Extracto
Antecedentes
uniones adherentes consisten en cadherinas transmembrana, que interactúan de forma intracelular con p120ctn, ß-catenina y α-catenina. p120ctn se sabe que regulan la adhesión célula-célula mediante el aumento de la estabilidad cadherina, pero los efectos de otros componentes de unión adherente sobre la adhesión célula-célula no se ha comparado con la de p120ctn.
Metodología /Principales conclusiones
Nos muestran que el agotamiento de p120ctn por pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el cáncer de próstata DU145 y las células epiteliales de mama MCF10A reduce los niveles de expresión de las proteínas de unión adherente, e-cadherina, P-cadherina, ß-catenina y α-catenina, e induce la pérdida de la adhesión célula-célula. p120ctn células-agotado también han aumentado la velocidad de migración y la invasión, que se correlaciona con un aumento de Rap1 pero no la actividad Rac1 o RhoA. Regulación a la baja de P-cadherina, β-catenina y α-catenina pero no E-cadherina induce una pérdida de adhesión célula-célula, aumento de la migración y la invasión mejorada similar a p120ctn agotamiento. Sin embargo, sólo el agotamiento p120ctn conduce a una disminución en los niveles de otras proteínas de unión adherente.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos indican que P-cadherina, pero no E-cadherina es importante para mantener adherens uniones en DU145 y células MCF10A, y que el agotamiento de cualquiera de las proteínas cadherina-asociado, p120ctn, ß-catenina o α-catenina, es suficiente para romper uniones adherentes en las células DU145 y aumentar la migración y la invasión de células de cáncer.
Visto: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn y P-cadherina, pero no e-cadherina Regular la motilidad celular y la invasión de cáncer de próstata DU145 células. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10.1371 /journal.pone.0011801
Editor: Robin Charles Mayo, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: February 2, 2010; Aceptado: June 29, 2010; Publicado: 27 Julio, 2010
Derechos de Autor © 2010 Kuemper, Ridley. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Cancer Research UK, Fundación Bettencourt-Schueller, y una Comisión Europea Marco 6 contrato (LSHG-CT-2003-502935; MAIN). SK fue apoyado por una beca de doctorado del Kings College de Londres Escuela de Ciencias Biomédicas y de la Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante la metástasis, las células cancerosas normalmente adquieren la capacidad de migrar e invadir los tejidos mediante el control de su interacción con otras células y su entorno extracelular. Muchos estudios muestran que las alteraciones en la adhesión célula-célula se correlaciona con la progresión tumoral y la metástasis epitelial [1]. Las células cancerosas pueden invadir ya sea como células individuales o colectivamente como grupos de células [2], [3], [4]. Ambos tipos de invasión implican la interrupción del epitelio que por lo general requiere un debilitamiento de los contactos célula-célula y un cambio en la forma celular. Las cadherinas y cateninas forman uniones adherentes, que son mediadores centrales de adhesión célula-célula. La expresión de proteínas de unión adherente a menudo se disminuyó en los tumores, y la reconstitución de adherentes funcionales uniones puede revertir el fenotipo invasivo de las células cancerosas [5], [6], [7].
Las cadherinas clásicas (E-, VE-, N y P-cadherina) son las proteínas transmembrana central del complejo de unión adherente y median Ca
2 + -dependiente homofílicas interacciones intercelulares. β-catenina y se unen plakoglobina /γ-catenina a cadherina dominios intracelulares de una manera mutuamente excluyentes y α-catenina a su vez se une a ß-catenina [8]. p120-catenina (p120ctn) por otro lado se une a una región diferente de cadherinas de ß-catenina [9], [10], [11], [12], [13], [14]. La composición de proteínas del complejo de unión adherente depende del tipo celular y la expresión de cadherina. α-catenina proporciona un vínculo importante entre las uniones adherentes y el citoesqueleto de actina. Su interacción con los filamentos de actina Sin embargo, parece ser mutuamente excluyentes para su unión a ß-catenina que sugiere un vínculo indirecto entre las salidas y el citoesqueleto de actina [15], [16].
p120ctn se ha encontrado para regular adherentes la estabilidad de la unión
in vitro
[17], [18], [19] y
in vivo
[20], [21], [22]. Su agotamiento por RNAi conduce a una disminución en las proteínas de unión adherentes y suprime la adhesión célula-célula [17], en parte por el aumento de la endocitosis y la degradación de cadherina [19], [23]. p120ctn también afecta a la actividad de las pequeñas GTPasas RhoA, Rac1 y Cdc42 en algunos tipos de células [24], [25], [26], [27], que desempeñan un papel central en la regulación de la dinámica del citoesqueleto, la formación y mantenimiento de adherentes cruces y la migración celular [28], [29]. por lo tanto, se puede vincular p120ctn uniones adherentes y Rho GTPasas.
