está garantizado
Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer y la búsqueda de biomarcadores de pronóstico que podrían mejorar las decisiones de tratamiento. MicroARNs (miRNAs) son moléculas de ARN no codificantes cortos que intervienen en la regulación de la expresión génica y se han propuesto como posibles biomarcadores en CRC. Con el fin de caracterizar el transcriptoma miARN, incluyendo una gran cohorte de 88 tumores con CRC a largo plazo de seguimiento fue secuenciado profundo. 523 maduras miRNAs se expresan en nuestra cohorte, y que exhiben patrones de expresión en gran medida uniformes a través de muestras de tumores. Pocos se encontró una asociación entre los parámetros clínicos y la expresión de los genes miARN, entre ellos, la baja expresión de miR-592 y la alta expresión de miR-10b-5p y miR-615-3p estaban asociados con tumores localizados en el colon derecho en relación con el colon izquierdo y recto. Alta expresión de miR-615-3p también se asoció con tumores poco diferenciados. No hay candidatos de biomarcadores de pronóstico para la supervivencia global y libre de metástasis fueron identificadas mediante la aplicación del método de lazo en un modelo de riesgos proporcionales de Cox univariante o Cox. El examen de los cinco miRNAs expresados de forma más abundante en la cohorte (miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p y miR-192-5p) reveló que su expresión colectiva representaba el 54% de las secuencias de genes miARN detectados. Pathway análisis de los genes diana regulados por los cinco miRNAs más altamente expresados descubrió un número significativo de genes implicados en la ruta de CRC, incluyendo APC, TGF y PI3K, lo que sugiere que estos miRNAs son relevantes en el CCR.
Visto : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden M, Hovig E, et al. (2013) secuenciación profunda del microARN transcriptoma en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10.1371 /journal.pone.0066165
Editor: Georgina L. Hold, Universidad de Aberdeen, Reino Unido
Recibido: 17 Febrero, 2013; Aceptado: 2 de mayo de 2013; Publicado: 18 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Schee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Autoridad regional de Salud de Noruega Sur-Oriental y de la Sociedad de cáncer de Noruega. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microARNs (miARN) son evolutivos pequeñas (~20-22 nt de longitud) ARN conservadas, no codificantes que regulan la expresión de genes mediante la unión a la 3'UTR de ARNm, inhibiendo así la traducción [1]. Pueden unirse con complementariedad parcial al ARNm a regular a la baja potencialmente varios mRNAs. Esto hace que los estudios de aguas abajo un poco difícil con múltiples objetivos potenciales para cada miARN. Hoy en día hay aproximadamente 1500 miRNAs anotados en la base de datos miARN (miRBase) [2] y se estima que hasta un 60% de los genes de codificación de proteínas puede estar regulada por miRNAs [3]. MiRNAs son esenciales para el desarrollo normal de los mamíferos y están involucrados en afinando muchos procesos biológicos, como la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y el metabolismo, así como su implicación en el cáncer ha despertado un mayor interés en la biología miARN [4] - [6]. Han sido propuestos como posibles marcadores biológicos debido a sus funciones de regulación, estabilidad química y la posibilidad de medir miARN en suero, plasma, heces y muestras de tejidos [7] - [10].
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las formas más comunes de cáncer en los países occidentales y la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer. Es una enfermedad heterogénea caracterizada por la acumulación de eventos genéticos y epigenéticos, e influenciado por el estilo de vida [11], [12]. Las decisiones de tratamiento están siendo esencialmente basados en la extensión anatómica de la enfermedad al momento del diagnóstico, y la búsqueda de mejores biomarcadores está garantizado. MiRNAs han sido examinados por su papel potencial como biomarcadores diagnósticos, pronósticos y terapéuticos en CRC utilizando tecnologías de matriz basada en la hibridación y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) [13] - [16]. Utilizando microarrays de expresión, la expresión de una gran cantidad de miRNAs preseleccionados se puede detectar, y la detección de los genes miARN se basa en la intensidad de señal. Expresión relativa se puede calcular utilizando QRT-PCR, pero cuando se expande a múltiples análisis paralelos, el número de miRNAs posible analizar y la cantidad de ARN puede representar limitaciones. secuenciación profunda se ha convertido en un enfoque atractivo para el análisis global de los genes miARN, ventajas, incluida la agrupación de muestras con fines de alto rendimiento, una gama amplia expresión detectable, la capacidad de analizar la expresión de todos los miRNAs anotados y la posibilidad de detectar nuevos miRNAs.
en este trabajo, se utilizó la secuenciación profunda para determinar la expresión de los genes miARN en 88 muestras de tumores de CRC, y se analizaron las asociaciones entre los niveles de expresión y los datos clínico-patológicos y resultado.
