas VBM como se aplica en Statistical Parametric Mapping 8.
Resultados
En comparación con la exploración basal, los pacientes con cáncer de próstata sometidos a ADT mostraron una disminución el volumen de materia gris en la corteza frontopolar, corteza prefrontal dorsolateral y la corteza motora primaria, mientras que los participantes del grupo control no expuestas no mostraron tales cambios. Además, la disminución del volumen de la materia gris de la corteza motora primaria mostró una correlación significativa con el tiempo de reacción más largo para apuntar la detección en una tarea de memoria de trabajo.
Conclusiones
ADT puede afectar a la materia gris cerebral volúmenes en pacientes con cáncer de próstata. En caso de repetirse, estos resultados pueden facilitar futuros estudios de la función cognitiva y la calidad de vida en los hombres que recibieron ADT, y también puede ayudar a los médicos a sopesar las ventajas y los riesgos de la terapia hormonal en el tratamiento del cáncer de próstata
Visto:. Chao HH, Hu S, Ide JS, Uchio E, Zhang S, Rose M, et al. (2013) Efectos de la privación de andrógenos en morfometría cerebral en pacientes con cáncer de próstata - Un estudio exploratorio. PLoS ONE 8 (8): e72032. doi: 10.1371 /journal.pone.0072032
Editor: Elizabeth Wilson, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Marzo, 2013; Aceptado: 2 Julio 2013; Publicado: 19 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Chao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el NIH subvención R03CA138121 de HHC, un reto Supervivencia premio piloto del Centro del cáncer de Yale /Connecticut, y el VA Urología Seccional de Investigación de financiación. Los organismos de financiación no tiene otro papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis e interpretación de datos; en la redacción del informe; o en la decisión de presentar el documento para su publicación
Conflicto de intereses:. Dr. Edward Uchio que participaron en este estudio como un empleado del Departamento de Asuntos de Veteranos del gobierno /de Estados Unidos es actualmente empleado por una empresa privada, Torre Investigación, Los Ángeles, CA. Los autores confirman que no hay conflictos de intereses como consecuencia del empleo actual y que esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer no cutáneo más común en los hombres estadounidenses. Casi la mitad de todos los pacientes con cáncer de próstata recibirá terapia de privación de andrógenos (ADT) en el transcurso de su enfermedad [1], [2]. A pesar de que ADT ha documentado la eficacia en el tratamiento del cáncer de próstata metastásico, ADT también se da a los pacientes con cáncer de próstata no metastásico, como tratamiento neoadyuvante y adyuvante y en pacientes que tienen un nivel de aumento del PSA después de la terapia definitiva. La evidencia sugiere que ADT puede mejorar la supervivencia de pacientes con cáncer de próstata no metastásico con características de mal pronóstico, pero no existe consenso con respecto a las indicaciones o la duración de ADT en los pacientes con enfermedad de bajo riesgo [3]. A pesar de esta incertidumbre, el uso de ADT se ha vuelto más frecuente en los EE.UU. en los últimos años, lo que representa la mayor parte del crecimiento de los precios ajustados en función de los gastos de Medicare relacionada con el cáncer de próstata [4].
Los efectos secundarios comunes de ADT incluyen fatiga , disminución de la función sexual, la ginecomastia, la osteoporosis, y los cambios en el metabolismo, y el impacto negativo de estos efectos adversos en la calidad de vida ha sido estudiado ampliamente [5]. No queda claro, sin embargo, si o en qué medida influye en la función cognitiva de ADT, un importante factor determinante de la calidad de vida de estos pacientes en su mayoría ancianos. Tanto los estudios de observación y aleatorios apoyan una asociación entre los andrógenos y la función cognitiva [6] - [10], y los estudios han sugerido un efecto protector de la testosterona contra el declive relacionado con la edad en la función cognitiva, incluyendo el desarrollo de la demencia en los hombres. Por el contrario, los efectos de ADT sobre la función cognitiva en pacientes con cáncer de próstata siguen sin estar claros, con los informes que sugieren ningún efecto [11], deterioro de la función [12] - [14], y un efecto de mezclado con los pacientes que muestra un rendimiento mejorado en algunas pruebas y un deterioro en los demás [15].
