Extracto
La capecitabina (PAC) es un profármaco 5-FU aprobado para el tratamiento de varios tipos de cáncer y es se utiliza en combinación con gemcitabina (GEM) en el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma pancreático (PDAC). Sin embargo, los datos pre-clínicos limitados sobre los efectos de la PAC en PDAC están disponibles para apoyar el uso de la combinación GEMCAP en la clínica. Por lo tanto, se investigó la farmacocinética y la eficacia de la PAC como agente único primero y luego en combinación con GEM para evaluar la utilidad de la terapia GEMCAP en la clínica. Utilizando un modelo de PDAC espontánea ocurre en Kras
G12D; p53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) los ratones y los aloinjertos subcutáneas de una línea celular derivada de PDAC KPC (K8484), que mostró que la PAC logra concentraciones tumorales (~ 25 m) de 5-FU en ambos modelos, como agente único, y se indujo la supervivencia similar a GEM en ratones KPC, lo que sugiere una eficacia similar.
in vitro
estudios realizados en células K8484, así como en líneas de células pancreáticas humanas mostraron un efecto aditivo de la combinación GEMCAP Sin embargo, aumentó la toxicidad
in vivo
y ningún beneficio de una combinación GEMCAP tolerable fue identificado en el modelo de aloinjerto en comparación con GEM solo. Nuestro trabajo proporciona evidencia preclínica de entrega 5-FU a los tumores y la eficacia antitumoral después de la administración oral de CAP que era similar a efectos de GEM. Sin embargo, la combinación GEMCAP no mejora el índice terapéutico en comparación con GEM solo. Estos datos sugieren que la PAC podría ser considerado como una alternativa a GEM en el futuro, diseñados racionalmente, las estrategias de tratamiento de combinación para el cáncer de páncreas avanzado
Visto:. Courtin A, Richards FM, Bapiro TE, Bramhall JL, Neesse A, Cook, N, et al. (2013) Anti-tumor eficacia de capecitabina en un modelo de ratón Ingeniería genética del cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10.1371 /journal.pone.0067330
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 6 Febrero, 2013; Aceptado: 16-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Courtin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) a través del Programa de Grant C96 /A8333 a través de DJ y financiación CRUK Cambridge Group Leader Instituto de DJ y DT. Este trabajo también fue apoyado por la Universidad de Cambridge, la Fundación Li Ka Shing y por una donación de caridad a la Universidad de Cambridge desde Hutchison Whampoa Ltd.-El trabajo también fue apoyado por fondos del Centro de Investigación Biomédica INDH Cambridge (www.nihr .ac.uk). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. DJ ha recibido el apoyo de los ensayos clínicos de Roche y también ha sido miembro de un consejo de redacción para el sitio web de Xeloda (capecitabina). Este estudio fue financiado en parte por Hutchison Whampoa Ltd., bajo la forma de una donación al Instituto Cambridge CRUK que contribuyó al salario del DT. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. Todos los demás autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países industrializados. tasa de supervivencia global a los 5 años es menor del 5% [1]. El alto grado de mortalidad de los PDAC es atribuible a la falta de métodos de detección temprana y la escasa eficacia de las terapias existentes. Gemcitabina (GEM) es la terapia estándar, pero el tiempo medio de supervivencia sigue siendo sólo 5-7 meses en pacientes con enfermedad avanzada [2]. Por lo tanto, se requieren estrategias de tratamiento más eficaces
capecitabina. (Xeloda®; Hoffmann La Roche) es un carbamato de fluoropirimidina administrado por vía oral, se metaboliza en el hígado y tumor por carboxilesterasas y citidina deaminasa de 5'-desoxi-5-fluorocitidina (5'-DFCR) y 5'-desoxi-5-fluorouridina (5'-DFUR) respectivamente. El paso final de la activación de la capecitabina (CAP), la conversión de 5'-DFUR para citotóxico 5-fluorouracilo (5-FU), está mediada por la timidina fosforilasa [3] - [5], que se expresa más altamente en neoplásica de el tejido normal, haciendo CAP más específico de tumor de 5-FU [5], [6]. la eficacia antitumoral de la NAC se ha demostrado en numerosos estudios usando modelos de xenoinjerto de cáncer humano de mama, de colon, gástrico, cervical, de ovario de vejiga y cáncer de próstata (véase, por revisión [7]), pero sólo un estudio ha informado en un modelo de páncreas [8] y esto fue en un tipo salvaje KRAS xenoinjerto de células de cáncer pancreático atípico. En la clínica, la PAC está aprobado por la FDA como primera línea de terapia de agente único en pacientes con cáncer colorrectal metastásico y el cáncer de mama metastásico como agente único o en combinación con docetaxel después del fracaso de la quimioterapia basada en antraciclina previa. En pacientes con cáncer de páncreas completamente resecado, se ha demostrado que bolo intravenoso combinado de 5-fluorouracilo y ácido folínico (FUFA) es una terapia adyuvante activo y el uso de FUFA es equivalente a GEM cuando la supervivencia global es el punto final [9 ], [10]. En avanzado PDAC, en particular en el Reino Unido, CAP ha reemplazado FUFA y se utiliza en combinación con GEM (GEMCAP), basado en los resultados de la meta-análisis realizado por Heinemann y col. mostrando un modesto pero significativo beneficio en la supervivencia de la combinación de GEM con una fluoropirimidina y sobre todo con la PAC [2]. Un estudio clínico reciente confirmó el beneficio de GEMCAP en pacientes no seleccionados con PDAC avanzada [11].