Materiales y Métodos
paciente cohortes y preparación de muestras de
entre los años 1998-2000, 316 pacientes fueron reclutados de cinco hospitales de la región de Oslo [17], y prospectivamente incluidos en el estudio en el momento de la cirugía primaria para la supuesta o verificada cáncer colorrectal . El estudio fue aprobado por el Comité Regional de Ética (Salud de la Región II, Noruega) y se obtuvo el consentimiento de los pacientes. especímenes resecados se procesaron rutinariamente para la evaluación histopatológica en el momento de la cirugía y se clasifican de acuerdo con el sistema de estadificación del tumor nodo metástasis (TNM). Toma de muestras de tejido tumoral adicional se llevó a cabo por el cirujano en la sala de operaciones después de la muestra se retira del paciente, y las muestras fueron inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Las muestras fueron transportados al laboratorio de investigación y se mantuvieron durante el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. Las biopsias se seccionaron utilizando un micrótomo criostato y hematoxilina-eosina se evaluaron muestras teñidas para el contenido de tumor por un patólogo (contenido medio del tumor en las muestras fue del 50%, gama de 30 a 80%). El tejido tumoral se cortó en secciones de 10 micras utilizando un micrótomo criostato y se almacenó a -80 ° C hasta que el aislamiento de ARN. 120 casos no se incluyeron en el estudio por las siguientes razones: no cáncer invasivo (25), la histología distinta de adenocarcinoma (5), metástasis a distancia en el momento de la cirugía (34), quimiorradioterapia preoperatoria (2), los márgenes quirúrgicos inadecuados (7 ) y la etapa desconocida de la enfermedad (1). Además, las muestras de tejido congelado no eran obtenibles en 46 casos. De las 196 muestras en el estadio TNM I-III, 90 muestras tumorales fueron seleccionados al azar para la secuenciación profunda. Después de la secuenciación, dos muestras de la cohorte se consideraron degradado y se eliminaron de otros estudios, dejando una cohorte muestra de 88 pacientes (Tabla 1). Los datos de seguimiento se obtuvieron de los hospitales participantes y de los médicos generales (para los pacientes que no asisten a los controles programados). La metástasis se verificó mediante los datos de exámenes radiológicos y de supervivencia se obtuvo del Registro Nacional de Noruega y actualizada el 1 de octubre de 2008.
El aislamiento de ARN y secuenciación profunda
RNA fue aislado de tejido tumoral usando TriReagent (Ambion Inc, TX) de acuerdo con el protocolo del fabricante y la concentración total de ARN se midió por Nanodrop (ND-1000). La calidad se evaluó por el Agilent 2100 Bioanalyzer y las muestras con un valor de RIN 7 y anteriores se usaron para el análisis adicional. pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN fueron creados siguiendo el protocolo de preparación de muestras Illumina®TruSeq ™ Pequeño ARN. En resumen, 3` y 5 `adaptador de ARN, específicamente modificado para apuntar a los extremos de pequeñas moléculas de ARN, se ligaron a 1 g de ARN total de alta calidad. La transcripción inversa se realizó para generar bibliotecas de ADNc y la PCR se utiliza para amplificar y añadir secuencias de índice único para cada biblioteca.
bibliotecas pequeñas de ARN se combinaron y 32 bases fueron secuenciados para cada molécula de ADNc utilizando un Illumina® Genoma Analizador IIx . Los índices se secuenciaron con el fin de identificar el origen de cada lectura. La primera ejecución, que contiene 48 muestras, se vio obstaculizado por carriles parcialmente no funcionales en la célula de flujo y por lo tanto se repitió. Los datos de ejecución 1 y ejecutar 2 se combinaron para el análisis de la expresión aguas abajo, así como analizaron por separado para determinar la reproducibilidad técnica de los experimentos.