magnética resonancia nuclear (RMN) proporciona un método no invasivo para medir las estructuras del cerebro y activaciones. Los investigadores han utilizado la resonancia magnética y otros métodos de imagen para evaluar los efectos de la quimioterapia y la terapia hormonal en las estructuras del cerebro y funciones en pacientes con cáncer de mama [16] - [19]. El trabajo anterior de la resonancia magnética funcional mostraron que en comparación con los participantes que no recibieron ADT, los pacientes con cáncer de próstata sometidos a ADT no mostraron diferencias significativas en el rendimiento cognitivo, pero mostraron alteración de la activación cortical prefrontal durante el control cognitivo [20]. Estos y otros hallazgos sugieren la utilidad de imágenes del cerebro para detectar los efectos de la terapia hormonal en las estructuras y funciones cerebrales antes de la manifestación de los efectos cognitivos y de comportamiento.
En este contexto, el presente estudio utiliza resonancia magnética estructural para evaluar los cambios en materia gris cerebral en pacientes con cáncer de próstata que reciben ADT, en comparación con los pacientes que no reciben el tratamiento.
Materiales y Métodos
los participantes y los perfiles clínicos
los pacientes fueron reclutados de la Oncología médica y Urología Clínicas del Sistema de Salud VA Connecticut. Los candidatos potenciales se identificaron en la Junta de Tumores bimensual genitourinaria, o durante sus visitas a la clínica de rutina, y se ofrecieron a participar en el estudio. Dieciocho hombres que tenían no metastásico, probado por biopsia de cáncer de próstata y que se les prescribió ADT-ya sea como tratamiento adyuvante o debido a la recurrencia bioquímica después de prostatectomía o radioterapia fueron reclutados para participar en el estudio. ADT consistió en la castración médica con un agonista de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (goserelina 10,8 mg por vía subcutánea cada 90 días) después de un periodo inicial de 2 semanas con bicalutamida 50 mg al día. Durante el mismo intervalo de tiempo, 18 individuos de la misma edad con cáncer de próstata no metastásico que fueron sometidos a radioterapia o prostatectomía tenían y nunca habían sido tratados con ADT se inscribieron como participantes de control no expuestos. Los criterios de exclusión fueron: segunda neoplasia maligna activa en ese momento; Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Estado de rendimiento & gt; 1; las condiciones cardiovasculares importantes (por ejemplo, clase III o IV insuficiencia cardíaca congestiva New York Heart Association (NYHA), infarto de miocardio reciente, angina inestable, marcapasos); o hepática (por ejemplo, cirrosis hepática Child-Pugh B o C), renal o enfermedad neurológica. Los pacientes que tenían un diagnóstico de eje-I (con exclusión de la nicotina) psiquiátrico o por uso de sustancias trastornos [21], y los pacientes que reciben agentes en investigación alguna, fueron excluidos. Una puntuación de menos de 27 de los 30 en el Mini-Examen del Estado Mental (MMSE) fue otro criterio de exclusión [22]. Todos los participantes se sometieron a una entrevista cuestionario de salud para asegurar la elegibilidad para la resonancia magnética funcional antes del estudio.