A la vista de los datos pre-clínicos limitados usando PAC en PDAC,
in vivo se llevaron a cabo estudios de
para evaluar CAP en un modelo de ratón genéticamente modificado de la enfermedad. Kras
G12D; p53
R172H; (KPC) ratones Cre-Pdx1 condicionalmente expresan mutantes de p53 endógeno Kras y alelos en células pancreáticas [12] y desarrollan tumores pancreáticos, que recapitula los aspectos fisiopatológicos y las características moleculares de PDAC humana [13]. También se utilizó un aloinjerto de una línea celular de cáncer de páncreas (K8484) aislado de un PDAC KPC. Los estudios de farmacocinética y eficacia se realizaron con CAP agente único y la combinación de GEM y CAP. Los estudios de la literatura sugieren una asociación entre la citidina deaminasa actividad de la enzima (CDA) y el riesgo de toxicidad en pacientes que reciben GEM o basada en CAP terapia [14], [15]. CDA está implicado en la activación de CAP a través de la desaminación de DFCR en DFUR pero es la inversa responsable de la desaminación de GEM en su metabolito inactivo dFdU [4], [5], [16], [17]. Debido a la toxicidad se observó con la combinación GEMCAP se cuantificó la actividad enzimática de CDA en el tejido tumoral.
Materiales y Métodos
Mouse cepas
KPC ratones desarrollan avanzada PDAC de 2 a los 3 meses y tienen una mediana de supervivencia acortada de aproximadamente 5 meses [12], [18]. Sus compañeros de camada de control, Kras; p53
R172H; -Cre Pdx1 (PC) ratones también se utilizaron en este estudio para trasplantar subcutáneamente la línea de células K8484. Por lo tanto, todos los experimentos se realizaron con ratones de la misma //6 fondo mixto 129 SvJal /C57BL genética. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de 1986 con la aprobación del Comité de Ética Animal locales, y siguiendo las directrices de 2010 del Comité de Coordinación del Reino Unido sobre la Investigación del Cáncer [19] Animales (Procedimientos Científicos del Reino Unido).
Líneas celulares
La línea celular K8484 se estableció a partir de un tumor KPC PDAC por Olive et al. [18], [20]. Las células se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS). Las líneas celulares de cáncer pancreático humano Panc-1 y MiaPaCa-2 se obtuvieron de ECACC (Salisbury, Reino Unido) y se cultivaron en DMEM con 10% de FBS. La identidad de todas las líneas celulares humanas fueron verificados por genotipo STR y resultaron negativos a micoplasma.
Ensayo de citotoxicidad
citotoxicidad de drogas
in vitro
fue evaluada por los medios de Sulforodamina B colorimétrico (SRB) ensayo. Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se dosifican con una gama de concentraciones de 5-FU (0,03 M a 30 M) en filas y gemcitabina (3 × 10
-4 M a 0,3 M) en las columnas, dando una cuadrícula de 8 × 8 combinaciones de concentración. Después de 72 h de incubación a 37 ° C, se fijaron las células (ácido tricloroacético al 3%, 90 minutos, 4 ° C), se lavó en agua y teñidas con un SRB 0,057% de solución (Sigma) en ácido acético (w /v) por 30 minutos. Las placas se lavaron (ácido acético al 1%, 4 veces), y el colorante unido a proteína se disolvió en una solución de base Tris 10 mM (pH 10,5). Se midió la fluorescencia utilizando Tecan Infinito M200 lector de placas (excitación 488 nm, emisión 585 nm). El% de inhibición del crecimiento (GI) en comparación con células de control de disolvente tratados se calculó para cada combinación de concentración de fármaco.