Análisis de Datos de Secuenciación y Normalización
Análisis en tiempo real , llamada base y el filtrado de baja calidad lee fueron hechas por los paquetes de software de Illumina (SCS2.9 /RTA1.9 y fuera de línea Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010; www.novocraft.com) se utilizó para cortar secuencia adaptadora restante y mapa de las lecturas para el genoma de referencia humana (hg19). Todas las lecturas de mapeo a 10 o más regiones genómicas fueron excluidos del análisis. El mapeado lecturas fueron anotados utilizando bases de datos conocidos. Se utilizó la base de datos de liberación miRBase 18 (noviembre de 2011) para identificar miRNAs, utilizando BEDTools versión 2.16.2-[18]. El NCBI construir "Homo_sapiens.NCBI.36.58" se utilizó para identificar otras especies pequeñas de ARN y ARNm.
Para calcular el recuento de leer por miRNAs, se lee que asigna de forma única dentro de una secuencia de los genes miARN maduro con un máximo de un desajuste fueron considerados éxitos. Lee asignación a más de una secuencia de los genes miARN maduro fueron asignados de acuerdo a la frecuencia asignada de forma exclusiva lee encontrado para estos miRNAs. Esto significa que cuando dos miRNAs comparten un número dado de múltiples asignada lee, se identificaron la relación de única lee entre estos dos miRNAs. Esta proporción se aplica al dividir el número de múltiples asigna lee y asignarlas. Si se encontraron múltiples golpes que estar perfectamente mapeado en una región genómica y cartografiado con falta de correspondencia uno a otro, sólo se consideraron las coincidencias perfectas.
Para la normalización de los recuentos de lectura, se probaron cuatro enfoques diferentes. Se calculó el factor de normalización para todas las muestras dividiendo el número total de lecturas, el número de lecturas alineado con el genoma, lo que permite múltiples accesos o que el mapa de forma única, o el número de lecturas asignada a miRNAs maduros anotado con 1,000,000. Los valores de expresión normalizados para cada miARN se generaron dividiendo el recuento de lecturas del miRNA con el factor de normalización de acuerdo. Después de la normalización, todos los miRNAs con lectura recuentos inferiores a 10 en todas las muestras de los pacientes se ponen a 0. El conjunto de datos normalizado contra miRNAs maduros anotados fue elegido para el resto de los análisis. conteos de lectura normalizados y sin normalizar para todas las muestras han sido puestos a disposición en la página web de Array Express, número E-MTAB-1649 (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).
cuantitativo PCR en tiempo real
QRT-PCR se realizó previamente para toda la cohorte de 196 muestras de las que se disponía para determinar la expresión de miRNAs seis tejidos recién congelados: miR-21, miR-31, miR-92a , miR-101, miR-106a y miR-145 [19]. En pocas palabras, la síntesis de ADNc y QRT-PCR se realizaron usando ensayos TaqMan microARN (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las muestras se realizaron por duplicado. Los valores de Ct para miRNAs se normalizaron en contra RNU44 y la expresión relativa se calculó utilizando 2
-dCt método [20]. Los resultados de estos seis miRNAs de las 88 muestras que habían sido analizadas con ambos métodos fueron utilizados para la comparación de los datos de secuenciación profunda con QRT-PCR. Las asociaciones entre los resultados de la secuenciación profunda y QRT-PCR se estudiaron mediante análisis de regresión lineal.
la agrupación jerárquica y análisis estadístico
La agrupación jerárquica se realizó para visualizar los patrones de expresión de todos los miRNAs. Los valores de expresión se normalizaron log2 transformados y sin supervisión de dos vías agrupación jerárquica se ha realizado mediante la distancia euclídea y la vinculación promedio ponderado (WPGMA) a agruparse miRNAs y muestras simultáneamente.
