Extracto
pluripotencia celular, la angiogénesis y la transición epitelio-mesenquimal (EMT) de vástago han demostrado ser upregulated significativamente en ductal pancreático adenocarcinoma (PDAC) y muchos otros cánceres agresivos. La desregulación de estos procesos se cree que juega un papel clave en la iniciación del tumor, progresión y metástasis, y es que contribuye a la PDAC siendo la cuarta causa principal de muertes relacionadas con cáncer en los EE.UU.. El supresor de tumores miARN
miR-145
regula a la baja factores críticos de pluripotencia y oncogenes y los resultados en el potencial metastásico reprimida en PDAC. Además, el
miR-200
familia regula varios factores angiogénicos que se han vinculado a la metástasis en muchos tumores sólidos. Hemos demostrado anteriormente que la regulación a la baja de DCLK1 puede regular al alza miRNAs críticos tanto en
in vitro
y
in vivo
modelos de cáncer y los resultados en la regulación negativa de c-MYC, KRAS, NOTCH1 y los relacionados con la transcripción de EMT factores. Un informe reciente ha demostrado también que Dclk1 puede distinguir entre células madre normales y tumorales en
Apc
min /+
ratones y que la ablación de Dclk1
+ células dieron lugar a la regresión de los pólipos intestinales, sin afectar la homeostasis. Aquí demostramos que la caída de DCLK1 utilizando poli (lactida-co-glicólico) da como resultado la detención del crecimiento tumoral AsPC1-DCLK1-siRNA -encapsulated. Estudio de los tumores de xenoinjertos revelado, (a) mayor
miR-145
lo que se traduce en una disminución de los factores de mantenimiento pluripotencia Oct4, Sox2, NANOG, KLF4, así como KRAS y RREB1; (B) el aumento de let-
7a
lo que se traduce en una disminución de LIN28B factor de pluripotencia; y (c) se incrementó
Los factores de transcripción relacionados con la EMT de miR-200
lo que se traduce en una disminución de VEGFR1, VEGFR2 y ZEB1, ZEB2, caracoles y babosas. La especificidad de DCLK1 posterior a la regulación transcripcional de los objetivos de abajo de
miR-145
,
miR-200 y
let-
7a
se logró utilizando un ensayo indicador basado en la luciferasa . Llegamos a la conclusión de que DCLK1 juega un papel regulador maestro significativa en la tumorigénesis pancreática mediante la regulación de múltiples supresor de tumores miRNAs y sus aguas abajo vías pro-tumorigénicos. Este novedoso concepto de focalización DCLK1 el único que tiene varias ventajas sobre la orientación sola vía o terapias basadas en genes miARN para PDAC
Visto:. Sureban SM, mayo R, P. D, Weygant N, P Chandrakesan, Ali N, et al . (2013) DCLK1 Regula Pluripotencialidad y factores angiogénicos
a través de
Mecanismos de microARN-dependiente en el cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (9): e73940. doi: 10.1371 /journal.pone.0073940
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de abril de 2013; Aceptado: 23 de julio de 2013; Publicado: 9 de septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sureban et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones y el Instituto Nacional del cáncer: CA-137 482 (CWH); Centro de Oklahoma para el Avance de la Ciencia y Tecnología, y Oklahoma Centro de Investigación de Células Madre Adultas (CWH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. CWH es un co-fundador de COARE Biotechnology Inc., y esto no altera los autores 'adhesión a todas las políticas de PLoS ONE y el intercambio de datos y materiales.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU. anualmente con un 5 % tasa de supervivencia a 5 años. A pesar de más de 10 años de regímenes terapéuticos aprobados por la FDA y marcadas mejoras en la atención médica y quirúrgica, se ha observado ningún impacto significativo en la supervivencia del paciente PDAC [1]. Recientemente, un subconjunto de células con cáncer de células madre (CSC) propiedades ha sido identificado en PDAC [2] que son capaces de ilimitado auto-renovación y dan lugar a la progenie más diferenciados y más agresiva, que a menudo son resistentes a la convencional quimioterapia y la radioterapia [2,3]. La incapacidad de erradicar estas células madre cancerosas