Se evaluó el efecto de la combinación con el modelo de la dicha Independance [21], [22] de acuerdo con el protocolo hemos descrito previamente [23]. En resumen, un modelo de aditividad se construyó sobre la base de datos del agente individuales de 5-FU y GEM. GI valores obtenidos a partir de este modelo fueron entonces restados de los valores experimentales para identificar regiones de sinergia y antagonismo. Los números negativos muestran menos efectos aditivos (color entre amarillo y rojo) y los números positivos indican mayor que el efecto aditivo (de verde a azul).
Preparación de Drogas
polvo de Capecitabina (Sequoia Research) se volvió a suspender en un 40 mM de tampón de citrato y 5% de goma arábiga a 100 mg /ml y se administra por sonda oral. hidrocloruro de gemcitabina (Tocris Bioscience) se disolvió en solución salina a 20 mg /ml y se administró mediante inyección intraperitoneal.
Farmacocinética y estudios de eficacia en K8484 aloinjerto Modelo
bilaterales aloinjertos K8484 fueron obtenidos por inyección subcutánea de 10
6 células por flanco. Para los estudios farmacocinéticos, los ratones portadores de tumor aloinjerto fueron tratados con una dosis única de CAP a 755 mg /kg y las muestras se recogieron 10 min, 20 min, 40 min, 1 h, 2 h y 4 h después, tres animales por punto de tiempo. La sangre se recogió en heparina de litio, y se aisló el plasma y se almacenó a -80 ° C. El hígado y los tumores se retiraron y se congelaron en nitrógeno líquido.
En los estudios de eficacia de la PAC, los ratones fueron tratados con NAC en 755 mg /kg o vehículo durante 5 días consecutivos por semana durante 3 semanas. En GEMCAP estudio de eficacia de la combinación, los ratones recibieron dosis de gemcitabina a 75 mg /kg, cada 3 días, solos o en combinación con dosis orales de la PAC a 539 mg /kg durante 5 días de la semana. Los tumores se midieron utilizando por pinzas. El volumen del tumor se calculó de la longitud x anchura
2 × π /6.
Eficacia y Survival Study en KPC modelo de ratón
La inscripción de los ratones del CPK en estudio se basó en el tamaño del tumor, medido por ecografía en una orientación axial. Los ratones con una media de diámetros de los tumores PDAC de 6-9 mm se inscribieron. Para el estudio de eficacia a corto plazo, los ratones fueron tratados con NAC en 755 mg /kg o vehículo durante 7 días consecutivos. Durante el tratamiento, los ratones fueron imágenes en dos ocasiones por imágenes de ultrasonido de alta resolución utilizando el Sistema de Vevo 770 (Visual Sonics, Inc) [24] y los volúmenes tumorales fueron cuantificados [18]. En el día 7, los ratones fueron asesinados 2 h después de la dosis de la PAC. Plasma, tumor y el hígado se recogieron como anteriormente. Para el estudio de supervivencia, los ratones fueron matriculados, y la imagen cada 3 días, mientras que el tratamiento con NAC en 755 mg /kg durante 5 días consecutivos por semana o con la gema a 100 mg /kg cada 3 días hasta que se alcanzaron los criterios de punto final. Estos incluyen el desarrollo de ascitis abdominal, caquexia severa, pérdida de peso significativa (cercana al 20%) del peso inicial o debilidad extrema o inactividad.
La inmunohistoquímica
, parafina cortes de tejido fijados con formol eran teñidas utilizando anticuerpos fosfato histonas H3 (Upstate,#06-570) y se detectó usando sustrato de peroxidasa DAB (vector Labs). Se obtuvieron imágenes de tinción y se cuantificó usando el sistema Ariol (Leica Microsystems). Un mínimo de 3 campos por tumor fueron cuantificados. PH3 células positivas se definieron como los que tienen la tinción positiva de la cromatina condensada.