Dos clase de análisis de significación no apareado con múltiples pruebas (10000 permutaciones ) (SAM) [21] se utilizó para identificar miRNAs asociados con parámetros clínico, usando J-Express (versión 2012) [22]. La entrada para SAM se había normalizado y log2 transformado y se utilizaron parámetros clínico como variables de respuesta. Se utilizaron diez mil permutaciones repetidas de los datos para determinar si la expresión de miRNAs se asoció significativamente con uno de los siguientes parámetros clínico: TNM, pT, pN, la localización del tumor, la diferenciación, la infiltración perinodal, invasión vascular e infiltración neural. La tasa de falso descubrimiento expresa como q-valores inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
En general y la supervivencia libre de metástasis se calculó a partir de la fecha de la cirugía hasta la fecha de la muerte o el diagnóstico de metástasis. Para identificar miRNAs asociados con la regresión univariante general y la supervivencia libre de metástasis de riesgos proporcionales de Cox se aplicó a cada miARN, las pruebas de asociación con la supervivencia libre de metástasis o global. Para dar cuenta de las múltiples pruebas, p-valores ajustados se calcularon mediante el control de la tasa de falso descubrimiento (FDR), utilizando el procedimiento Benjamini-Hochberg [23]. Entonces, para todos los miRNAs de forma simultánea, el método LASSO en el modelo de riesgos proporcionales de Cox [24], que se aplica previamente [25], se utilizó para descubrir un conjunto de miRNAs asociados con los criterios de valoración. "En el análisis se seleccionaron LASSO no hay miRNAs. No hay miRNAs fueron significativas en el análisis univariante de Cox después de la corrección de múltiples ensayos. En este último análisis, siete miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365b-3p, miR-454-3p, miR-194-3p, miR-15b-3p y HSA-miR 4461) tenía valor de p inferior a 0,01 con el desarrollo de metástasis como punto final, mientras que tres miRNAs (miR-101-5p, hsa-miR-873-5p y hsa-miR-3144-3p) tenían valor de p inferior a 0,01 con la supervivencia global de punto final . Todos estos diez miRNAs se expresaron en niveles muy bajos en nuestra cohorte con la más alta expresión de la mediana observada para el miR-187 454-3p con lecturas de los más bajos de miR-873-3p con 0 lecturas.
Pathway Análisis para los genes diana de los cinco miRNAs más altamente expresado
Para investigar la influencia biológica de los miRNAs más altamente expresados, los genes diana se identificaron utilizando TarBase 6.0 [26]. Esta base de datos contiene los genes diana que tienen soporte experimental, además de la predicción basada en la secuencia. Las identidades de genes se cargan en la herramienta basada en la web DAVID funcional anotación para análisis de vías, utilizando la base de datos KEGG [27], [28].
Resultados
de RNA Secuenciación y anotación
la longitud de las secuencias detectadas varió entre 13 y 29 nucleótidos después de la eliminación de la secuencia adaptadora (ya lecturas fueron retirados). La parte principal de lecturas, 97,9%, fue de entre 19 y 23 bases. En promedio, 2.600.000 lecturas de mapeo para el genoma humano se obtuvieron por muestra de tumor (Figura 1A). Se identificaron las frecuencias de lecturas caer en diferentes clases de pequeños ARN u otras regiones genómicas y calculadas las frecuencias medias que comparan todas las 88 muestras tumorales. La frecuencia de lee mapeo para madurar miRNAs oscilaron desde 37 hasta 77% en las bibliotecas y dieron una mediana de 61% (Figura 1B). Para las regiones intrónicas /intergénicas una mediana leer se encontró frecuencia de 33%, y para miRNAs prematuros y snoRNAs, la mediana leer frecuencias fueron 4% y 2%, respectivamente (Figura 1C). Además una pequeña fracción de lee asigna a snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, mRNA y, junto comprende una frecuencia de ~0.05%. MiRNAs con menos de 10 lecturas a través se consideraron todas las muestras de los pacientes no se expresa. En total, 523 miRNAs se expresaron en el conjunto de datos.