Los efectos de p120ctn sobre la migración celular y la invasión varían en función del tipo de células, condiciones de ensayo y los tipos de cadherinas expresaron [30], [31], [32] . No está claro en qué medida los efectos de p120ctn están mediadas a través de las uniones adherentes o Rho GTPasas. Para hacer frente a esto, hemos derribado p120ctn en células de cáncer de próstata DU145 y células epiteliales mamarias MCF10A, los cuales normalmente tienen las uniones adherentes que contienen E-cadherina y P-cadherina. En ambos tipos de células agotamiento de p120ctn conduce a la interrupción de los contactos célula-célula, regulación a la baja de las proteínas adherentes de unión y el aumento de la motilidad celular. Curiosamente, la caída de p120ctn no afectó a los niveles de actividad de Rho GTPasas Rac1 y RhoA pero condujo a un aumento en Rap1 activo. Por primera vez, hemos derribado cadherinas, así como catenina y demostrar que P-cadherina, β-catenina y α-catenina, pero no agotamiento de E-cadherina imitan los efectos de la supresión p120ctn y conducen a una pérdida de los contactos célula-célula y una mayor invasión.
resultados
supresión de la expresión p120ctn conduce a la regulación a la baja de las proteínas de adhesión célula-célula y la interrupción de los contactos célula-célula
para investigar los efectos de p120ctn en células adherencia células beta, se compararon los efectos del agotamiento p120ctn en dos líneas celulares diferentes que tienen uniones adherentes, la línea celular de cáncer de próstata humano DU145 y la línea de células epiteliales mamarias MCF10A humano. células DU145 y MCF10A forman contactos célula-célula y se expresaron tanto E- y P-cadherina, que localiza en contactos célula-célula (Fig. 1A, B). células DU145 y MCF10A predominantemente expresan dos isoformas p120ctn que, en función de su peso molecular, se prevé que ser isoformas 1 y 3 [33] con la isoforma 3 (banda inferior) que se expresa en niveles ligeramente más altos (Fig. 1).
células DU145 (a) y (B) MCF10A fueron transfectadas con siRNAs para p120ctn (p120ctn (1), (2)), el control de siRNA o con el reactivo de transfección única (simulacro). Después de 72 h, las células se fijaron y se tiñeron para F-actina, p120ctn y E-cadherina o P-cadherina (paneles de la izquierda), o se lisaron y analizaron por inmunotransferencia para las moléculas de adhesión célula-célula indicados y la eficiencia desmontables p120ctn (paneles de la derecha) . Barras de escala = 25 m. ERK se utilizó como control de carga para las inmunotransferencias.
Desmontables de p120ctn con dos diferentes siRNAs en células DU145 y MCF10A inducidas rotura de la adhesión célula-célula que resulta en un fenotipo 'dispersos' (Fig. 1, Figura 2). Además, las células DU145 de forma estable empobrecido de p120ctn no tenían adherens estable de unión (Fig. S1). Este fenotipo fue específicamente debido al agotamiento p120ctn, ya que la expresión de shRNA resistentes p120ctn ratón (GFP-fusión) la formación de salida rescatado, como se determina por la localización de p120ctn y E-cadherina (Fig. S1).