GEMCAP combinación de tolerancia Estudios
ratones de PC que llevan los aloinjertos de células K8484 fueron tratados con GEM a 100 mg /kg o 75 mg /kg cada 3 días solos o en combinación con la PAC a 755 mg /kg o 539 mg /kg o 378 mg /kg, 5 días consecutivos por semana y fueron asesinados si los signos clínicos se acercaron a los límites permitidos (que incluían diarrea, hemorragia y pérdida de peso se aproxima 20%). Se utilizaron dos animales por dosis. La respuesta tumoral se evaluó mediante la medición diaria de los tumores con calibradores.
Determinación de la capecitabina y el metabolito concentraciones en plasma, hígado y tumores
PAC, DFCR, DFUR y 5FU se determinaron tanto en el plasma y tejidos usando una versión modificada del protocolo publicado anteriormente [25]. Brevemente, las muestras de tejido se homogeneizaron usando un homogeneizador Precellys 24 con cojinetes de bolas pequeñas (Kit Precellys MK28-R) durante 2 x 50 segundos a 6 000 rpm en helado de 50:50 acetonitrilo: agua (v /v) que contiene 25 g /ml tetrahidrouridina (Promega) para hacer una concentración final de 50 mg de tejido por ml. Cincuenta l de homogeneizado se transfiere a un tubo limpio prespiked con 200 l de acetonitrilo enfriado con hielo que contienen /marcado (SIL) estándares internos estables ml 50 ng de los 4 analitos (Toronto Investigación de Productos Químicos). Después de centrifugación a 20.000 g durante 5 minutos, el sobrenadante se evaporó hasta sequedad, se resuspendió en 100 l de agua y se inyectó en la LC-MS /MS. Para muestras de plasma, 50 l de plasma se precipitó con 150 l de acetonitrilo que contiene 50 ng /ml de normas estables etiquetados internos y se procesa de manera similar.
La detección se logra por LC-MS /MS utilizando un espectrómetro de masas TSQ Thermo Vantage con una sonda HESI-II que opere en modo positivo y negativo a un voltaje de pulverización de 3 kV y la temperatura del vaporizador de 325 ° C. La detección de los iones se realizó en el modo de monitorización de reacción múltiple, específico para cada compuesto. Las concentraciones de capecitabina y sus metabolitos en las muestras se determinaron por comparación con las líneas de calibración construida usando patrones de referencia auténticos.
CDA actividad enzimática
Para preparar la matriz de enzima en bruto, el tejido tumoral se homogeneizó en 500 l de 0,1 M Tris-HCl pH 8 tampón durante 2 x 50 segundos a 6.000 rpm usando un homogeneizador Precelly. lisados tumorales se centrifugaron a continuación durante 10 minutos a 14.500 rpm a 4 ° C, los sobrenadantes se decantaron y el contenido de proteína se midió usando el ensayo de proteínas DC-BIORAD.
Para el ensayo de actividad de la enzima CDA, las soluciones madre se prepararon en GEM agua. Para cada reacción, 20 l de extracto de enzima tumor se mezcló con 170 l 0,1 M Tris-HCl, 50 mM β-mercaptoetanol y 10 l de la solución de gemcitabina de stock apropiado para hacer concentraciones finales de sustrato GEM de 50 mM a 5000 mM. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 30 minutos, la reacción se detuvo mediante la adición de 600 l de acetonitrilo y 50 l de 13C interna estándar DFDU-
,
15N
2 se añadió a cada muestra. El mismo protocolo se utilizó para preparar una curva estándar dFdU que van desde 2,5 ng /ml a 5000 ng /mL, así como alta (3.500 ng /ml), medio (200 ng /ml) y baja (/ml 37,5 ng) de control de calidad normas dFdU.
Todas las muestras se mezclaron y se centrifugaron a 5000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C. 200 l de sobrenadante se transfirieron en una placa de 96 pocillos y se evaporaron a sequedad. Las muestras fueron luego reconstituyeron en 200 l de agua, agitaron durante 5 minutos y el dFdU se cuantificó mediante LC-MS /MS y se normalizó a las concentraciones de proteína total.
El
in vitro
ensayo de competición en la era realizado en un extracto de la enzima a partir de un tumor de aloinjertos sin tratar utilizando el protocolo descrito anteriormente. El extracto enzimático se mezcló con una concentración fija de 1.800 GEM mu M, que corresponde a la Km de CDA en este extracto de enzima, y las dosis que van de DFCR (0 a 1,200 M) como competidor. El dFdU convierte de GEM se cuantificó mediante LC-MS /MS.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.0. Importancia de las diferencias en la eficacia antitumoral de la PAC, CDA Vmax y Km para la PAC frente al vehículo se determinó usando un ensayo t no apareado. En estudios de tolerancia y de la combinación GEMCAP, la distinción en crecimientos tumorales se analizaron mediante un ANOVA de una vía seguido de un comparaciones múltiples post-test de Newman-Keuls.
