Extracto
cribado sistemático basado en la similitud estructural de drogas tales como la colchicina y podofilotoxina condujo a la identificación de noscapina, un agente de microtúbulos dirigida que atenúa la inestabilidad dinámica de los microtúbulos sin afectar a la masa total de polímero de microtúbulos. Se presenta una nueva generación de derivados noscapina como potenciales agentes anti-cáncer de unión a tubulina. experimentos de modelización molecular de estos derivados 5a, 6a-j rindieron mejor puntuación de acoplamiento (-7,252 a -5,402 kCal /mol) que el compuesto original, noscapina (-5,505 kCal /mol) y sus derivados existentes (-5,563 a -6,412 kcal /mol). La energía libre (Δ
G
bind)
cálculos basados en la energía de interacción lineal (LIE) ecuación empírica que utiliza Superficie Generalizado Born (SGB) continuo modelo disolvente predijo las afinidades de unión de tubulina para los derivados 5a, 6a-j (que van de -4.923 a -6.189 kcal /mol). 6f compuesto mostró afinidad más alta de unión a la tubulina (-6,189 kCal /mol). La evaluación experimental de estos compuestos corroborados con estudios teóricos. N- (3-brormobenzyl) noscapina (6f) se une tubulina con la más alta afinidad de unión (K
D, 38 ± 4,0 M), que es ~ 4,0 veces más alto que el del compuesto original, noscapina (K
D , 144 ± 1,0 M) y es también más potente que la de la primera generación candidato clínico EM011, 9-bromonoscapine (K
D, 54 ± 9,1 M). Todos estos compuestos exhiben citotoxicidad sustancial hacia las células cancerosas, con CI
50 valores que van desde 6,7 M a 72,9 M; compuesto 6f mostró una eficacia contra el cáncer prominente con IC
50 valores que van desde 6,7 M a 26,9 M en células de cáncer de diferentes tejidos de origen. Estos compuestos perturbado síntesis de ADN, retraso de la progresión del ciclo celular en fase G2 /M, y la muerte celular apoptótica inducida en las células cancerosas. En conjunto, el estudio informó aquí identificado potentes, noscapinoids de tercera generación como nuevos agentes contra el cáncer.
Visto: Manchukonda NK, PK Naik, Santoshi S, M Lopus, Joseph S, Sridhar B, et al. (2013) Diseño racional, síntesis y evaluación biológica de Tercera Generación α-noscapina Análogos tan potente tubulina Encuadernación medicamentos anticancerosos. PLoS ONE 8 (10): e77970. doi: 10.1371 /journal.pone.0077970
Editor: Chandra Verma, Instituto de Bioinformática, Singapur
Recibido: 23 de febrero, 2013; Aceptado: September 6, 2013; Publicado: 21 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Manchukonda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La ayuda financiera a través de MLP 0002 & amp; CSIR 12º año cinco proyectos (CSC0108-ORIGEN & amp; CSC0205 - DeNova). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
A diferencia de los fármacos quimioterapéuticos, tales como alcaloides de la vinca paclitaxel y que son confundidos por complicaciones con efectos secundarios indeseables, tales como toxicidad sistémica, noscapina [1-3], un antitusivo alcaloide over-the-counter [4 unión a tubulina actual , 5], está dotado con mejor perfil de anti-cáncer [6-8] y más seguro perfil de toxicidad [9-11]. Mecánica, noscapina se une tubulina con una estequiometría de uno (0,95 ± 0,02) molécula noscapina por dímero de tubulina, altera la conformación tubulina tras la unión [12] sin embargo, permite la polimerización de la tubulina en microtúbulos (MTs) [13,14]. Noscapina, sin embargo, induce la supresión de menor importancia de la inestabilidad dinámica de los microtúbulos [13,14]. Como resultado de ello, los bloques de noscapina mitosis en prometafase, y tal vez debido a los puntos de control comprometidas, las células cancerosas selectivamente quedan comprometidos con la muerte celular apoptótica dañar las células normales [6-14]. Desde una perspectiva farmacológica, noscapina tiene muchas ventajas como un agente de unión a microtúbulos [1]. Es eficaz contra líneas de células cancerosas resistentes a múltiples fármacos, afecta a las células de cáncer de forma diferente a las células que se dividen normales [15,16], tiene mejor perfil farmacocinético [17,18] y no daña los tejidos normales (por lo tanto carente de efectos secundarios tóxicos) [ ,,,0],19,20]. A pesar de que la noscapina se ha encontrado para ser citotóxica contra una amplia gama de células cancerosas en la biblioteca pública del Instituto Nacional del Cáncer, EE.UU. (NCI pantalla 60 de células), el IC