A. Número de lecturas (x10
6) mapeado en el genoma humano (hg19) para todas las muestras. Estos incluyen todas las especies de ARN (miARN prematura, snoRNA, snRNA, miscRNA, ARNr, ARNt y ARNm) .Las secuencias que no coincidan con la secuencia conocida se compara con las bases de datos de las regiones intergénicas y intronic del genoma humano. B. Las frecuencias de las lecturas asignadas a miRNAs maduros anotados de todas las muestras utilizando la base de datos de microARN (miRBase liberar 18). C. Pie-gráfico que representa los porcentajes de las diferentes clases de ARN que se encuentran en el conjunto de datos.
Normalización y Técnica Replica
En general, para comparar los valores de expresión entre las muestras es necesario normalizar contra el recuento de leer mediante el cálculo de un factor de normalización. Los cuatro métodos de normalización diferentes dieron resultados muy similares al comparar el cambio medio calculado por la diferencia en porcentaje para cada uno de los genes miARN lectura contar por miRNA (datos no mostrados). Las figuras 2B y 2C muestran la distribución de log2 transformado sin normalizar los recuentos de leer y leer los recuentos normalizados contra miRNAs maduros para cinco muestras de pacientes al azar. Los recuentos de lectura inferiores no fueron afectados por la normalización respecto a los valores más altos. En total, la normalización generado relativamente igualmente distribuido leer el recuento para la mayoría de miRNAs en todas las muestras.
A. La comparación de las repeticiones técnica entre la serie 1 y la corrida 2. Cada punto representa la expresión total de una sola miARN de todas las muestras de los pacientes. Los datos de los genes miARN expresión se normalizó y log2 transformado. B. unnormalized miARN leer conteos (log2) por cinco pacientes seleccionados al azar. C. Normalizado miARN leer conteos (log2) para los mismos cinco pacientes como en B.
48 muestras fueron secuenciados profunda dos veces, la corrida 1 denotado y se ejecutan 2, y estos conjuntos de datos se utilizaron para comparar la resultados de los ensayos separados. Los resultados demostraron una muy buena correlación entre las repeticiones técnica se muestra por la línea de pendiente cero (Figura 2A).
Los cinco miRNAs más altamente expresado
Los cinco miRNAs expresados de forma más abundante en esta cohorte fueron miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p y miR-192-5p (Figura 3). Los recuentos de lectura para estos miRNAs representaron el 53,7% del número total de secuencias de genes miARN detectados en las muestras de los pacientes, mientras que los 20 mejores miRNAs representaron el 82,6% de las lecturas (Tabla S1). Los 503 miRNAs restantes representaban el 17,4% de las lecturas. De los cinco primeros miARN, MIR-192-5p tenía la expresión más alta mediana (156.413 lecturas), mientras que el miR-22-3p tenía el más bajo (35,284 lecturas).
Expresión diferencial de los cinco miRNAs expresados de forma más abundante en nuestra cohorte CRC. El número total de miARN lee se transforman log2. Los círculos representan los valores atípicos y las estrellas representan los valores extremos.
Muchos de los genes miARN se encuentran en las proximidades de otros genes miARN en grupos de genes, y dos de los cinco mejores miRNAs más altamente expresado (miR-143 -3P y miR-192-5p) forman parte de estas agrupaciones. MIR-MIR-143-3p y 145-5p están ubicados en el cromosoma 5 & lt; 10 kb aparte, mientras que miR-192-5p y miR-194-5p están situados en el cromosoma 11 & lt; 10 kb aparte. Los niveles de expresión de miR-143-3p y miR-192-5p y dos miRNAs pertenecientes a sus respectivos grupos de genes se muestran en la Figura 4. Sin co-expresión era evidente para los miRNAs pertenecientes a estos grupos de genes, que está en concordancia con las anteriores resultados [29].