DU145 ( a, C, D) y MCF10A (, células B C) fueron transfectadas con siRNAs para p120ctn (p120ctn (1), (2)), siRNA para e-cadherina (e-cadherina), Control de siRNA (control) o con transfección Sólo reactivo (simulacro). Después de 56 h, las células se controlaron mediante microscopía de lapso de tiempo, la adquisición de una imagen cada 10 min durante un período de 16 h. Los ejemplos representativos de imágenes de contraste de fase de células de las películas (paneles de la izquierda) y pistas de migración (paneles de la derecha; punto de comenzar cada celda se representan en la intersección de x e y ejes) se muestran para empobrecido p120ctn control transfectadas y células DU145 (A) y (B) MCF10A. Barras de escala = 50 m. (C, D) velocidades de migración se representan como caja y bigote gráficas que muestran la mediana, rango intercuartil (cajas) y más alto y los valores más bajos (filamentos). (C) las velocidades de migración de las células DU145 y MCF10A. (D) velocidades de migración de las células de control DU145 en colonias en comparación con las células individuales. Los datos proceden de tres experimentos diferentes, cada uno llevaba a cabo por duplicado, el análisis de 15 células por campo (~ 90 células en total). *** P & lt; 0,001, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
Tanto la cadherina E y P-cadherina, así como β- y α-catenina fueron regulados a la baja en p120ctn-agotado. Células. Regulación a la baja de las cadherinas en correlación con el grado de agotamiento p120ctn: a las 72 h después de la transfección con siRNAs dirigidos p120ctn, los niveles de p120ctn eran más bajos que en 48 h, y los niveles de E-cadherina fueron inferiores a las 72 h de 48 h (datos no mostrados)
p120ctn-agotado eran sin embargo no es probable que hayan sido objeto de transición epitelial a mesenquimal (EMT) como los niveles de proteínas marcadoras de EMT como la vimentina no se aumentó en comparación con el control transfectadas las células DU145 (datos no mostrados).
p120ctn regula la migración de las células DU145 y MCF10A
para probar si la migración celular se vio afectada por el agotamiento p120ctn, las células fueron controlados por microscopía de lapso de tiempo de más de 16 h (Fig. 2A, B) y un seguimiento de determinar su velocidad de migración. células DU145 y MCF10A p120ctn empobrecido en ambos migraron más rápido que las células de control (Fig. 2, Películas S1, S2, S3 y S4). Por el contrario, el agotamiento de E-cadherina no alteró la velocidad de migración de células (Fig. 2C), a pesar de que su nivel de expresión se redujo en p120ctn desmontables (Fig. 1). La velocidad de migración de las células de control se determinó a partir de células localizadas dentro de las colonias de células (Fig. 2C), pero algunas células en la población migró como células individuales (Películas S1 y S3). Sin embargo, no hubo diferencia en la velocidad de migración de las células DU145 en colonias o células individuales (Fig. 2D), descartando la posibilidad de que las células p120ctn-agotado migraron más rápido porque eran predominantemente células individuales en lugar de en colonias.
La migración celular se analizó también en los ensayos de cero-herida en monocapas confluentes de células DU145. La mayoría de las células p120ctn empobrecido migran como células individuales en la herida, mientras que las células de control migran como una hoja, manteniendo contactos célula-célula (Fig. 3A, Películas S5, S6). células p120ctn-agotado migraron más rápido que las células de control (Fig. 3B). Sin embargo, las células p120ctn-agotado mostraron una disminución en la persistencia (Fig. 3B), lo que indica que cambian de dirección con más frecuencia. Por lo tanto, a pesar del aumento de la velocidad de migración, el tiempo de cierre de la herida fue similar para controlar-transfectadas las células (Fig. 3C).
DU145 células fueron transfectadas con siRNAs para p120ctn (p120ctn (2)) y el control de siRNA (control) . Después de 56 h, una monocapa confluente fue herido con una punta de pipeta y células supervisado por microscopía de lapso de tiempo, la adquisición de una imagen cada 10 minutos durante un período de 16 horas. (A) Las imágenes de contraste de fase de células desde el primer cuadro de la película se muestran con o sin pistas representativos de células (7 /imagen; seguidos durante 16 h) superpuestas (Top imágenes). Además, las heridas de rascar de las células control y células p120ctn empobrecido se muestran a 0 h y 16 h después de la herida (paneles inferiores). Barras de escala = 50 m. velocidad (B) Migración (izquierda) y persistencia; se determinó (a la derecha de desplazamiento /longitud de la pista). velocidades de migración se representan como caja y bigote gráficas que muestran la mediana, rango intercuartil (cajas) y más alto y los valores más bajos (filamentos). (C) de la zona ocupada por las células en las heridas de arañazos se determinó a partir de imágenes de contraste de fase tomadas en diferentes puntos de tiempo a partir de películas. Los datos son de tres experimentos diferentes, cada uno realizado por duplicado, el análisis de 15 células por campo (~ 90 células en total). * P & lt; 0,05; *** P & lt;. 0,001, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
supresión de la expresión p120ctn conduce a una mayor actividad Rap1
La regulación de las actividades de Rho GTPasa por p120ctn tiene previamente ha correlacionado con un aumento de la motilidad celular [25], [26]. Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles de RhoA activa, Rac1 o Cdc42 entre las células DU145 de control transfectadas p120ctn-agotado y (Fig 4A, B;. Datos para Cdc42 no mostrados). Desde knockdown p120ctn indujo una pérdida de contactos célula-célula y la GTPasa Rap1 ha sido previamente asociado con la estabilización de E-cadherina en la membrana plasmática y para ser activado después de E-cadherina desacoplamiento [34], se analizaron los niveles de Rap1 activos. células DU145 p120ctn-agotado mostraron niveles de actividad Rap1 aumentaron (Fig. 4A, B).