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de conformidad con las directrices institucionales y procedimientos aprobados por el Comité de Investigación Humana de Yale y el Subcomité de Investigación Humana de los Veteranos Relaciones (VA) Sistema de Salud de Connecticut. De la población original del estudio, 12 de ADT y 12 participantes de control completaron los análisis estructurales del cerebro, tanto en la línea de base y 6 meses (después del tratamiento) (Tabla 1) guía empresas
Memoria de trabajo:. N-back de tareas
memoria de trabajo es una forma de memoria a corto plazo que permite a los individuos para sostener y manipular información en la mente con el fin de realizar tareas complejas tales como la comprensión, el razonamiento y el aprendizaje. Un paradigma de comportamiento ampliamente utilizado para estudiar la memoria de trabajo es la tarea n-back. En la tarea n-back, los participantes observan una serie de letras y responden a una carta (un objetivo) que coincide con la carta anterior ( "1-back") o la letra dos pasos de tiempo atrás ( "2-back"). Por lo tanto, para detectar el objetivo, los participantes necesitan para mantener la memoria de las letras que aparecen consecutivamente durante un período de tiempo. En los ensayos "0-back", los participantes simplemente responden a una carta de destino designado de antemano. Cero, de 1 y 2 ensayos de espalda se ejecutan en diferentes bloques y tanto la tasa de precisión (porcentaje de las cartas de destino correctamente identificados) y el tiempo de reacción (RT) de corregir los ensayos se utilizan como índices de rendimiento. Un índice de exactitud más alta y más corta RT representa la memoria de trabajo mejor.
Nuestros participantes realizaron una N-volver a trabajar tarea de memoria fuera del escáner en la línea de base y 6 meses después del tratamiento. Los participantes respondieron a una serie de letras que se presentan a un ritmo de 1 cada 2 s (duración del estímulo = 500 ms). Quince cartas fonológicamente distintas sirvieron como estímulos (A, B, C, D, E, F, G, H, K, M, N, P, S, W, X), con tres bloques en la tarea, que difieren en la memoria de trabajo carga. Cada sujeto realizó 3 sesiones de la tarea n-back, con cada sesión que comprende dos de cada uno de 0, 1, y 2 cuadras atrás, el orden de la cual fue contrarrestado-a través de sesiones. Cada bloque se inició con una pantalla de información que muestra la "carga" para ese bloque (5 s) y contenía 24 ensayos, con un tercio de ellos en representación de objetivos. tasa de respuesta correcta y el tiempo de reacción de corregir los ensayos se registran para cada bloque y un promedio de la condición de cada carga para los análisis.
Evaluación subjetiva de la calidad de vida
Como una evaluación general del estado general, los participantes completaron Calidad de vida-cuestionarios estandarizados (QOL) de los pacientes con cáncer de próstata (FACT-P ©) al inicio del estudio ya los 6 meses [23].
Imaging Protocol
Los participantes fueron escaneada en un escáner Siemens 3-Tesla (Trío; Siemens AG, Erlangen, Alemania). Los datos de cada participante consistían en una sola exploración de eco de gradiente potenciada en T1 de alta resolución: 176 rebanadas; 1 mm
3 voxels isotrópicos; campo de visión = 256 × 256 mm; matriz de adquisición de datos = 256 × 256; TR = 2530 ms; TE = 3,66 ms, ancho de banda = 181 Hz /píxel; ángulo de inclinación = 7 °.
morfometría basada en voxel (VBM)
El objetivo de VBM es identificar las diferencias en la composición local de tejido cerebral y su asociación con medidas conductuales y cognitivos, mientras descontando diferencias a gran escala en la anatomía macroscópica y la posición. Esto se puede lograr mediante imágenes estructurales individuos espacialmente normalizadores 'al mismo espacio estereotáxica, la segmentación de las imágenes normalizadas en los tejidos cerebrales diferentes, suavizando las imágenes de materia gris, y la realización de una prueba estadística para localizar asociaciones significativas entre las medidas anatómicas y de comportamiento [24] .