50 valores permanece en los altos rangos de micro molares ( ~ 21,1 a 100 M) [12]. Como resultado, diversos agentes de tubulina de orientación basados en noscapina han sido desarrollados por modificaciones en su mayoría en A, B y C sitios (Figura 1A) en el andamio noscapina [21-28]. Estos compuestos se conocen como noscapinoids (Figura 2). Los análogos de primera generación sintetizados por la manipulación química en el punto diversidad A en el sistema de anillo de isoquinolina de noscapina (Figura 1A) incluyen nitro [21], azido [22], amino [23,24] y halogenado [25-27] ( fluoro, cloro, bromo, y yodo) análogos a-noscapina, y que muestra actividad anti-cáncer superior. En base a estos puntos de vista, el anillo de lactona de benzofuranona (diversidad punto B, Figura 1 A) se redujo a su análogo de éter cíclico [28] (por ejemplo 4a) y examinó por su potencia como la unión de tubulina agentes [29]. Además diversificación en el punto C (figura 1A) en el sistema de anillo benzofuranona de noscapina ha informado para dar la segunda generación de O-alquilado [30] /acilado [31] noscapinoids, incluyendo el derivado de hidroxi que es más potente que la noscapina padre. Estos informes sugieren que las maniobras química de grupos funcionales incorporados de noscapina tiene un impacto significativo en su actividad biológica. En la continuación de nuestros esfuerzos en el diseño de nuevos derivados de noscapina, decidimos introducir modificaciones en el punto de la diversidad D (Figura 1B) por funcionalización de "N" en isoquinolina unidad de α-noscapina naturales (los llamamos terceros análogos de generación de α-noscapina ) que se prevé para mejorar la actividad biológica. Los informes descritos en funcionalización en 'N' son a través de enlaces tipo urea [32] y mucho no ha sido explorado por su eficacia biológica. Creemos que tipo urea enlace puede no ser la opción correcta, ya que se perturbe la densidad de electrones en isoquinolina N a través de la deslocalización. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos adoptado para introducir grupos funcionales manteniendo el entorno electrónico en su mayoría intactos N (es decir, para mantener el efecto del grupo metilo intacta). Por lo tanto, "H" en la N-CH
3 es el objetivo para la modificación. Todos los derivados descritos y sintetizados están en línea con esta estrategia de diseño (Figura 3).
(A) Varios puntos de diversidad para la derivatización de α-noscapina y (B) la estrategia de diseño para los nuevos análogos de alfa-noscapina (básico esqueleto y la estereoquímica es el mismo que en el α-noscapina natural)
las condiciones de reacción: (i) un:.
m
CPBA, DCM; b: HCl 2 N; c: FeSO
4.7H
2O; (Ii) R-Br, KI, K
2CO
3, acetona.
A continuación se presenta la tercera generación congéneres noscapina 6a-j, que se diferencian en el sustituyente unido al isoquinolina ' N 'de α-noscapina natural.
in silico
cálculos de modelización molecular de estos análogos con complejo tubulina fueron empleados para investigar su afinidad de unión basado en el modelo predictivo razonable. Los nuevos análogos, nornoscapine 5a y 6a-j se sintetizaron químicamente y se examinaron para sus propiedades de unión a tubulina, y por sus efectos sobre la progresión del ciclo celular y la actividad anti-proliferativa en que se dividen rápidamente las células cancerosas usando líneas celulares de cáncer humano representativas de pulmón, mieloma, de mama y de cuello uterino.