se postula que haber una razón para la recidiva tumoral, metástasis y muerte después de las primeras respuestas al tratamiento [4]. Otro obstáculo fundamental en la lucha contra los cánceres de tumores sólidos, en general, es la heterogeneidad de tipos de células en el microambiente tumoral [5] y el nicho tumor desmoplásico altamente [6]. Esta heterogeneidad se complica aún más por transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso que desempeña un papel clave en la invasión del cáncer y la metástasis [7,8]. Muchos de los factores de transcripción de EMT inductores tales como Snai1 (caracol), SNAI2 (SLUG), ZEB1, ZEB2, TWIST1, FOXC2 y goosecoid han sido asociados con la invasión tumoral y la metástasis [9]. Recientemente, varios informes han identificado el microARN (miARN)
miR-200
familia marcadores y los reguladores de la EMT [10-12] como fundamentales. miRNAs son pequeñas, 19 a 22 nucleótidos de longitud, los ARN no codificantes que inhiben la expresión génica a nivel postranscripcional [13]. Un fuerte vínculo entre miARN desregulación y humano del cáncer se ha establecido [14]. En consecuencia miRNAs se han demostrado para actuar como oncogenes (por ejemplo,
miR-155
,
miR-17-5p
y
miR-21
) [15,16] o supresores de tumores (por ejemplo,
miR-34
,
miR-15a
,
miR-16-1 Opiniones y let-
7
) [17 -20]. Sin embargo, las características de regulación precisos que inclinan la balanza hacia un fenotipo de cáncer con respecto a supresor de tumor frente a los genes miARN expresión oncogénica son poco conocidos.
Pluripotencia es la capacidad de una célula de diferenciarse en cualquier tipo de célula y es un único característica de las células madre embrionarias (CES). factores de pluripotencia de transcripción tales como Oct4, Sox2, NANOG y KLF4 forman redes reguladoras e influyen en un amplio espectro de genes aguas abajo. La sobreexpresión de estos factores puede dedifferentiate células somáticas humanas y de ratón en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) [21]. La reprogramación factores Oct4, Sox2, NANOG, KLF4, c-myc, y Lin28 También se ha sugerido que los oncogenes y puede ser implicado en el desarrollo de varios tipos de cáncer [21-26]. Múltiples informes han demostrado que estos factores de transcripción son regulados, al menos en parte, por miRNAs [21,27,28].
miR-145 de
inhibe específicamente los factores de pluripotencia antes mencionados mediante la unión de la región 3 'no traducida (UTR) del ARNm, lo que conduce a la inhibición de los CES, la auto-renovación, y la inducción de la diferenciación. Por otra parte, la pérdida de
miR-145
perjudica la diferenciación y eleva Oct4, Sox2, y KLF4 [21]. Además, se ha demostrado que el
miR-145
promotor está obligado y reprimidos por Oct4 en CES. Esto indica (a) la existencia de una relación directa entre los factores de reprogramación del núcleo y
miR-145
, y (b) la presencia de un bucle de retroalimentación negativa doble que implica Oct4, Sox2, Klf4, y
miR-145
[21]. En el cáncer,
miR-145
es downregulated y se ha demostrado que poseen propiedades supresoras tumorales. La pérdida de
miR-145 gratis (
de miR-143/145
clúster) se observa en cánceres pancreáticos KRAS mutado, y la restauración terapéutico de estos miRNAs abroga la tumorigénesis [29,30]. Por otra parte, Ras-proteína de unión al elemento de respuesta 1 (RREB1) reprime
miR-143
/
miR-145
promotor de la actividad, lo que indica que la represión es un evento temprano en la iniciación y progresión del cáncer pancreático [ ,,,0],29]. Además, KRAS y RREB1 son blanco de
miR-143/145
, lo que demuestra un mecanismo de alimentación hacia adelante que potencia la señalización mediada por RAS progresión tumoral PDAC [29]. Recientemente se ha demostrado que la expresión ectópica de
miR-143/145
resultados en la metástasis reprimida y el aumento de la adhesión de células de cáncer de páncreas [30]. Estos datos en conjunto sugieren que
miR-145
es un regulador maestro de factores iPSCs en los CES y células madre cancerosas y pueden desempeñar un papel importante en la inhibición de la iniciación del cáncer de páncreas, la progresión y la EMT.