morfometría basada en voxel
se realizó utilizando la caja de herramientas VBM8 (http://dbm.neuro.uni-jena.de/vbm/) envasados en Statistical Parametric Mapping 8 (Departamento de Neurociencia de imagen, University College de Wellcome Londres, Reino Unido). T
1-imágenes fueron primera co-registrados para el espacio de la plantilla del Instituto Neurológico de Montreal o MNI (1,5 mm
3 vóxeles isotrópicos) mediante una transformación afín etapa múltiple, durante el cual se estimaron los 12 parámetros de interés. Co-registro comenzó con un registro afín gruesa mediante las diferencias de medias cuadrados, seguido de un registro afín fino utilizando información mutua. En este paso, se estimaron coeficientes de las funciones de base que reduzcan al mínimo la diferencia de cuadrados residual (entre imagen individual y la plantilla). mapas de probabilidad de tejidos construidos a partir de 471 sujetos sanos fueron utilizados en transformación afín. Después de la transformación afín, T
1-imágenes se corrigieron para campo de polarización intensidad (tamaño del grano FWHM = 60 mm) y un medio locales eliminación de ruido del filtro [25] con el parámetro predeterminado 1 se aplicó, para dar cuenta de las variaciones de intensidad (falta de homogeneidad) y el ruido causado por las diferentes posiciones de las estructuras craneales dentro de la bobina de resonancia magnética. Las imágenes fueron segmentadas en el líquido cefalorraquídeo, gris y-cuestiones de blanco, con un máximo de adaptación método a posteriori [26] con k-medias inicializaciones, como se aplica en VBM8, generando la clase de tejido (incluyendo la materia gris o GM) mapas.
en la segmentación, la estimación del volumen parcial se realizó con parámetros por defecto 5, con un modelo mixto simplificada de como máximo dos tipos de tejidos [27]. Segmentados y los mapas de clase de tejido inicialmente registrados se normalizaron mediante Dartel [28], un algoritmo rápido de registro de imágenes difeomorfo de SPM. Como método de normalización espacial no lineal de alta dimensión, Dartel genera transformaciones espaciales inversas matemáticamente consistentes. Se utilizó la plantilla Dartel estándar en el espacio MNI, construido a partir de 550 sujetos sanos de la base de datos de IXI-(http://www.brain-development.org/), para impulsar la normalización Dartel. mapas normalizados GM fueron modulados para obtener el volumen absoluto de tejido GM corregido para los tamaños cerebrales individuales. Por último, los mapas de GM fueron suavizadas mediante la convolución con un kernel de Gauss isotrópico. Smoothing ayuda a compensar la naturaleza inexacta de normalización espacial y reduce el número de comparaciones estadísticas (con lo que la corrección para comparaciones múltiples menos severos); sin embargo, se reduce la precisión de la localización. La mayoría de los estudios VBM utilizan un tamaño de grano de FWHM = 12 mm. Se utilizó un tamaño de grano menor de FWHM = 8 mm para lograr una precisión de localización.
En los análisis de grupo, se comparó el volumen de materia gris cerebral al inicio del estudio y después del tratamiento, tanto para el ADT y el grupo no expuesto, usando emparejado-muestra de prueba de la t. También derivamos los volúmenes de materia gris de las regiones de interés para los participantes individuales y relacionaron las mediciones con los cambios en el rendimiento en la tarea de memoria de trabajo.
Resultados
de calidad de vida
No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los pacientes de ADT y control de calidad de vida en las puntuaciones al inicio del estudio, o con respecto a cambiar más de 6 meses mediante el FACT-P
© cuestionario (Tabla 1). h3> Rendimiento
Tal como se muestra en la Tabla 2, los resultados de las puntuaciones de rendimiento tarea n-back indicó que la tasa de respuesta correcta disminuyó al aumentar la carga de memoria para ambos ADT y los participantes no expuestos. Hemos llevado a cabo de dos vías ANOVA de medidas repetidas por separado para 0, 1 y 2- datos históricos. Los resultados indicaron la ejecución de tareas indistinguibles N-vuelta entre los dos grupos a través de los dos puntos de tiempo.