Materiales y Métodos
A:. metodología computacional
Preparación de ligando
Las estructuras moleculares de nuevos derivados de noscapina 5a, 6a-j (Figura 3) junto con los reportados noscapinoids 1, 2a-f (Figura 2) se construyeron usando constructor molecular del Maestro (versión 9.2, Schrödinger). Todas estas estructuras se redujeron al mínimo el uso de la energía macromodelo (versión 9.9, Schrödinger) y el campo de fuerza OPLS 2005 con el algoritmo PRCG (1000 pasos de minimización de la energía y del gradiente de 0.001). orden de enlace apropiada para cada estructura se le asigna el uso de Ligprep (versión 2.5, Schrödinger). optimización geométrica completa de estas estructuras se llevó a cabo utilizando la teoría de la densidad funcional híbrido con potencial de cambio de tres parámetros de Becke y la correlación Lee-Yang-Parr funcional (B3LYP) [33,34] con base establecida 3-21G * [35-37] . Jaguar (versión 7.7, Schrödinger, LLC) se utilizó para la optimización geométrica de los ligandos.
Preparación de Proteína
La compleja estructura colchicina-tubulina co-cristalizado (AP ID: 1SA0, resolución 3.58Å). [38] se utilizó para el acoplamiento molecular y listas de hipótesis. Multi-paso del asistente preparación de proteína de Schrödinger (PPrep) se utilizó para la preparación final de la proteína. Faltan los átomos de hidrógeno se han añadido a la estructura mediante la interfaz Maestro (versión 9.2, Schrödinger). Todas las moléculas de agua se retiraron del complejo y optimizan la red de enlaces de hidrógeno utilizando el asistente PPrep. Los aminoácidos que faltan de 37 a 47 (A-cadena) y 275 a 284 (cadena B) en la estructura co-cristalizado se llenaron utilizando la técnica de modelado basado en homología basado en diferentes plantillas como PDB ID: 3DU7 (cadena C ) y AP ID: 3RYC (D-cadena), respectivamente, con el primer (versión 3.0, Schrödinger). La estructura obtenida fue minimizada utilizando la energía del campo de fuerza OPLS 2005 con Polak-Ribiere gradiente conjugado (PRCG) algoritmo. La minimización se detuvo, ya sea después de 5.000 pasos o después de que el gradiente de energía convergente por debajo de 0,001 kcal /mol. Todo átomo de dinámica molecular (MD) de simulación de la estructura de proteínas en agua explícita se llevó a cabo usando el software GROMACS 4.5.4 [39] y el campo de fuerza GROMOS96 para una escala de tiempo de 10 ns. Se impusieron tridimensionales condiciones de contorno periódicas, que encierra la molécula en un dodecaedro solvatado con el modelo SPC216 agua incluida en el envase GROMACS y energía reducido al mínimo el uso de 1000 pasos de descenso más agudo. El sistema se neutralizó con Na 32
+ contraión y se redujo al mínimo el uso de 100 pasos a nivel local de máxima pendiente. El término electrostática se describe el uso de la partícula de malla Ewald algoritmo [40]. Los LINCS [41] algoritmo se utilizó para limitar todas las longitudes de enlace y de corte de distancias para el cálculo de las interacciones de Coulomb y de van der Waals en 1,0 nm. El sistema se equilibró por 100 ps de MD se ejecuta con las restricciones de posición sobre la proteína para permitir la relajación de las moléculas de disolvente en 300 K y presión normal. El sistema se acopla a la baño externo por el termostato Berendsen con un tiempo de acoplamiento de 0,1 ps con la configuración predeterminada. Los cálculos MD finales se realizaron para 10,0 ns, en las mismas condiciones con un paso de tiempo de 2 fs. La calidad general de los modelo obtenido, valores estereoquímicas y las interacciones no unido se ensayaron usando PROCHECK [42], ERRAT [43] y Verify3D [44]. Los resultados mostraron PROCHECK 94,8% de los ángulos de la columna vertebral se encuentran en regiones permitidas con G-factores de - 0,12. gráfico de Ramachandran [45] El análisis reveló sólo un 1,6% de residuos en la región anulado y 2,3% de residuos en las regiones generosamente permitido. ERRAT es un programa de la calculadora "factor de calidad global" para las interacciones atómicas no enlazados. El rango aceptado en ERRAT es de 50 y mayores puntuaciones indican la precisión del modelo. En el caso de la tubulina, la puntuación ERRAT era 88.402 que está dentro de la gama de modelo de alta calidad. Del mismo modo, la puntuación VERIFICAR 3D del 95,25% indica un modelo de buena calidad.
acoplamiento molecular de los ligandos y el cálculo de las energías de unión.