Vascular la señalización del factor de crecimiento endotelial (VEGF) juega un papel importante en la angiogénesis tumoral. miembros de la familia VEGF median la señalización crítico mediante la unión a dos receptores tirosina quinasa, VEGFR1 y VEGFR2. VEGFR1 es necesario para la supervivencia de las células endoteliales; mientras que, VEGFR2 es necesaria para la actividad de la permeabilidad vascular angiogénico y mediada por el receptor [31-33]. Recientemente se ha demostrado que estos factores angiogénicos (VEGFR1 y 2) están implicados en la metástasis tumoral de células de carcinoma renal y de colon [34]. la señalización de VEGF es conocido por promover la vasculatura del tumor y endoteliales proliferación celular en PDAC. Los estudios que utilizan VEGFR1 soluble y VEGFR2 (inhibición de la señalización mediada por VEGFR de una manera dominante negativo) o los inhibidores de la quinasa de tirosina de VEGFR como resultado la inhibición de la angiogénesis tumoral, el crecimiento y la metástasis en modelos de ratón PDAC [35-38].
DCLK1 (anteriormente conocido como DCAMKL-1) es un marcador de células madre intestinales y pancreáticas putativo y está regulada positivamente en el estroma y el epitelio del PDAC. Recientemente también ha sido descrito como un marcador de la célula relativamente indefinido mechón /cepillo en el páncreas y el intestino [39,40]. Se regula negativamente varias miRNAs supresores de tumores y probablemente juega un papel clave en la iniciación y la progresión de cánceres de tumores sólidos [11,41]. Además, regula varios oncogenes claves (c-MYC, KRAS y NOTCH1) y EMT. Por otra parte, la sobreexpresión de factores de pluripotencia en células de cáncer de hígado dio como resultado un aumento de la expresión de DCLK1 [42]. Recientemente Nakanishi et al. [43], han utilizado un elegante modelo de ratón Dclk1-Cre para demostrar, que Dclk1 marca las células madre tumorales intestinales. La ablación de las células que expresan Dclk1 en
Apc
min /+
ratones resultó en la regresión de los pólipos sin ningún tipo de daños en el epitelio intestinal normal. En este informe, tras la caída de DCLK1 utilizando ratones xenoinjertados nanopartículas encapsuladas siRNA (NPsiDCLK1) en el tumor, se observó un aumento significativo de: (A)
miR-143/145
clúster, lo que resultó en la regulación negativa de marcadores de pluripotencia clave (Oct4, Sox2, Klf4 y NANOG); (B) let-
7a
, lo que resultó en una disminución del factor pluripotencia LIN28B; y (C)
miR-200a, b
y
c
, lo que resultó en la regulación negativa de la EMT y los factores angiogénicos. La administración de NPsiDCLK1 no dio lugar a toxicidad manifiesta en los ratones. Estos datos en conjunto sugieren un papel regulador central de DCLK1 en la tumorigénesis pancreática.
Materiales y Métodos
Pequeños RNAs de interferencia
secuencia
DCLK1 siRNA (siDCLK1) centradas en la región de codificación de DCLK1 (nº de acceso NM_004734) (GGGAGUGAGAACAAUCUACtt) y revueltos siRNAs (si-SCR) que no coincida con ninguno de los genes humanos se obtuvieron (Ambion Inc, Austin, TX).
Síntesis y caracterización de DCLK1 siRNA PN
poli (lactida-co-glicolida) (PLGA nanopartículas de ácido PN) se sintetizaron utilizando una técnica de evaporación de disolvente de emulsión doble como se describe anteriormente [11,44]. Brevemente, siRNA (DCLK1 o revueltos) se condensó en el poli polímero catiónico (etilenimina) (PEI) para formar un complejo siRNA-PEI. Este complejo se añadió a PLGA en cloroformo y se agitó y se transfiere a alcohol de polivinilo 2%. Esta emulsión se sometió a ultrasonidos y se dejó evaporar durante la noche. El tamaño, índice de polidispersidad, y las mediciones de potencial zeta de siRNA sintetizados NP se determinaron mediante dispersión de la luz de difracción (DLS) utilizando Zeta PALS (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY).