A. MIR-143-3p se encuentra en el mismo grupo de genes como miR-145-5p en el cromosoma 5 (posiciones 148808481 a 148.808.586 y 148.810.209 a 148.810.296, respectivamente). MIR-192-5p se encuentra en el mismo grupo de genes como miR-194-5p en el cromosoma 11 (posiciones 64658609 a 64658718 y 64658827 a 64658911, respectivamente). A pesar de que los miRNAs en cada grupo de genes es & lt; no se observó 10kb aparte, la co-expresión
Pathway Analysis para los cinco miRNAs más altamente expresado
1490 genes diana fueron identificados como. potencialmente regulados por miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p y miR-192-5p. Las vías con el más significativo de genes de enriquecimiento se muestran en la Tabla 2, y se incluyen "Pathways en el cáncer" (55 genes, p = 3,3 × 10
-7), "ciclo celular" (28 genes; p = 2,2 × 10
-6), y "El cáncer colorrectal" (21 genes; p = 1,0 × 10
-5). Centrándose en la vía de CRC, se encontró que los genes regulados por los cinco miRNAs más altamente expresados incluyen oncogenes (
KRAS, PI3K
), supresores tumorales (APC y TGFβRII), y los genes de reparación del ADN (hMSH6) y genes que pertenece a las vías de Wnt y MAPK señalización (Figura 5).
resultados de la vía de análisis de los genes diana de los cinco miRNAs más altamente expresado en la vía de cáncer colorrectal. La ilustración fue tomada de la base de datos KEGG y se añadieron los miRNAs en fuente azul para indicar los objetivos regulados por estos miRNAs.
Correlación entre QRT-PCR y secuenciación profunda datos
Los valores de expresión para seis miARN miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a y miR-145, se determinaron previamente mediante QRT-PCR [19]. La expresión de los genes miARN medida por qRT-PCR se comparó con los datos de secuenciación de profundidad utilizando análisis de regresión lineal de los valores normalizados de Ct (QRT-PCR) y los datos de profundidad de secuenciación log2-transformado. Los R
2 valores para los 6 miRNAs ensayadas fueron 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, y 0,28 para el miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a, y miR-145 , respectivamente. La suma de los niveles de expresión totales también se calculó para estos miRNAs para cada método, y los niveles relativos se muestran en la Figura 6. La expresión relativa entre miRNAs individuales era razonablemente consistentes entre los métodos para cuatro de los miRNAs (miR-21, miR-31 , miR-92a y miR-106a), mientras que no hubo diferencias claras para miR-101 y miR-145. MiR-101 fue apenas detectable con QRT-PCR, pero exhibió valores de expresión se presentan ante una secuenciación profunda, mientras que miR-145 fue detectado por QRT-PCR y apenas se detectó utilizando secuenciación de profundidad.
Los valores de expresión se normalizaron log2 transformado y analizada por no supervisado de dos vías agrupación jerárquica utilizando la unión promedio ponderado (WPGMA). El mapa global contiene todos los miRNAs expresadas muestran verticalmente y horizontalmente las muestras de los pacientes.
la agrupación jerárquica y asociaciones entre miARN expresión y Clinicopathological Parámetros
Se muestran los patrones de expresión de genes miARN observados con la agrupación jerárquica en la Figura 7 con miRNAs en el eje vertical y muestras de pacientes en el eje horizontal. La mayoría de los miRNAs mostraron niveles de expresión muy similares a través de las muestras de pacientes. En las zonas de la trama, algunos miRNAs parecían estar expresados diferencialmente, pero éstos se encuentran casi exclusivamente entre el miARN que tenía muy baja expresión. SAM análisis de datos de expresión y parámetros clínico reveló que la alta expresión de miR-10b-5p y miR-615-3p y baja expresión de miR-592 se asocia con tumores localizados en el colon derecho (incluyendo el colon ascendente y transverso) en comparación con colon izquierdo y el recto (Tabla 3). La expresión de estos miRNAs mostró 2,4 veces, 41,4 veces y diferencias 3,9 veces, respectivamente (q & lt; 0,05 para todos los miRNAs) (Figura 8). Alta expresión de miR-615-3p también se asoció con tumores poco diferenciados en comparación con los tumores de forma intermedia y bien diferenciados (44,4 doble cambio, q & lt; 0,05).
La expresión de seis miRNAs (miR-21, miR 31, miR-92a, miR-101, miR-106a y miR-145) se muestra de lo más profundo de secuenciación y QRT-PCR para 88 muestras de pacientes que fueron analizadas con ambos métodos. A. Las barras representan la suma del número total de lecturas (x10
6) para cada miRNA de secuenciación profunda. B. Las barras representan la suma de la expresión relativa (2
-dCt) de QRT-PCR.