células DU145 fueron transfectadas con siRNAs para p120ctn (p120ctn (1), (2)), Control de siRNA (control) o con el reactivo de transfección única (simulacro). Después se lisaron 72 h las células y se incubaron con GST-Rhotekin-RBD, GST-PAK1-PBD o GST-Ral-GDS-RBD en perlas de glutatión para tirar hacia abajo RhoA activa, Rac1 y Rap1, respectivamente. Los lisados de células transfectadas de manera simulada incubadas con GTP? S para precargar GTPasas se utilizaron como control positivo para los ensayos de pulldown. inmunotransferencias (A) de ejemplo para ensayos de actividad GTPasa. los niveles de ERK en las inmunotransferencias se utilizaron como control de carga. Ponceau tinción de inmunotransferencias muestra los niveles de proteínas de fusión GST. (B) Los gráficos muestran los datos de 3 (RhoA, Rac1) o 4 (Rap1) experimentos independientes y los resultados se comparan con total de RhoA, Rac1, Cdc42 y normalizado con el control. Las barras de error representan SEM. * P & lt; 0,05, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
El agotamiento de las cadherinas, ß-catenina o α-catenina no afecta los niveles de expresión de otras proteínas de unión adherente
Desde el agotamiento p120ctn reduce los niveles de las proteínas de unión adherente e-cadherina, P-cadherina, ß-catenina y α-catenina (Fig. 1), se investigaron los efectos del agotamiento de cada una de estas proteínas en las uniones adherentes. células DU145 se transfectaron con 2 o 3 oligos siRNA diferentes para E-cadherina, P-cadherina, β-catenina, α-catenina y p120ctn (Fig. 5A). Se transfectaron
células DU145 con los siRNAs indicados para e-cadherina, P-cadherina, α-catenina y β-catenina, o con el control de siRNA (control), o reactivo de transfección únicamente (mock). (A) Después de 72 h las células se lisaron y los niveles de proteína de las proteínas indicadas analizó por inmunotransferencia. Total de los niveles de proteína ERK o GAPDH fueron utilizados como control de carga. (B) Los gráficos muestran los niveles de proteína de P-cadherina, E-cadherina, α-catenina y p120ctn siguiente desmontables de las proteínas indicadas, cuantificados en los escaneos Odisea de inmunotransferencias (izquierda) o desmontables β-catenina, cuantificados por densitometría (derecha), de 4 experimentos independientes. Los resultados son normalizados a controlar. Las barras representan SEM. *** P & lt; 0,001, ** p & lt; 0,01, * p & lt;. 0,05, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
Los niveles de expresión de cada una de estas proteínas se determinaron entonces mediante la cuantificación de inmunotransferencias. Los niveles de P-cadherina, β-catenina, α-catenina y proteínas p120ctn no se vieron afectados por el agotamiento de E-cadherina (Fig. 5A, B). Desmontables de P-cadherina niveles de E-cadherina, ß-catenina y α-catenina redujo ligeramente, pero no p120ctn, pero esto sólo se observó para siRNA oligo (1) que dio el más fuerte (& gt; 80%) el agotamiento de P-cadherina . Otros dos oligos que redujeron los niveles de P-cadherina por ~ 50% no afectó a los niveles de otras proteínas de unión. ß-catenina o el agotamiento α-catenina no alteró los niveles de otras proteínas de la unión adherentes significativamente (Fig. 5). Por lo tanto, sólo es el agotamiento p120ctn que resulta en una disminución de los niveles de todas las otras moléculas de adhesión célula-célula (Fig. 5B).