modelo de tumor de xenoinjerto
NOD /ratones SCID fueron comprados del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine) y se alojaron en condiciones libres de patógenos. Ellos se cuidaron de acuerdo con las directrices establecidas por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care y el Servicio de Salud Pública de Estados Unidos encomendados "Política de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio." Cuerpo "Todos los estudios fueron aprobados y supervisados por la Universidad del Comité para el Cuidado y uso de Animales institucional Oklahoma Ciencias del Centro de Salud (IACUC). células AsPC-1 se inyectaron (1 × 10
7) por vía subcutánea en los flancos de 4 a ratones de 6 semanas de edad (n = 3). los tumores se midieron usando un calibre y el volumen se calculó como (longitud x anchura
2) × 0,5. los tumores eran palpables 30 días después de la inyección de las células. NPs se reconstituyeron en solución salina normal estéril y se inyectaron directamente en los tumores. Cada que lleva el tumor de los animales se inyectó en días 30, 33, 36, 39, y 42 con una de las siguientes preparaciones -50 l (5 M) de la preparación de siRNA-NP [NP sola (control), NP-siScrambled (NPsiSCR), o NPsiDCLK1]. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 45.
La inmunohistoquímica, Western blot, en tiempo real PCR con transcripción inversa, análisis de miARN, invasión de ensayo y ensayo de luciferasa reportero gen
Estos análisis fueron llevado a cabo como se ha descrito anteriormente [11,41]. descripciones detalladas se proporcionan en la sección complementaria de Materiales y Métodos (Texto S1).
Resultados
silenciamiento de ARN de DCLK1 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de páncreas
AsPC-1 pancreática humana se inyectaron células cancerosas por vía subcutánea en los flancos de ratones NOD /SCID y los tumores se dejaron desarrollar durante 30 días. NP siRNAs encapsuladas (NPsiDCLK1 y NPsiSCR) fueron inyectados por vía intratumoral. encapsulación de nanopartículas se realizó para superar las limitaciones teóricas de a base de siRNA entrega [45]. La eficacia de este enfoque ha sido probado previamente en xenoinjertos de cáncer de colon [11]. En el día 30, cuando los tumores eran palpables, los tratamientos se iniciaron y continuaron cada tercer día durante un total de cinco inyecciones. Los tumores fueron extirpados al día 45, y los volúmenes de los tumores se representan en la Figura 1. La administración de NPsiDCLK1 resultó en una reducción significativa (~ 85%) (
p
& lt; 0,01) en el volumen del tumor en comparación con cualquiera de los de control (NPS-solo) o tumores tratados con NPsiSCR (Figura 1A y 1B). análisis de ARNm demostró una regulación a la baja significativa (
p Hotel & lt; 0,01) de ARNm DCLK1 comparación con el control tratado o NPsiSCR tumores (Figura 1C). Estos datos tomados en conjunto demuestran que la inhibición de los resultados DCLK1 en AsPC-1 la detención del crecimiento de xenoinjertos de tumores.
A, AsPC-1 en las células de cáncer de páncreas humano se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones NOD /SCID para generar tumores. Al día 30, PLGA NP encapsulado siRNAs (siDCLK1 y siSCR) se inyectaron directamente en los tumores y, seguido de inyecciones cada tres días. Después de 5 inyecciones, los tumores fueron extirpados al día 45 y se representan arriba. El volumen del tumor se midió cada 3 días. B, se muestran fotografía representativa de ratones portadores de tumores de cada grupo. C, La expresión de ARNm DCLK1 en los tumores se cuantificaron por tiempo real RT-PCR. Los valores se dan como media ± SEM, y
asteriscos denotan
diferencias estadísticamente significativas (*
p Hotel & lt; 0,01). Comparado con el control (NP por sí sola) guía empresas
desmontables de resultados DCLK1 en regulación a la baja de los factores de pluripotencia en xenoinjertos tumorales pancreáticas a través de miR-145
se ha demostrado que Oct4, Sox2, c-myc, Lin28, NANOG y KLF4 son necesarios para la ESC auto-renovación y pluripotencia y se upregulated en algunos cánceres agresivos y en los CAC [23-26,28]. La sobreexpresión de estos factores puede reprogramar o dedifferentiate células somáticas humanas y de ratón en células iPS. Aquí se observó una disminución significativa (
p Hotel & lt; 0,01) regulación a la baja (& gt; 40%) en la expresión de ARNm de los marcadores de pluripotencia NANOG y KLF4 (Figura 2A y 2B) por tiempo real de RT-PCR después de la caída de DCLK1. Del mismo modo proteínas NANOG y KLF4 también fueron regulados a la baja según se analizó mediante análisis inmunohistoquímico (Figura 2C y 2D). Además, también se observó una disminución significativa (& gt; 40%). Regulación a la baja de Oct4 (Figura 2E) y Sox2 (Figura 2F) en el ARNm después de la caída de DCLK1 en AsPC-1 xenoinjertos tumorales
siRNA- mediada desmontables de DCLK1 dio lugar a regulación a la baja de los factores de pluripotencia: NANOG mRNA (a); ARNm KLF4 (B); proteína NANOG (C); proteína KLF4 (D); mRNA OCT4 (E) y SOX-2 mRNA (F). ARNm se analizó utilizando en tiempo real de RT-PCR y proteína mediante análisis inmunohistoquímicos. Para gráfico de barras en A, B, E y F, los valores se dan como media ± SEM, y
asteriscos denotan
diferencias estadísticamente significativas (*
p Hotel & lt; 0,01) en comparación con el control (NP solo).