Alta expresión de miR-10b-5p y miR-615-3p y baja expresión de miR-592 se asociaron con un tumor localizado en el colon derecho en relación con el colon izquierdo y el recto (q & lt; 0,001 y p & lt; 0,001).
las asociaciones entre miARN y Expresión Resultado
En el lazo y el análisis de Cox univariante, 5 miRNAs (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365b-3p, miR-454-3p, miR-194-3p y miR 15b-3p) con el desarrollo de metástasis como surgió punto final, y uno de los genes miARN (miR-101-5p) con la supervivencia global de punto final fue identificado, sin embargo ninguno de ellos se mantuvo significativamente asociada, ya sea con la supervivencia libre de metástasis en general- o después de ajustar por múltiples pruebas. Todos los miRNAs identificados por estos análisis se expresaron en niveles muy bajos en nuestra cohorte con la más alta expresión de la mediana observada para el miR-187 454-3p con lecturas de los más bajos de miR-194-3p con sólo el 19 lecturas.
Discusión
en el presente trabajo, se utilizó la secuenciación profunda para cuantificar la expresión de los genes miARN en una gran cohorte de muestras tumorales de CRC. Este enfoque puede contribuir ventajas potenciales en el análisis global de la expresión de los genes miARN, sino que también implica nuevos desafíos en materia de análisis de datos, como la cantidad de datos recogidos después de la secuenciación profunda contiene millones de lecturas que deben ser asignadas al genoma y normalizada [30]. En los 88 pacientes con CRC analizadas con éxito, se detectaron 523 miRNAs maduros. También se detectaron otras secuencias de ARN pequeños, pero las frecuencias de detección bajos de otras clases de ARN y las regiones genómicas mostraron que la selección para miRNAs había tenido éxito, y de acuerdo con los resultados anteriores [29], [31]. Además, la excelente concordancia observada entre repeticiones técnica sugirió reproducibilidad adecuada.
Los cinco miRNAs expresados de forma más abundante en la cohorte CRC fueron examinados miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p y miR-192-5p, y todos ellos han demostrado previamente que están alteradas en el CCR [32] - [38]. Estos miRNAs también se encontraban entre los más altamente expresado miRNAs en un estudio previo llevado a cabo mediante secuenciación profunda de 8 muestras de CRC y los tejidos normales [39] correspondiente. Curiosamente, los cinco principales miRNAs más altamente expresados representaron hasta un 54% del número total de secuencias de genes miARN detectados. Esto está en concordancia con un estudio de secuenciación profunda previo llevado a cabo en muestras de sangre periférica, en el que la familia let-7 representó el 77% del total de miARN leen los recuentos [29]. La importancia relativa de alta versus baja expresión de miRNA es difícil de interpretar, ya que la ausencia o la presencia abundante de miRNAs pueden representar igualmente importantes señales reguladoras biológicas. Sin embargo, sobrerrepresentación de un pequeño número de miRNAs puede implicar que estos miARN desempeñan papeles importantes como reguladores negativos de objetivos de abajo y las vías biológicas afectadas por estos objetivos. Los objetivos de predecir los 5 miRNAs más altamente expresados se asociaron significativamente con cáncer de las vías pertinentes, incluyendo la vía CRC. Entre los objetivos previsto en la vía de CRC eran oncogenes, supresores de tumores y genes de reparación del ADN que están implicados en varias vías de señalización importantes incluyendo Wnt, MAPK, ciclo celular, TGF-β, y p53. objetivos previsto (hMSH2 y hMSH6) también estaban involucrados en la regulación negativa de los genes de reparación del ADN que afectan a los microsatélites y son por lo tanto participan en la vía de la inestabilidad de microsatélites. Estos resultados sugieren que la identifica los cinco más altamente expresado los genes miARN son relevantes cáncer y probablemente relevante en el CCR, pero será necesario continuar investigando para validar los objetivos y evaluar los efectos aguas abajo.