El archivo de receptor de la red se genera en el centroide del sitio de unión noscapinoid [46] utilizando Glide (versión 5.7, Schrödinger). Un cuadro de límite de tamaño de 12Å x 12Å x 12Å se definió en la tubulina y centrado en el centro de masa del sitio de unión con el fin de confinar el centro de masa del ligando acoplado. También se definió el cuadro que encierra mayor de tamaños de 12Å x 12Å x 12Å que ocupaba todos los átomos de las poses atracados. El factor de escala de 0,4 para van der Waals radios se aplicó a los átomos de proteína con cargas parciales absolutos inferior o igual a 0,25. Todos los ligandos se acopló a continuación, en el sitio de unión utilizando Glide XP (precisión adicional) y se evaluaron usando un deslizamiento XP
Resultado función [47,48]. Por otra parte, los complejos atracados de estos ligandos se reduce al mínimo la energía híbrida basan en la simulación de Monte Carlo y su energía libre de unión (Δ
G
se unen
) sobre la tubulina se predijo usando energía de interacción lineal método (LIE) con una superficie generalizada Born modelo de solvatación (SGB) continuo. El modelo LIE-SGB calcula las afinidades de unión de un conjunto de nuevos compuestos que utilizan los datos experimentales afinidad de unión de un conjunto de conjunto de entrenamiento. En este estudio hemos utilizado la formulación original del SGB-LIE (ecuación 1) propuesto por Jorgensen [49] y aplicado en el paquete de Enlace (versión 5.6, Schrödinger, LLC), utilizando la fuerza OPLS-2005 field.
Δ
G
b
i
n
d
=
α
(
〈
U
v
d
w
b
〉
−
〈
U
v
d
w
f
〉
)
+
β
(
〈
U
e
l
e
c
b
〉
−
〈
U
e
l
e
c
f
〉
)
+
γ
(
〈
U
c
a
v
b
〉
−
〈
U
c
a
v
f
〉
)
(1)
Here ⟨⟩ Representan la media de conjunto,
b
representa la forma unida del ligando,
f
representa la forma libre del ligando, y α, β, y γ son los coeficientes.
T
VDW
,
T
elec
, y
T
¿Cuáles son las cav de van der Waals, términos electrostática, y la energía de la cavidad en el continuo SGB modelo de disolvente. El término de energía de la cavidad,
T
cav
, es proporcional al área de superficie expuesta del ligando. Varios parámetros de energía incluidos en la ecuación 1 se calcularon a partir del complejo atracado correspondiente a cada análogo usando el paquete de enlace como se describe anteriormente [24]. Los términos de energía LIE promedio fueron utilizados para la construcción del modelo afinidad de unión y la estimación de energías libres de derivados noscapina vinculante. La α
, España β, y γ LIE parámetros de ajuste se determinaron utilizando el paquete estadístico Minitab (versión 16.0, Minitab Inc.) mediante el ajuste de las afinidades de unión de moléculas experimentales del conjunto de entrenamiento. Un conjunto de datos que consta de 7 noscapina derivados (compuestos: 1, 2a-f; Figura 2) con afinidades de unión experimentales conocidos se utilizó como un conjunto de entrenamiento.