DCLK1 post-transcripcionalmente regula el miR-145 en el cáncer de páncreas
miR-145
se ha demostrado que reprimir Oct4, Sox2, y KLF4, reprimiendo de ese modo la pluripotencia y el control de la diferenciación [21].
miR-145
es downregulated en diversos tipos de cáncer y se ha demostrado que poseen supresor de tumores y metástasis propiedades inhibidoras [29,30]. informes anteriores [11,28,41] y los datos presentados anteriormente indican que DCLK1 regula negativamente miRNAs supresores de tumores como let-
7a
,
miR-144
y
miR-200a
. Del mismo modo, aquí se observó una inducción significativa (1,5 veces) de
pri-mir-143/145
genes miARN grupo (Figura 3A) y
pri-miR-145
miARN (Figura 3B) después de la caída de DCLK1 en AsPC-1 xenoinjertos tumorales. Además, se realizó un ensayo de gen indicador de luciferasa para medir cuantitativamente el efecto de la caída en DCLK1
miR-145
miARN. células AsPC-1 se transfectaron con un plásmido que contiene el gen de la luciferasa de luciérnaga con un sitio de unión
miR-145 complementario en el 3 'UTR. Después de la transfección, las células se trataron con NP solamente, NPsiSCR, o NPsiDCLK1 y se sometieron a medición de la actividad de luciferasa. Se observó una reducción en la actividad de luciferasa en las células tratadas con NPsiDCLK1 comparación con el control o NPsiSCR (Figura 3C). Estos datos sugieren que la caída de los resultados DCLK1 de regulación a la baja de
miR-145
miARN objetivos abajo en las células de cáncer de páncreas. Previamente se ha demostrado que existe un mecanismo de retroalimentación entre
miR-143/145
y KRAS y RREB1. RREB1 es conocido para reprimir la transcripción de
miR-143/145 fotos: por la unión a su región promotora. Además, KRAS y RREB1 son objetivos de abajo
miR-143/145
[29]. Desmontables de DCLK1 dio lugar a una mayor expresión de
miR-143/145
cluster y regulación a la baja de su objetivo abajo KRAS (Figura 3D). Por otra parte, se encontró que la expresión de RREB1 se downregulated significativamente tras la administración de siRNA contra DCLK1 (Figura 3E). Con estos datos, se especula que DCLK1 juega un papel en la regulación post-transcripcional de
miR-143/145
clúster y por lo tanto regula a la baja KRAS y RREB1 en xenoinjertos tumorales pancreáticas.
Después de la caída de DCLK1 en AsPC-1 xenoinjertos tumorales, una regulación al alza significativa de
de miR-143/145
clúster (a) y
miR-145
miARN (B) por tiempo real RT-PCR. C, una disminución en la actividad de luciferasa (unidades de luciferasa) después de la transfección con el plásmido que codifica la luciferasa que contiene el
miR-145
se observó sitio de unión después de la caída de DCLK1 en células de cáncer pancreático humano AsPC-1. Desmontables de DCLK1 también resultó en la regulación a la baja de KRAS (D) y RREB1 (E) ARNm, objetivos de abajo
miR-143/145
genes miARN grupo, analizaron utilizando en tiempo real de RT-PCR. Los valores se dan como media ± SEM, y
asteriscos denotan
diferencias estadísticamente significativas (*
p Hotel & lt; 0,01). Comparado con el control (NP por sí sola) guía empresas
en general, estos datos tomados juntos demuestran un papel regulador potencial de DCLK1 en la expresión de factores de IPSC en los cánceres de páncreas a través de
miR-145
miARN.