represión de p120ctn, P-cadherina, β-catenina y α-catenina pero no e-cadherina conduce a la interrupción de los contactos célula-célula y mejora la invasión de células de cáncer de
Desde regulación a la baja de p120ctn condujo a una pérdida de las uniones célula-célula y un aumento en la velocidad de migración de las células, los efectos de ozono otra se investigaron las proteínas de unión adherens en la adhesión célula-célula y la motilidad celular. Desmontables de E-cadherina, P-cadherina, ß-catenina y α-catenina por RNAi fue altamente eficiente, tanto dentro de las colonias y en las células individuales, como se observa por inmunofluorescencia, pero no afectó visiblemente los niveles p120ctn (Fig. 6).
células DU145 (a) se transfectaron con los siRNAs indicados para la E-cadherina, P-cadherina, β-catenina, α-catenina, controlar siRNA (control) o con el reactivo de transfección única (simulacro). Después de 72 h, las células se fijaron y se tiñeron para P-cadherina, E-cadherina, β-catenina, α-catenina y p120ctn correlacionar fenotipos caída con la expresión de proteínas abatidos. Las barras de escala = 25 micras.
La caída de la P-cadherina, β-catenina y α-catenina por cada una de 2 diferentes siRNAs (o 3 para P-cadherina) dio lugar a la interrupción de la célula-célula contactos, similar a la depleción de p120ctn (Fig. 6, Fig. S2, Fig. S3). En particular, los tres siRNAs 1, 2 y 3 de segmentación P-cadherina pérdida de contactos célula-célula inducida, a pesar de que reducen los niveles de P-cadherina en cantidades diferentes (Fig. 5, Fig. 6, Fig. S3). Por el contrario, desmontables de E-cadherina en células DU145 no indujo una pérdida de contactos célula-célula (Fig. 2C, Fig. 6, Fig. 7).
células DU145 se transfectaron con los siRNAs indicados para e-cadherina, P-cadherina, β-catenina, α-catenina y p120ctn, con control de siRNA (control) o reactivo de transfección únicamente (mock). 56 h después de la transfección, las células se controlaron mediante microscopía de lapso de tiempo, la adquisición de una imagen de contraste de fase cada 10 min durante un período de 16 h. se muestran ejemplos representativos de imágenes de contraste de fase en las vías de migración de inicio y después de 16 h. Barras de escala = 25 m. velocidad (B) La migración se determinó usando ImageJ software. El análisis de la velocidad de migración es representado como caja y bigote gráficas que muestran la mediana, rango intercuartil (cajas) y más alto y los valores más bajos (filamentos). Los datos son de al menos 50 células de tres experimentos diferentes. *** P & lt;. 0,001, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
Las células agotadas de cada proteína de unión adherentes fueron rastreados desde películas timelapse para determinar su velocidad de migración (Fig. 7). Al igual que el agotamiento p120ctn, desmontables de P-cadherina, β-catenina y α-catenina condujo a un aumento en la velocidad de migración de células, similar a los resultados obtenidos con el agotamiento p120ctn, mientras que el agotamiento de E-cadherina no alteró la velocidad de migración (Fig. 7). Del mismo modo P-cadherina, pero no agotamiento de E-cadherina en las células MCF10A llevaron a la interrupción de los contactos célula-célula y el aumento de la velocidad de migración (Fig. 8).