Una de las supuestas ventajas de secuenciación profunda en comparación con el análisis de microarrays y QRT-PCR se mejora la especificidad y la sensibilidad, lo que sugiere que este método volvería mediciones más correcta de cada miARN que los otros métodos. Al comparar nuestros resultados anteriores, la expresión de los genes miARN utilizando seis QRT-PCR con la secuencia de datos de medición de profundidad, la correlación en el nivel de la muestra individual fue pobre para todos los miRNAs examinados. secuenciación profunda es a menudo validado por QRT-PCR, pero no se han realizado comparaciones exhaustivas entre los dos enfoques. En un estudio de secuenciación profunda en muestras de cáncer de vejiga 9, seleccionados miRNAs de secuenciación profunda fueron validados por QRT-PCR, e informaron que se correlaciona bien cuando se analizaron por diferencias de expresión de plegado en un diagrama de barras [40]. En otro estudio realizado en 10 muestras de neuroblastoma, coeficientes de correlación entre 0,1 y 1 se encontraron cuando se compara la suma de los genes miARN expresión de QRT-PCR y secuenciación profunda [41]. Las mayores discrepancias en nuestra comparación entre QRT-PCR y secuenciación se encontraron resultados para miR-101 y miR-145. El ensayo utilizado para QRT-PCR así como la secuenciación fueron ambos capaces de detectar, pero no separar entre isoformas conocidas de estos miRNAs. En la secuencia de datos, no se encontraron variaciones de nucleótidos que podría explicar las discrepancias. En teoría, la ausencia de detección de miR-101 de QRT-PCR podría ser un problema de sensibilidad, mientras que para el miR-145, la falta de especificidad de la prueba QRT-PCR podría explicar las discrepancias. Por lo tanto, parece claro si QRT-PCR se puede utilizar para fines de validación, ya que los datos de secuenciación profundas QRT-PCR y se generan con diferentes métodos y aparecen en diferentes escalas con rangos de expresión variable, por lo que es difícil comparar los dos conjuntos de datos en un paciente -to-paciente base.
Uno de los objetivos de este estudio fue investigar las asociaciones entre la expresión de los genes miARN y parámetros clínico y los resultados. Dada la baja variabilidad observada entre las muestras, no es sorprendente que no se detectaron pocas de tales asociaciones. El uso de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante, no se encontraron miRNAs que se asocia con el desarrollo de la metástasis o la supervivencia general después de la corrección de múltiples ensayos. No hay miARN fueron seleccionados en el análisis LASSO. Bajo la expresión de miR-592 y la alta expresión de miR-10b-5p y miR-615-3p se asocia con tumores localizados en el colon derecho en comparación con los tumores en el colon izquierdo y el recto. Alta expresión de miR-615-3p también se asoció con tumores poco diferenciados. Se informó de miR-10b anteriormente a estar regulado por disminución en el CCR y alta expresión se asoció con la avanzada PT-fase [42], pero no se detectaron este tipo de asociaciones en nuestra cohorte. MiR-592 ha sido encontrado para ser regulados a la baja en los tumores con deficiencia de reparación de genes de reparación desajuste en comparación con los tumores con dominio [43], [44]. desajuste de reparación deficiente da lugar a inestabilidad de microsatélites, y en CCR esporádico, tumores inestables de microsatélites están con frecuencia situado en el lado derecho del colon [45], [46]. Por lo tanto, una baja expresión de miR-592 en los tumores del colon derecho en el presente estudio sería consistente con los resultados anteriores, pero ya muy poco se sabe actualmente con respecto a los objetivos de este miARN, aclarar esta cuestión requeriría más estudios. MiR-615 exhibió la más notable diferencia en la expresión entre el derecho y el colon izquierdo en esta cohorte, y también fue altamente expresado en los tumores pobremente diferenciados. Hay pocos informes sobre la expresión y función de este miARN, pero en un estudio, la expresión de miR-615 se downregulated cuando la propuesta NGX6 supresor de tumores se introdujo experimentalmente en la línea celular HT29 CRC humana. En nuestra cohorte, 7 de los 10 tumores mal diferenciados fueron localizados en el colon derecho.