DCLK1 regula let-7a y su objetivo abajo LIN28B en el cáncer de páncreas
en las células de cáncer de páncreas y colorrectal, hemos demostrado previamente que regula negativamente DCLK1 miARN let-
7a
. siRNA desmontables mediada por DCLK1 resultó en la regulación negativa de dejarlo
7a
abajo objetivos de c-myc y KRAS. En xenoinjertos de tumores de páncreas tratados con NPsiDCLK1, se observó una significativa regulación de dejarlo
7a gratis (Figura 4A) y la posterior regulación a la baja de su objetivo abajo c-myc (ARNm y proteína) (Figura S1). Los informes sugieren que LIN28B, un factor de mantenimiento de la pluripotencia regula miARN let-
7
ya su vez let-
7
regula LIN28B (debido a la presencia del sitio de unión en el 3 'UTR de LIN28B) , lo que sugiere un doble bucle de retroalimentación negativa entre Lin28 y let-
7
[46,47]. Aquí lo que queríamos ver si NPsiDCLK1 regula abajo objetivos de dejarlo
7a
miARN. células AsPC-1 se transfectaron con plásmido que codifica el gen de luciferasa de luciérnaga bajo el control de 3 'UTR que contiene sitio de unión para let-
7
. Después de la transfección, las células fueron tratadas con NPsiDCLK1 y se sometieron a medición de la luciferasa. Tras la caída de DCLK1, se observó una regulación a la baja significativa de
let-7
actividad luciferasa dependiente (Figura 4B), indicando que regula NPsiDCLK1 abajo objetivos de dejarlo
7 Hoteles en células de cáncer de páncreas. Sobre la base de análisis en tiempo real de RT-PCR de los tumores tratados con NPsiDCLK1, se observó una regulación a la baja significativa de LIN28B mRNA en comparación con NPsiSCR o tumores tratados con control (Figura 4C). Estos datos indican que regula DCLK1 LIN28B a través de
let-7
mecanismo dependiente.
A, caída mediada por siRNA de DCLK1 en xenoinjertos de tumor resulte en una mayor expresión de
pri-let- 7a
miARN. B, Después de la caída de DCLK1, una disminución de la
se observó let7a miR-
actividad luciferasa en células dependientes AsPC-1. C, LIN28B ARNm diana en el sentido de dejarlo
7a
se downregulated en los tumores tratados con NPsiDCLK1. Los valores en los gráficos de barras se dan como media ± SEM, y los asteriscos denotan diferencias estadísticamente significativas (*
P Hotel & lt; 0,01). Comparado con el control (NP por sí sola) guía empresas
DCLK1 regula miR-200 genes de la familia y EMT en el cáncer de páncreas
EMT es un proceso altamente conservada, que se caracteriza por la conversión fenotípica de las células epiteliales a células mesenquimales [7]. EMT es esencial en varios procesos incluyendo la morfogénesis de órganos, la cicatrización de heridas, la metástasis del cáncer y la remodelación de tejidos en el desarrollo embrionario. Estudios recientes han demostrado que
miR-200a, b
y
c gratis (
miR-200
) se sabe que regulan la EMT y la angiogénesis [48]. Estudios previos han demostrado que DCLK1 se sobreexpresa en tejidos de cáncer de páncreas humano y co-localiza con caracoles y babosas. Tras la caída de DCLK1, una regulación a la baja significativa de ZEB1, ZEB2, caracoles y babosas se observó después de la expresión aumentada de
pri-miR-200a
en las células cancerosas AsPC-1 [11]. Del mismo modo, en ASPC-1 xenoinjertos tumorales, una inducción de 2 veces de
pri-mir
-200
una gratis (
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 5) se observó . Por otra parte, hemos querido investigar el efecto de la caída en DCLK1 expresión de
miR-200b
y
c Hoteles en AsPC-1 xenoinjertos tumorales. Similar a
miR-200a
, se observó una significativa regulación de
miR-200b gratis (1,5 veces) (Figura 5A) y
miR-200c gratis (2 veces ) (Figura 5A) después de la caída de DCLK1. A continuación, hemos querido investigar si DCLK1 regula los objetivos de abajo de
miR-200
. Se realizó un ensayo indicador de luciferasa para
miR-200
. AsPC-1 se transfectaron por separado con plásmidos que codifican el gen de la luciferasa bajo la regulación de los genes miARN sitios de unión (tres plásmidos que contienen cada uno de los sitios de unión