Resultados
farmacocinética y farmacodinámica de la PAC y su metabolitos en tejidos de ratón
Para investigar la farmacocinética de la PAC y sus metabolitos, se analizaron mediante espectrometría de masas de los homogeneizados de plasma, tumor y el hígado de los ratones portadores de tumor K8484 aloinjerto recogidos en diferentes puntos de tiempo después de una sola dosis de la NAC dado por vía oral a 755 mg /kg (2,1 mmol /kg /día). Esta dosis es la dosis equivalente humano, determinado de acuerdo con el método de Reagan-Shaw et al [26]. PAC, DFCR y DFUR se encontraron en los 3 tejidos en cada punto de tiempo (Figura 1). Plasma C
MAX DFCR fue 393 ± 27 M (20 minutos) y para DFUR 125 ± 90 M (40 minutos) (Figura 1A). En el tejido tumoral, DFCR y DFUR C
máx fueron 256 ± 7 M y 101 ± 7 M, respectivamente, 45 minutos después de la administración de la PAC y cayó a 64,4 ± 45,3 micras y 46,4 ± 28,1 M después de 4 h (Figura 1B). En el hígado, C
max para todos los metabolitos se alcanzaron 10 min después de la administración y luego disminuyó progresivamente (Figura 1C). Las concentraciones de hígado DFCR fueron más altos que en el tumor de los mismos ratones y el hígado concentraciones DFUR eran más bajos, en consonancia con las distribuciones ya se ha informado de CES y CDA en los tejidos [5]. Las concentraciones intra-tumorales de 5-FU aumentó progresivamente desde el 12,7 ± 3,7 mM después de 10 minutos a 49,5 M después de 1 hora y cayeron a 10,7 ± 3,4 M después de 4 h (Figura 1B). A medida que nuestra
in vitro
experimentos con células K8484 mostraron una CI
50 para el 5-FU de 2,56 ± 0,55 M (datos no mostrados), éstos
in vivo
resultados sugieren que una dosis oral CAP de dosificación suministra una dosis terapéuticamente eficaz a los tumores de aloinjerto. 5-FU niveles fueron más de 30 veces menor en el plasma (1,9 ± 0,5 mM a 40 min y 0,3 ± 0,2 mM después de 4 h) que en el tumor y estaban por debajo del límite de cuantificación en el hígado a partir de 2 h (Figura 1C). También se realizó un estudio farmacodinámico para determinar el efecto de una dosis única CAP 755 mg /kg sobre la proliferación en tumores de aloinjerto K8484. Los tumores se recogieron 40 min, 2 h y 4 h después de la dosificación y la inmunohistoquímica de fosfato histonas H3 (PH3) se cuantificó. tinción PH3 se redujo significativamente 4 h después de la administración (P & lt; 0,01; Figura 1D). comparación con el control, mostrando una disminución en el número de células mitótico después del tratamiento CAP
las concentraciones de metabolitos en el plasma (A), K8484 homogeneizados tumorales aloinjerto (B) y homogeneizado de hígado (C) después de una sola dosis de la NAC en 755 mg /kg. Media ± SD (n = 3, excepto en 45 min y 1 h, donde n = 2). (D) La inmunohistoquímica de fosfato histonas H3 (PH3) cuantificado en los tumores de aloinjerto KPC en diferentes puntos de tiempo después de una sola dosis CAP 755 mg /kg. Media ± SEM de al menos tres tumores (** P & lt; 0,01). concentraciones (E) de metabolitos en tejidos de ratón KPC 2 h después de la última dosis de 7 consecutivos de la PAC a 755 mg /kg, media y SEM de 6 ratones. concentraciones (F) 5-FU 2 h después de una sola dosis (línea continua) o cinco dosis consecutivas (línea discontinua) de la NAC (755 mg /kg) dadas a ratones con tumores de aloinjerto K8484.