(A) MCF10A células fueron transfectadas con siRNAs los indicados para E -cadherin, P-cadherina o con el control de siRNA (control). Después de 72 h, las células se fijaron y se tiñeron para F-actina y p120ctn. Barras de escala = 25 m. (B) 56 h después de la transfección, las células se controlaron mediante microscopía de lapso de tiempo, la adquisición de una imagen de contraste de fase cada 10 min durante un período de 16 h. velocidad de migración se determinó usando ImageJ software. El análisis de la velocidad de migración es representado como caja y bigote gráficas que muestran la mediana, rango intercuartil (cajas) y más alto y los valores más bajos (filamentos). Los datos son de al menos 50 células de tres experimentos diferentes. *** P & lt;. 0,001, en comparación con el control y determinado por la prueba t de Student
Sobre la base de los cambios en la adhesión célula-célula y la velocidad de migración observados, los efectos de p120ctn, E-cadherina, se investigó P-cadherina, β- y α-catenina en la invasión a través de Matrigel. Desmontables de p120ctn con dos diferentes siRNAs aumento de la invasión a través de Matrigel, mientras que el agotamiento de E-cadherina no afectó la invasión (Fig. 9A, B). La caída de P-cadherina en el otro lado condujo a un aumento en la invasión similar al agotamiento p120ctn (Fig. 9). El agotamiento de β-catenina, así como α-catenina indujo un aumento en la invasión similar a p120ctn y P-cadherina. Para descartar la posibilidad de que las diferencias en el número de células en la parte inferior de los cultivos polarizados cubiertos-Matrigel se deben a la proliferación celular alterada, las células se contaron 48 h después de que habían sido transfectadas con siRNAs. No se observaron cambios en el número de células en comparación con las células control siRNA-transfectadas (Fig. 9C). En conclusión, desmontables de P-cadherina, β-catenina y α-catenina pero no E-cadherina induce una interrupción de los contactos célula-célula y un aumento en la migración de células de cáncer y la invasión similar a la caída de p120ctn.
células DU145 se transfectaron con los siRNAs indicados para p120ctn, P-cadherina, e-cadherina, α-catenina y β-catenina, con el control de siRNA (control) o reactivo de transfección únicamente (mock). Después se sembraron 55 h las células en insertos de membrana Transwell que contienen una capa de Matrigel. FCS fue utilizado como un quimioatrayente en la cámara inferior. Los ensayos se detuvieron después de 17 h mediante la fijación de las células en la parte inferior de los insertos de membrana utilizando cristal violeta. Imágenes de ocho diferentes condiciones de visibilidad fueron adquiridas y las células en todas las imágenes cuentan y se analizaron. Los gráficos (A) muestran datos de tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Los resultados son normalizados a controlar. Las barras representan SEM. ** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05, comparado con el control, determinado por la prueba t de Student. (B) Imágenes representativas de las células en la parte inferior de las membranas Transwell. Barras de escala = 50 m. (C) 48 h después de la transfección las células se contaron y se compararon con siCONTROL. Los gráficos muestran los datos de al menos tres experimentos independientes. Los resultados son normalizados a controlar. Las barras representan SEM.
Discusión
p120ctn expresión es frecuentemente pierde o downregulated en una gran variedad de cánceres humanos [35] y la disminución de los niveles de p120ctn se correlacionan con el grado del tumor [36], [37], [38], [39]. Hemos demostrado aquí que el agotamiento de p120ctn en E-cadherina y células DU145 y MCF10A-expresan cadherina P interrumpe contactos célula-célula, y aumenta la migración y la invasión de células DU145, el apoyo a un modelo en el que p120ctn actúa como una invasión o metástasis supresor [48]. Estos efectos se correlacionó con disminución de la expresión de las proteínas de unión adherente E-cadherina, P-cadherina, ß-catenina y α-catenina. Sin embargo, sólo la regulación negativa de la P-cadherina y E-cadherina no fue capaz de inducir un fenotipo similar al p120ctn agotamiento, lo que indica que la E-cadherina no está obligado a mantener la adhesión célula-célula en las células DU145 o MCF10A.
en contraste con los resultados, se ha informado p120ctn ser necesario para la invasión de las células E-cadherina-deficiente en parte mediante la estabilización de las cadherinas mesenquimales N-cadherina o cadherina-11, que son conocidos para promover la invasión [32]. Por otro lado la invasión colectiva de E- y células A431 P-expresan cadherina fue inhibida cuando los contactos célula-célula se rompieron ya sea por caída p120ctn o la caída simultánea de E-cadherina y P-cadherina [35]. En estos estudios HGF o EGF, respectivamente, se utilizaron como quimioatrayentes en ensayos de invasión y la migración, mientras que se utilizó suero. Una posibilidad es que p120ctn podría contribuir específicamente a HGF /migración inducida por EGF o invasión, ya que previamente se ha relacionado con HGF- o dispersión celular inducida por EGF [40].
p120ctn se ha demostrado que estimula Rac y actividad /o Cdc42 y /o inhibir la actividad de RhoA en células que carecen de e-cadherina, incluyendo los fibroblastos y las líneas celulares de cáncer [32], [41]. En contraste, se encontró que en las células DU145, que expresan P- y E-cadherina, pero no N-cadherina, el agotamiento de p120ctn no afectó a la actividad de RhoA y Rac1. Del mismo modo, en la E-cadherina /P-cadherina-expresión de las células A431, el agotamiento p120ctn no alteró la actividad de RhoA /Rac1 [31].