miR-200a, b
o
c
) en su 3 'UTR. Después de la transfección, se trataron las células con NP-siDCLK1. Los lisados celulares se sometieron a la medición de la luciferasa. Tras la caída de DCLK1, había una regulación a la baja significativa de
miR-200a
,
miR-200b
y
miR-200c gratis (Figura 5B) mediada por la actividad de luciferasa. Estos datos indican que regula DCLK1
miR-200
y sus objetivos abajo en PDAC. También se observó una reducción posterior de
miR-200
objetivos de abajo ZEB1 y ZEB2 (Figura 5C), caracoles y babosas (Figura 5D) después de la caída de DCLK1 en xenoinjertos tumorales pancreáticas. Además células AsPC-1 se trataron con NPsiSCR o NPsiDCLK1 y se sometieron a ensayo de invasión utilizando cámaras de invasión de Matrigel (BD Biosciences BD BioCoat
TM). Se observó una inhibición significativa de invasión tras la caída de DCLK1 (Figura 5E y F). Estos datos tomados en conjunto indican que desmontables de DCLK1 inhibe la EMT y la invasión mediante la regulación de
miR-200
en xenoinjertos tumorales y las células de cáncer de páncreas humano. Al igual que en nuestros estudios anteriores, tras la caída de DCLK1, también se observó inhibición de NOTCH1 a través de
miR-144 gratis (Figura S2) en AsPC-1 xenoinjertos tumorales.
A, mediada por siRNA desmontables de resultados DCLK1 en una mayor expresión de
pri-miR-200a
,
pri-miR-200b
y
pri-miR-200c fotos: por tiempo real de RT-PCR . B, Después de la caída de DCLK1, una disminución de la
miR-200a
,
miR-200b
y
se observó actividad de miR-200c
luciferasa dependiente de células AsPC-1 . xenoinjertos tumorales tratadas con NPsiDCLK1 demostraron una regulación a la baja de la EMT factores de transcripción de ARNm y ZEB1 ZEB2 (C), disminución de caracoles y babosas expresión de ARNm (D). E, la inhibición de los resultados DCLK1 en la inhibición de la invasión siRNA mediada en células AsPC-1. Las flechas blancas indican las células invadidas a través de la matriz de Matrigel. gráfico F, Bar representa la cuantificación de células invadidas después de cada tratamiento. Se contaron las células en 5 campos diferentes para cada inserto. Los valores en los gráficos de barras se dan como media ± SEM, y los asteriscos denotan diferencias estadísticamente significativas (*
P Hotel & lt; 0,01). Comparado con el control (NP por sí sola) guía empresas
DCLK1 regula factores angiogénicos en PDAC
Se ha demostrado que
miR-200
inhibe la invasión y la metástasis de adenocarcinoma de pulmón por la orientación VEGFR1. Un supuesto sitio de unión para
miR-200
se observó en el 3 'UTR de VEGFR1, y se demostró que
miR-200
regula negativamente VEGFR1 [48]. Además, un estudio reciente demostró que VEGFR1 y VEGFR2 tiene un sitio de unión para
miR-200b
y en base a ensayo indicador basado en la luciferasa
miR-200b
regula estos factores angiogénicos [49]. Estos datos indican que VEGFR1 y VEGFR2 son objetivos de abajo
miR-200
. Aquí, encontramos DCLK1 regulación
miR-200
y sus objetivos de abajo. Queríamos investigar más a fondo el efecto de DCLK1 caída de factores angiogénicos VEGFR1 y VEGFR2. Se ha observado una regulación a la baja significativa de VEGFR1 ARNm (Figura 6A), proteína (Figura 6B y C - panel izquierdo) en los tumores tratados con NPsiDCLK1 comparación con el control y NPsiSCR tratados con tumores. También observamos regulación a la baja de VEGFR2 ARNm (Figura 6E) y proteína (Figura 6C - panel derecho) en xenoinjertos de tumores de páncreas tratados con NPsiDCLK1. Adicionalmente, se realizaron ensayos de reportero de luciferasa basado en para VEGFR1 y VEGFR2. células AsPC-1 se transfectaron con el gen de la luciferasa con VEGFR1 o VEGFR2 3 'UTR, se trató con NPsiDCLK1 y se sometieron a medición de la actividad de luciferasa. Después de la caída de DCLK1, se observó una regulación a la baja significativa de VEGFR1 (Figura 6D) y VEGFR2 (Figura 6F) 3 'UTR actividad de luciferasa mediada. Estos datos tomados en conjunto indican que regula DCLK1 VEGFR1 y VEGFR2
a través de miR-200 Hoteles en PDAC.