B:. metodología Experimental
La síntesis química de los derivados de noscapina
Reactivos y todos los disolventes eran analíticamente pura y se utilizaron sin purificación adicional. Todas las reacciones se realizaron en matraces de secado al horno con agitación magnética. Todos los experimentos se controlaron mediante cromatografía en capa fina analítica (TLC) realizada en gel de sílice GF254 placas pre-recubiertas. Después de la elución, las placas se visualizaron bajo iluminación UV a 254 nm para materiales activos UV. La tinción con PMA y carbonización en una placa caliente logrado adicionalmente a la visualización. Se eliminaron los disolventes
a vacío
y se calienta en un baño de agua a 35 ° C. Silica gel fino que la malla 200 se utilizó para cromatografía en columna. Las columnas se envasarán en suspensión de gel de sílice en hexano y se equilibró con la mezcla disolvente apropiado /disolvente antes de su uso. Los compuestos se cargaron puro o como una solución concentrada usando el sistema de disolvente apropiado. La aplicación de presión con una bomba de aire asistida por la elución. Los rendimientos se refieren a materiales cromatográficamente y espectroscópicamente homogéneos a no ser que se indique lo contrario. nombres apropiados para todos los nuevos compuestos se dieron con la ayuda de ChemBioOffice 2010. Los puntos de fusión se midieron con un aparato de punto de fusión Fischer-Johns y están sin corregir. La pureza de todos los compuestos (& gt; 96%) que se utilizan para el cribado biológico se determinó por HPLC analítica (SPD-M20A, hacer: Shimadzu) utilizando una columna de ODS se eluyó con la mezcla de gradiente de acetonitrilo-agua. La espectroscopía infrarroja espectros (IR) se registraron como líquidos puros o pellets y absorciones de KBr se informó en cm
-1. resonancia magnética (RMN) Nuclear se registraron en 300 (Bruker) y espectrómetros de 500 MHz (Varian) en disolventes apropiados utilizando tetrametilsilano (TMS) como las señales de disolvente como patrones secundarios y los desplazamientos químicos estándar interno o se muestran en escalas delta. Las multiplicidades de señales de RMN se designan como s (singlete), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), a (ancho), m (multiplete, para las líneas sin resolver), etc.
13C espectros de RMN fueron grabada en 75 MHz espectrómetro. Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se obtuvieron mediante el uso de ESI-QTOF espectrometría de masas. Las rotaciones ópticas se midieron con un polarímetro Roudolph Digipol 781 a 25 ° C. Comercialmente disponible disolventes hexano, CH
2Cl
2, y EtOAc se utilizaron como tales sin purificación adicional. Natural α-noscapina se adquirió de Sigma-Aldrich y se utiliza como tal. El enfoque sintético para la preparación de derivados de noscapina, 6a-j se representa en la Figura 3. Todos estos derivados se sintetizaron a partir nornoscapine 5a como material de partida, que a su vez se sintetizó a partir noscapine.
(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-
g
]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a): A una solución de noscapina α- natural (2,0 g, 4,84 mmol) en diclorometano (15 ml) se añadió mCPBA (1,66 g, 9,7 mmol) en porciones a 0 ° C. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano (20 ml), el exceso de peróxido se inactivó con 1 M aq. solución de NaHSO
3 (15 ml), se separó después la capa orgánica, se secó con anhidro Na
2SO
4, y se concentró. El residuo bruto se disolvió en metanol (20 ml), se acidificó a pH 1,0 usando HCl 2 N, se agitó durante 5 min y se filtró. El filtrado se concentró a presión reducida, se volvió a disolver en diclorometano (20 ml), se secó con anhidro Na
2SO
4, se filtró y se concentró. El sólido amarillo α- noscapina sal pálida N-oxide.HCl así obtenido se disolvió en metanol (20 ml), se añadió FeSO
4.7H