En conjunto, estos resultados indican que los efectos de p120ctn sobre las actividades de Rho GTPasa son tipo de células específicas. Esto podría ser debido a diferencias en la composición de los complejos p120ctn, por ejemplo, complejos que contienen GEFs que podrían activar Rac1 /Cdc42 o BPA para regular a la baja RhoA [26], [41]. Curiosamente, en MDA-MB-231 células de cáncer de mama, la activación de Rac por p120ctn requiere cadherina vinculante [32], lo que sugiere que las cadherinas mesenquimales podría contribuir específicamente a la actividad de Rac. Aunque la actividad GTPasa Rho no fue afectada por p120ctn, se encontró que la actividad Rap1 se incrementa en las células DU145 p120ctn-agotado. Rap1 es un regulador importante de las uniones célula-célula, y se activa por acoplamiento E-cadherina [42], [43]. La interrupción de uniones adherentes por el agotamiento de calcio extracelular también induce un aumento en la actividad de Rap1 [44]. Nuestros resultados con el agotamiento p120ctn son consistentes con la hipótesis de que la endocitosis de la E-cadherina aumenta la actividad Rap1 [44].
Sorprendentemente, la caída de la P-cadherina, β- y α-catenina, pero no la E-cadherina llevó a la interrupción de los contactos célula-célula. Presumiblemente sustitutos P-cadherina para la E-cadherina que mantendrán los contactos célula-célula, pero no para la E-cadherina P-cadherina. Esta hipótesis está apoyada por estudios en células MDCK, donde se ha demostrado que la E-cadherina es importante sólo para el establecimiento, pero no el mantenimiento de los contactos célula-célula, mientras que se requiere α-catenina para mantener contactos célula-célula [45]. Además, el agotamiento de P-cadherina solo se informó para inducir la pérdida de los contactos célula-célula y regulación a la baja de los niveles de E-cadherina en las células MCF10A [46] y la sobreexpresión de P-cadherina en-231 MDA-MB células de cáncer de mama reducción de la migración celular y la la invasión [47]. En el cáncer de la mayoría de los estudios se han concentrado en la relación entre la regulación a la baja de E-cadherina y el aumento de la agresividad del cáncer y la invasión, aunque también hay indicios de que la P-cadherina afecta a la progresión del tumor. Por ejemplo, los niveles de P-cadherina están regulados a la baja durante la progresión del melanoma [48] y P-cadherina se pierde a menudo en cánceres de próstata [49]. En las células DU145, se encontró que el agotamiento de P-cadherina induce la pérdida de las uniones célula-célula sin afectar significativamente a los niveles de otras proteínas de unión adherente, que indica que es el principal cadherina requerido para la adhesión célula-célula en estas células.
La caída de interrupción β- y α-catenina también inducida de los contactos célula-célula y un aumento de la invasión pero no cambió los niveles de P-cadherina o proteínas p120ctn. Es posible que afectan a la localización de P-cadherina y /o p120ctn en lugar de los niveles. ß-y a-catenina se han notificado a afectar a la adhesión mediada por cadherina [15], [16], y el agotamiento de β-catenina en una línea celular de E-cadherina-deficientes dio lugar a una disminución de la invasión [50], pero hasta el momento se sabe poco sobre su papel en la migración y la invasión. β-catenina también tiene un papel importante en la señalización de Wnt-y la proliferación de células de cáncer que se cree que es independiente de su función cadherina [51].
Nuestros resultados demuestran que p120ctn regula los niveles de expresión de ß-y α catenina, así como cadherinas en células DU145. Puesto que hemos mostrado que la P-cadherina niveles son más importantes que la E-cadherina en el mantenimiento de adhesión célula-célula en las células DU145 y MCF10A, postulamos que el aumento de la migración y la invasión que observamos siguiente p120ctn, ß-catenina o knockdown α-catenina es ya sea debido a la disminución de la estabilidad P-cadherina o cambios en su localización.