Voxel-basados fueron utilizados Morfometría
muestras pareadas pruebas t para la comparación voxel-sabia entre los volúmenes de materia gris en los dos puntos de tiempo, tanto para el ADT y el grupo de control. Los resultados mostraron disminución de los volúmenes de materia gris para el grupo de ADT pero no el grupo de control en la corteza motora primaria (x = -48, y = -10, z = 37, 185 voxels, Z = 4,02), la corteza frontopolar (x = 23 , y = 51, z = 4, 158 voxels, Z = 3,91), y la corteza prefrontal dorsolateral (x = -42, y = 38, z = 27, 192 voxels, Z = 3,67), p & lt; 0,001, no se corrige, como se muestra en la Figura 1. un análisis factorial de la varianza flexibles con punto de tiempo como factor dentro de la materia confirmó que los volúmenes de materia gris en el motor primario y cortezas prefrontal dorsolateral fueron significativamente menores de 6 meses después de ADT, en comparación con la línea de base, en el ADT grupo en contraste con el grupo control (p & lt; 0,05, pequeña corrección del volumen para el error familia de sabios de comparaciones múltiples).
voxelwise t de Student pareada entre la línea de base y 6 meses de ADT (pacientes que recibieron 6 meses de andrógenos terapia de privación) y control (pacientes que no recibieron la terapia hormonal cualquier grupo), en p & lt; 0,001, sin corregir. La diferencia en el volumen de materia gris, como se refleja en un mapa de valores T (barras de color), se muestra aquí una imagen cerebral estructural en las secciones axiales en adelante, desde z = -26 a +62 = z, con secciones adyacentes 4 mm. Color caliente: la línea de base & gt; 6 meses; color frío: 6 meses & gt; línea de base. orientación neurológica: Derecha (R) = derecha. ADT, pero no controla los pacientes mostraron una disminución del volumen de la materia gris en la corteza motora primaria (PMC), la corteza frontopolar (FPC), y la corteza prefrontal dorsolateral (córtex prefrontal dorsolateral).
Se extrajeron el volumen de materia gris de éstos dos regiones de interés para todos los pacientes y correlacionaron estos cambios en el volumen de materia gris cerebral a cambios en el rendimiento en la tarea N-posterior (Figura 2 panel superior). Los resultados mostraron que una disminución en el volumen de la materia gris de la corteza motora primaria correlacionado con el tiempo de reacción prolongado para apuntar la detección durante la condición de cero de nuevo en el grupo de ADT (p & lt; 0,0042, rho = -0.7832, regresión Spearman, Figura 2 inferior panel). El cambio de la materia gris de la corteza motora primaria y la corteza prefrontal dorsolateral no se correlacionó con el cambio en la exactitud o el tiempo de reacción en el de uno o dos hacia atrás condición, para el grupo de ADT o control (todo de & p gt; 0,107).
Una disminución de la GMV del PMC correlacionado con el tiempo de reacción prolongado para apuntar la detección durante la condición de cero de nuevo en el grupo de ADT (panel inferior). Debido al tamaño pequeño de la muestra, se utilizó una regresión y correlación (p & lt; 0,0042, rho = -0.7832). El resultado de la regresión de Pearson fue también significativo:. P & lt; 0,0049
Discusión
Los estudios de pruebas neurocognitivas tradicional sin imágenes cerebrales han mostrado efectos variables de tratamiento hormonal sobre la función cognitiva. En el presente estudio, se observó una disminución en el volumen de materia gris en las estructuras corticales frontales y prefrontales asociados con el uso de ADT. La disminución en el volumen de la materia gris de la corteza motora primaria correlacionado con el aumento de tiempo de respuesta - que sugiere insuficiencia procesamiento - durante la detección de blancos en la tarea N-back. Estos resultados son consistentes con nuestro estudio anterior que mostró alteración de la activación cortical prefrontal medial inducida por ADT durante el control cognitivo [20], y con el estudio realizado por Cherrier y sus colegas, que mostró cambios en la activación parieto-occipital ADT inducidos -durante la memoria espacial [29 ]. Nuestros pacientes fueron emparejados por edad y nivel de educación, y todas las evaluaciones se llevaron a cabo ya sea antes o por lo menos 3 meses después de cualquier tratamiento de cirugía o radiación para minimizar cualquier impacto de los síntomas relacionados con el tratamiento. En conjunto, estos resultados sugieren que la privación de andrógenos puede tener un impacto perjudicial sobre las estructuras cerebrales y funciones que no son evidentes mediante las pruebas tradicionales de comportamiento [30].