A, caída mediada por siRNA de los resultados DCLK1 en disminución de la expresión de mRNA en VEGFR1 NPsiDCLK1 tratada xenoinjertos de tumores . Una disminución de la proteína se observó en VEGFR1 NPsiDCLK1 tumores tratados (B - Western blot; C - Inmunofluorescencia - el panel izquierdo, VEGFR1 rojo). D, Después de la caída de DCLK1, una disminución de la actividad de la luciferasa dependiente de VEGFR1-3'UTR se observó en las células AsPC-1. E, desmontables de resultados DCLK1 en disminución de expresión de mRNA en VEGFR2 NPsiDCLK1 tratada xenoinjertos tumorales. F, una disminución en la actividad de luciferasa dependiente de VEGFR2-3'UTR se observó en células AsPC-1. mediada desmontables-NPsiDCLK1 de DCLK1 generado una disminución en la expresión de la proteína VEGFR2 estimado utilizando el análisis de inmunofluorescencia (C - panel de la derecha, VEGFR2 rojo). Los valores en los gráficos de barras en A, B, D y E, se dan como media ± SEM, y los asteriscos denotan diferencias estadísticamente significativas (*
P Hotel & lt; 0,01). Comparado con el control (NP por sí sola)
Discusión
miRNAs están emergiendo rápidamente como reguladores críticos de prácticamente todos los procesos celulares fundamentales. La desregulación de miRNAs son bastante comunes en muchos cánceres humanos, incluyendo PDAC. En muchos tumores, o bien hay sobreexpresión de los llamados miRNAs oncogénicos (por ejemplo,
miR-155
,
miR-17-5p
y
miR-21
) [ ,,,0],15,16] o regulación a la baja de miRNAs supresores de tumores (por ejemplo,
miR-34
,
miR-15a
,
miR-16-1 Opiniones y let-
7
) [17-20]. El let-
7
y
miR-200
familias son reguladores clave de diferenciación de los programas bien conocidos durante el desarrollo. Pérdida de dejarlo
7 Hoteles en cáncer es el resultado de la progresión y la desdiferenciación, y el
miR-200
familia se ha demostrado que es un regulador clave de la EMT. Por otra parte, estudios recientes han relacionado la let-
7
con el mantenimiento de células madre y EMT. Por lo tanto es muy posible que la progresión tumoral puede representar un proceso que resulta en la desdiferenciación progresiva (EMT) hacia un tipo de célula que tiene un fenotipo de células madre similares. Por otra parte, este proceso parece estar estrictamente regulados por mecanismos dependientes de miARN [10,11,27,30]. DCLK1 regula la EMT en las células de cáncer de páncreas humano
a través de
un
miR-200a mecanismo dependiente
[11] y también es un regulador de dejarlo
7a Hoteles en páncreas y el cáncer colorrectal las células, lo que apoya el concepto de que estos miRNAs son objetivos relevantes y novedosos en varios cánceres de tumores sólidos [10,11,27,30,41]. DCLK1 es un marcador putativo de células madre intestinales y pancreáticas y está regulada positivamente en varios tumores sólidos que proporcionan evidencia adicional de su potencial papel clave en el proceso tumorigénico. En este informe, hemos demostrado que, además de la regulación de varios miRNAs supresores de tumores oncogénicos y objetivos intermedios, resultados de inhibición DCLK1 en la regulación positiva de miRNAs que regulan negativamente varias pluripotencia clave y los factores pro-angiogénicos. Estos datos apoyan la noción de que el DCLK1 es un regulador central del proceso tumoral.
La represión de los
miR-143
y
miR-145
, dos miRNAs co-transcritos situado en el cromosoma 5q humano, se ha informado en el cáncer de páncreas. Los datos acumulados sugieren que poseen actividad supresora de tumores [50,51]. Reducción de
miR-143/145
expresión es una característica común de muchos tipos de tumores incluyendo el carcinoma colorrectal y PDAC [29,50,51]. Además, la expresión de estos miRNAs inhibe la proliferación y activa la apoptosis de las células cancerosas
in vitro
y
in vivo
[29].