Materiales y Métodos
siRNAs
Todos los siRNAs utilizados fueron obtenidos de Dharmacon (Fisher Scientific UK, Loughborough, REINO UNIDO). El siguiente objetivo p120ctn en-blanco
más
oligonucleótidos individuales fueron utilizados (CTNND1 (1) 5'-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 '; (2) 5'-GGACCUUACUGAAGUUA-3'), E-cadherina (CDH1 (1 ) 5'-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 '; (2) 5'GAGAACGCAUUGCCACAUA-3'), P-cadherina (CDH3 (1) 5'GUGACAACGUCUUCUACUA-3 '; (2) 5'-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3'; (3) 5 '-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3'), β-catenina (CTNNB1 (1) 5'-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3 ') y α-catenina (CTNNA1 (1) 5'-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3'; (2) 5'-GUGGAUAAGCUGAACAUUA-3 '). No director siRNA se utilizó como control en todos los experimentos (en el blanco#1 de control; 5'-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ').
Cultivo de células y transfections
células de cáncer de próstata DU145 eran crecido en RPMI suplementado con 10% FCS, 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. MCF10A células epiteliales mamarias se cultivaron en DMEM /F12 suplementado con 5% de suero de caballo, 100 UI /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 20 ng /ml de EGF, 0,5 mg /ml de hidrocortisona, 100 toxina ng /ml cólera y 5 g /ml de insulina. Las células se sembraron a 1,8 x 10
5 por pocillo en placas de 24 pocillos y inversa transfectadas con siRNAs (concentración final 20 nM) en medio libre de antibióticos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Después de 6-8 h, las células se volvieron a sembrar en el 2 × 10
4 células por pocillo (DU145) o 10
4 células por pocillo (MCF10A) para inmunofluorescencia y microscopía de lapso de tiempo y en 1 × 10
5 por pocillo (placa de 24 pocillos) para los ensayos de inmunotransferencia y los arañazos de la herida. Para la creación de las células DU145 p120ctn-agotado estables, se usó el sistema de vector pSUPERIOR (Oligoengine, Seattle, WA). La secuencia del oligo shRNA orientación p120ctn humano fue diseñado como se describe [52]. Un grupo de células estable que contiene el shRNA fue seleccionado en un medio que contiene 5 mg /ml de puromicina. Para los experimentos de rescate murino p120ctn-GFP [26], que no es sensible a la orientación shRNA p120ctn humana, se transfectó transitoriamente en células DU145 utilizando Amaxa nucleofection (Lonza, Colonia, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante (www.lonzabio.com) .
Immunoblotting
Las células cultivadas a aproximadamente el 80% de confluencia se lavaron una vez con PBS frío y se lisaron en ya sea frío 2 x tampón de muestra de SDS (Invitrogen) y se homogeneizó directamente con una aguja de 21G o en la lisis tampón (50 mM Tris pH 7,5, 1% de Triton-X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, NaCl 500 mM, mM MgCl 10
2, EDTA 2 mM, 10% de glicerol, mM Na 1
3Vo
4, NaF 25 mM, completa el mini inhibidor de la proteasa libre de EDTA (Roche, Welwyn Garden City, Reino Unido), PhosSTOP inhibidor de la fosfatasa (Roche)) y luego se aclaró por centrifugación. Los lisados se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de inmunotransferencia. Para Reprobing, membranas de PVDF se incubaron con stripping tampón (50 mM Tris HCl (pH 7,5), 100 mM β-mercaptoetanol, 2% SDS) durante 20 min a 65 ° C. Los anticuerpos primarios se utilizaron a una dilución de 1:1000: p120ctn (# 610134), E-cadherina (# 610182) se adquirieron de BD Biosciences (Oxford Reino Unido), P-cadherina (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) de Upstate (Millipore, Watford, Reino Unido), β-catenina (# C2206), α-catenina (# C2081) de Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido), ERK (# sc-94), RhoA (# sc -418) de Santa Cruz Biotechnology (Biotecnología Insight, Wembley, Reino Unido) y Rap1A /Rap1b (# 4938) a partir de Señalización celular (New England Biolabs, Hitchin, Reino Unido).