Los estudios anteriores han demostrado que las diferencias de sexo regionales en volumen de materia gris se asocian con las hormonas sexuales en el cerebro humano en desarrollo [31]. Corregido para la edad, el volumen global de la materia gris se asoció negativamente con los niveles de estradiol en las niñas, y positivamente con los niveles de testosterona en los varones [32]. análisis morfométrico cerebral sugiere que el desarrollo de la materia gris en ciertas regiones del cerebro se asocia con la maduración sexual y que las hormonas puberales podría tener efectos de organización en el cerebro humano en desarrollo [33]. Los niños con síndrome de Klinefelter que no recibieron terapia de reemplazo de testosterona mostraron una disminución gris total y el volumen de la materia blanca [34]. Los adultos con síndrome de Klinefelter también tuvieron una reducción significativa del volumen del lóbulo temporal izquierdo y el volumen ventricular aumentado, que fue inversamente correlacionada con la función cognitiva [35]. En contraste, los niños con pubertad precoz familiar masculina y la secreción excesiva de andrógenos temprana se caracterizaron por el aumento de volumen de materia gris en varias estructuras corticales y subcorticales [36].
Los datos en los adultos también apoyan los efectos moduladores de andrógenos en la corteza cerebral actividades [37] - [41] y el volumen de la materia gris y blanca [34], [42]. Un mayor nivel de testosterona libre se asoció con un mayor flujo sanguíneo cerebral en la corteza prefrontal y el hipocampo en los hombres de edad avanzada [37], y la terapia de reemplazo de testosterona aumento de la perfusión de sangre cerebral en la corteza prefrontal del cerebro medio y en hombres con hipogonadismo [37]. En mujeres sanas, la administración de testosterona aumentó las respuestas del cuerpo estriado ventral para recompensar [39].
Los estudios de neuroimagen han reportado diferencias en las activaciones cerebrales regionales en pacientes neurológicos o psiquiátricos, incluso cuando se llevan a cabo a un nivel igual a su demográficamente emparejados control de los participantes. Discutimos antes de que estos cambios en el desempeño independiente en las actividades cerebrales no pueden ser explicados por el esfuerzo o motivación, y potencialmente representan un correlato específico para las patologías cerebrales [20]. Aquí se demuestra que la privación de andrógenos también altera la morfometría cerebral. Dado que la motivación o el esfuerzo es muy poco probable que cambie la morfometría cerebral dentro del marco de tiempo del experimento actual, estos resultados proporcionan evidencia adicional para los efectos secundarios potenciales de ADT en el sistema nervioso central. Sin embargo, no se observaron diferencias en el informe subjetiva de la calidad de vida o el rendimiento de comportamiento durante la tarea de memoria de trabajo. por lo tanto se requieren más estudios para evaluar a fondo el impacto evidente de estos cambios funcionales y estructurales del cerebro como resultado de ADT.
Algunas limitaciones de nuestro estudio deben tenerse en cuenta. En primer lugar, el estudio incluyó un pequeño tamaño de muestra de 12 ADT y 12 participantes de control; por lo tanto, los resultados deben considerarse preliminares con la necesidad de replicación en el trabajo futuro. En segundo lugar, la duración de la observación es relativamente corto en la cohorte actual. Los estudios futuros deben abordar si las diferencias funcionales y estructurales asociados con ADT empeoran con el tiempo.
Conclusión
La deprivación androgénica durante 6 meses conduce a cambios estructurales del cerebro en pacientes con cáncer de próstata. Tales cambios se asocian con el tiempo de reacción prolongado para detección de blancos en una tarea de memoria de trabajo N-back. Las implicaciones clínicas de estos cambios no son conocidos y garantiza el futuro estudio.
Reconocimientos
Agradecemos a Mónica Delvy, George Hayner, Sarah Bednarksi, y Emily Erdman por su ayuda en la coordinación de este estudio.