se ha demostrado previamente que
In situ
tumores KPC PDAC son menos sensibles a GEM de aloinjertos KPC a pesar de su idéntica
Kras Opiniones y
p53
genotipos, y esta diferencia en la sensibilidad se atribuyó a la administración de fármacos limita a los tumores KPC [18]. Por lo tanto, se analizó la cantidad de PAC y metabolitos en los tejidos de los ratones portadores de tumores del CPK después de siete días de tratamiento PAC (755 mg /kg). En el plasma y el hígado PAC, DFCR, DFUR y las concentraciones de 5-FU fueron comparables entre los ratones del CPK y los anfitriones de aloinjertos 2 h después de la última dosis (Figura 1E). En los tumores KPC PDAC, las concentraciones de 5-FU fueron 26,9 ± 14,3 M (Figura 1E) en comparación con 23,0 ± 8,1 M en tumores de aloinjerto KPC, 2 horas después de una dosis única de la PAC (Figura 1B). Debido a la diferencia en el protocolo de estudio (7 dosis en ratones KPC frente a dosis única en los aloinjertos K8484), también comparamos los datos con los de un estudio PK independientes realizados después de 5 dosis diarias de CAP administrados en ratones portadores de aloinjertos K8484. En este estudio las concentraciones de 5-FU en tumor de 2 h después de la quinta dosis consecutiva de CAP fue de 22,7 ± 7,7 M (Figura 1F), equivalente a la concentración de 5-FU después de una sola dosis en el tumor de aloinjerto (Figura 1B) o después de 7 consecutiva dosis en tumores KPC (Figura 1E). Estos datos sugieren que dosis múltiples de CAP no condujeron a 5-FU acumulación en el tumor. Estos resultados muestran que la PAC orales entregado una cantidad similar de 5-FU a la
In situ
tumores PDAC y para los tumores de aloinjerto.
CAP antitumoral La eficacia en tumores pancreáticos
en primer lugar, se estudió el efecto de la NAC en el crecimiento de los tumores de aloinjerto K8484. Los ratones se dosificaron con vehículo o CAP a 755 mg /kg durante 5 días por semana. Después de 3 semanas, los ratones tratados con vehículo mostraron un volumen medio de tumor de 1840 ± 201 mm
3 en comparación con 629 ± 86 mm
3 en ratones tratados con CAP (Figura 2A), con un aumento significativo en el tiempo de duplicación del tumor de 3,5 ± 0,5 días en vehículo a 7,5 ± 3,0 días en los ratones tratados con CAP (P = 0,0002; Figura 2B).
(a) eficacia capecitabina en ratones con tumores de aloinjerto K8484. Los animales recibieron 755 mg /kg al día durante 5 días consecutivos por semana durante 3 semanas. volúmenes de los tumores se representan como la media ± SEM de 12 con vehículo y 13 ratones tratados con la PAC (** P & lt; 0,01). (B) El tiempo de duplicación del tumor para cada tumor (*** p & lt; 0,001).
A continuación, procedió a un estudio de eficacia a corto plazo en el
In situ
modelo KPC PDAC . ratones KPC se trataron con CAP a 755 mg /kg durante 7 días consecutivos y volúmenes de los tumores se monitorizaron dos veces por semana por ecografía 3D. El crecimiento del tumor se redujo en ratones KPC PAC tratados en comparación con los ratones tratados con vehículo (Figura 3A). El volumen de los tumores CAP- tratados fue de 121 ± 10,2% en comparación con 199 ± 21,8% en el control (p & lt; 0,01; Figura 3B). Se recogió el tejido tumoral 2 horas después de la última dosis de la NAC. tinción PH3 reveló menos células en la mitosis en los tumores tratados con CAP en comparación con el control (p & lt; 0,05; Figura 3C), lo que sugiere la detención del crecimiento
(A) a corto plazo estudio de eficacia capecitabina en ratones KPC con
en. situ
PDAC, dosificado con 755 mg /kg durante 7 días consecutivos. volúmenes de los tumores de vehículo y PAC se midieron mediante ecografía y se normalizó para el volumen del tumor en el día de la inscripción en el estudio (media ± SEM, n = 6 por grupo). (B) El volumen del tumor en el punto final como un porcentaje del volumen en la salida, en los ratones tratados con KPC vehículo o CAP (media ± SEM, n = 6 en cada grupo; ** p & lt; 0,01). (C) La inmunohistoquímica de fosfato histonas H3 se cuantificó en los tumores PDAC 2 h después de la 7
ª y última dosis de la NAC 755 mg /kg. Los resultados se expresan como la media ± SEM (n = 6 por grupo; * p = 0,027).
El Efecto de la administración de la PAC en KPC supervivencia en comparación con los ratones GEM
Nuestra farmacocinética datos mostraron eficientes de entrega 5-FU y los datos del estudio de eficacia a corto plazo de la PAC nos llevó a comparar CAP para GEM en un estudio a largo plazo, el uso de la supervivencia como el punto final. Se trataron ratones KPC ya sea con NAC en 755 mg /kg durante 5 días a la semana o con 100 mg /kg cada 3 días GEM. Los resultados identificaron que la supervivencia fue similar en los 2 grupos; la mediana de supervivencia 8 y 10,5 días para el PAC y el IPG, respectivamente, P = 0,61 (Figura 4A). La supervivencia más larga fue de 67 días en el grupo CAP en comparación con 26 días en el grupo GEM. Por otra parte, no hubo diferencias en el crecimiento del tumor entre CAP y GEM-grupos (Figura 4B) tratada, lo que sugiere una eficacia similar de GEM y CAP en PDA
(A):. Las curvas de Kaplan-Meier para la capecitabina (tramado ) y gemcitabina (sólido) la supervivencia. P = 0,61 log-rank test, Índice de riesgo = 0,78, IC del 95%: 0,29 a 2,06 (n = 10 por grupo). (B): curvas de crecimiento individuales para CAP (negro) y los tumores tratados con GEM (rojo). Los volúmenes se normalizaron al volumen en el día de la inscripción en el estudio de supervivencia.
efecto de la combinación GEMCAP
A continuación, se investigó la combinación de GEMCAP. Con el fin de seleccionar las dosis apropiadas, lo primero que investigó la tolerabilidad de la combinación en ratones portadores de aloinjertos K8484. Los ratones se trataron con GEM en 100 mg /kg cada 3 días solos o en combinación con CAP dado 5 días por semana a 755 mg /kg, 539 mg /kg o 378 mg /kg. Las tres combinaciones utilizando GEM dosis completa inducida marcados toxicidad gastrointestinal indicada por la pérdida de peso corporal del ratón y la histología del intestino delgado del ratón: vellosidades acortada con una arquitectura alterada y pérdida cripta (Adicional Figura S1 D, F). Ni CAP 755 mg /kg o GEM 100 mg /kg solos mostraron ninguna toxicidad gastrointestinal (Figura S1, A - C) Por lo tanto, se repitió el experimento con las mismas dosis de la PAC en combinación con dosis reducida GEM (75 mg /kg). El grupo tratado con la combinación de 755 mg /kg PAC mostró toxicidad temprana, confirmada por la histología del intestino (Figura S1, G). La combinación con 539 mg /CAP kg (71% de la dosis total) no mostró signos de toxicidad durante dos ciclos de tratamiento (11 días). Sobre la base de estos resultados, por lo tanto, utilizamos las dosis seguras de 539 mg /CAP kg y 75 mg /kg GEM para estudiar la eficacia de la combinación GEMCAP en ratones con aloinjertos K8484. Después de 3 semanas, GEM redujo significativamente el crecimiento del tumor (p & lt; 0,001) en comparación con vehículo, al igual que CAP sola (p & lt; 0,05) (Figura 5). La diferencia observada entre GEM y CAP por sí solo no fue significativa (P & gt; 0,05). La combinación GEMCAP inhibió significativamente el crecimiento del tumor con el tumor de tiempo de 8,6 ± 10,8 días (frente a 2,7 ± 0,9 días en el control) duplicando pero esto no fue superior a GEM solo (tumor de tiempo de 7,2 ± 2,8 días duplicación) y no significativamente diferente de PAC solo. Durante el 3
ª semana de tratamiento, los ratones tratados con la combinación GEMCAP comenzaron a mostrar toxicidad (pérdida de peso), en comparación con un solo agente trataron ratones, pero la histología intestinal en el punto final parecían normales (Figura S1, H e I).
GEMCAP eficacia combinación en ratones portadores de tumores de aloinjerto KPC. Los animales recibieron vehículo o GEM cada 3 días a 75 mg /kg o CAP a 539 mg /kg, 5 días a la semana o una combinación de estas dos dosis. volúmenes de los tumores se representan como la media ± SEM (n = 5 por grupo; * p & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001 en comparación con el vehículo; ns: no significativo).
Estos datos, que muestra una falta de sinergia de la combinación, son consistentes con los de
in vitro
ensayos de citotoxicidad que llevamos a cabo en K8484 células y líneas de células pancreáticas humanas (MiaPaCa-2 y Panc-1) dosificados con una gama de 5- FU y combinaciones de GEM, donde se observaron aditivos pero no los efectos sinérgicos (Figura S2). Tomados en conjunto, nuestros resultados mostraron un efecto aditivo citotóxica
in vitro
sino también toxicidad aditiva
in vivo
. Por lo tanto, GEMCAP no conduce a una mejor índice terapéutico en los ratones cuando se compara con GEM solo.
A continuación, investigamos la actividad CDA tumor. El uso de GEM como sustrato, se determinó la tasa de conversión de GEM en dFdU y las constantes cinéticas de CDA, Vmax y Km, en tumores de aloinjertos tratados con vehículo y CAP-(Figura 6). Los resultados demostraron una reducción de Vmax y Km en los tumores tratados con CAP (/h /proteína de 15,1 ± 2,6 nmol mg y 1.320 ± 147 M, respectivamente) en comparación con los tumores no tratados (h proteína de 56,3 ± 7,2 nmol //mg y 1880 ± 82 mM, respectivamente; la figura 6C y 6D) lo que sugiere que la capacidad de metabolización de gemcitabina CDA se redujo en los tumores trasplantados PDAC durante el tratamiento de la PAC. Como se recogieron los tumores entre 2 h y 4 h después de la última dosis de la NAC, nos preguntamos si la reducción de la actividad era debido a la competencia entre el sustrato GEM añadido y la DFCR ya en los tumores. Para ello hemos realizado un
in vitro
ensayo de competición usando el extracto de enzima a partir de un tumor de aloinjertos sin tratar, una concentración fija de GEM 1800 M correspondiente a la Km de CDA en el extracto de enzima y concentraciones DFCR que van desde 0 hasta 1.200 M . Los resultados, presentados en la Figura 6E, mostraron cambios mínimos en la tasa de conversión de GEM en dFdU incluso en presencia de la mayor concentración de DFCR. La LC-MS /MS análisis de los tumores tratados-CAP revelaron que las concentraciones más altas DFCR era 511 mu M, dentro del intervalo ensayado en este ensayo de competición, el apoyo que la disminución observada en la actividad CDA en los tumores tratados con CAP no estaba relacionado con un sustrato competencia. Esto sugiere que el tratamiento CAP puede regular a la baja la actividad CDA. Se determinó la actividad de la enzima
CDA en no tratado (A) y tumores (B) KPC aloinjertos PAC tratados usando GEM como sustrato. La tasa de conversión de GEM en dFdU se midió en los homogeneizados de tumores individuales en el extremo del estudio de eficacia CAP presenta en la Figura 2, y se determinaron las constantes cinéticas Vmax (C) y Km (D) (n = 10 por grupo; * * p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001). (E)
vitro
competencia ensayo En realizado en el extracto de enzima a partir de un tumor de aloinjertos sin tratar. Se utilizó una concentración fija de GEM 1800 M correspondientes a la Km de CDA en el extracto de la enzima y concentraciones DFCR que van desde 0 a 1200 M.
Debido a la
in vivo
toxicidad y la falta de efecto aumentado de GEMCAP comparación con GEM solo en los aloinjertos, no hemos probado en ratones GEMCAP KPC PDAC, cuyo estado de salud es menos robusto.
Discusión
los estudios presentados aquí proporcionan , por primera vez, los datos pre-clínicos sobre la farmacocinética y la eficacia de la capecitabina en un modelo de ratón genéticamente modificado de PDAC. Se utilizó el Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre modelo de ratón [12], debido a que recapitula el síndrome clínico e histopatología de la enfermedad humana. Nuestros datos farmacocinéticos mostraron que, después de la administración oral, la PAC se metaboliza principalmente en el plasma, hígado y tumores. Las concentraciones de metabolitos de la PAC en cada uno de estos compartimentos son consistentes con las encontradas en un xenoinjerto de cáncer de colon humano [27]. También son compatibles con la distribución de informes anteriores de las enzimas implicadas en el metabolismo de la PAC en humanos y de ratón [5], [27]. 5-FU fue encontrado en niveles más altos en el tumor que en el plasma de 30 min después de la administración y fue indetectable en el hígado de confirmar el tumor suministro selectivo de 5-FU después de la administración CAP también descrito por Ishikawa et al. [6]. El bajo 5-FU en el plasma y el hígado puede dar cuenta de la baja toxicidad de CAP a la dosis de 755 mg /kg: Ninguno de los ratones mostraron signos de toxicidad debido al tratamiento CAP solo.