2O (2,69 g, 9,68 mmol). Después de agitar la mezcla a temperatura ambiente durante 12 h, la mezcla de reacción se concentró y se trató con amoniaco acuoso 25% para conseguir pH 10, se extrajo con diclorometano (3 x 10 ml), se secó con anhidro Na
2SO
4 , y se evaporó a presión reducida. El residuo bruto se sometió a cromatografía en columna de gel de trietilo sílice tratada amina y se eluyó con 3: 7 acetato de etilo: hexano (2: 3) gave(S)-6,7-dimethoxy-3-((
R
)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-
g
]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a) (0,92 g, 48%) como un sólido blanco. pf 170 ° C; [Α]
D
25 = -105,6 (c = 1, metanol), Rendimiento: 48% IR ν
max (cm
-1): 3360, 2942, 1759, 1624, 1501 , 1280, 1119, 1074, 1042, 1023, 932, 796, 679
1.HNMR (300 MHz, CDCl
3): δ 6,94 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1H), 5,99-5,89 (m, 4H), 4,85 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,09 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 2,69-2,58 (m , 1H), 2,54-2,42 (m, 1H), 2,36-2,23 (m, 1H), 02.22 a 02.09 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl $
3) δ 168,5, 152,1 , 148.3,147.8, 141,0, 140,4, 134,1, 131,9, 119,6, 118,3, 117,5, 116,9, 103,1, 100,7, 20,6, 62,2, 59,4, 56,6, 52,7, 39,5, 29,7 MS (ESI)
m
/
z
400 [M + H]
+; HRMS (ESI) Calculado para C
21H
22NO
7: 400,1396, encontrado:.. 400.1401
Procedimiento general para la preparación de 6a-j
A la solución de (
S
)-6,7-dimethoxy-3-((
R
)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-
g
]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one 5a (200 mg, 0,50 mmol) en acetona (5 ml), se añadió carbonato de potasio (1,10 mmol), yoduro de potasio (0,5 mmol) y bromuro de alquilo (0,55 mmol) y se agitó a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. mezcla de reacción bruta se filtró, el filtrado se evaporó a vacío, agua (5 ml) y diclorometano (2 X 10 ml) se añadió, la capa orgánica se separó, se lavó con H
2O, se secó sobre sulfato sódico anhidro
2SO
4 y se filtró. El residuo así obtenido se cromatografió sobre columna de gel de sílice tratada trietil amina eluyendo con hexano /acetato de etilo (70:30) para dar 6a-j como productos sólidos
(S) -3 -. ((
R
) -6-bencil-4-metoxi-5,6,7,8-tetrahidro- [1,3] dioxolo [4,5
g
] isoquinolin-5-il) - 6,7-dimethoxyisobenzofuran-1 (3H) -ona (6a): Rendimiento: 93%; pf 64 ° C; [Α]
D
25 = 1,3 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3503, 2490, 2837, 1759, 1621, 1595, 1569, 1498, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695
1.HNMR (300 MHz, CDCl
3) 7,33-7,15 (m, 5H), 6,98 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1H), 6,17 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,94 ( s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4.15 a 4.6 (m, 4H), 4,02 (s, 3H), 3,86 (s, 3H ), 3,66 (d, J = 13,21 Hz, 1H), 2,51-2,36 (m, 2H), 2,35-2,15 (m, 1H), 2,06-1,91 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 168,1, 152,2, 148,4, 147,8, 141,3, 140,5, 139,0, 133,9, 131,9, 128,7, 126,9, 119,8, 118,2, 117,7, 116,9, 102,4, 100,7, 81,7, 61,5, 59,6, 56,7, 59,6 , 62,3, 45,1, 26,5. MS (ESI)
m
/
z 490
[M+H]
+
5(S)-3-((R)-6-(4-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6b): Rendimiento: 95%; pf 76 ° C; [Α]
D
25 = -146,0 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3493, 2939, 2837, 1759, 1622, 1596, 1497, 1479, 1271, 1213, 1115, 1079, 971, 789, 711, 644, 479, 811 , 746
1.HNMR (300 MHz, CDCl $
3) δ 7,37 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,04 (bs, 1H), 5,94 (s, 2H), 5,59 (s ancho, 1H), 4,57 (d, J = 3,77 Hz, 1H,), 4,14-3,89 ( m, 7H), 3,85 (s, 3H), 3,57 (d, 1H), 2,46-2,09 (m, 3H), 2,00-1,84 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl $
3) delta 168,1, 152,2, 148,5, 147,8, 141,0, 140,4, 138,0, 133,9, 131,8, 131,2, 130,4, 120,6, 119,8, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7, 81,5, 62,3, 61,0, 59,4, 59,3, 56,7 , 45,3, 26.6.MS (ESI)
m
/
z
568 [m + H]
+. HRMS (ESI) Calculado para C
28H
27NO
7: 568,0970, encontrado: 568.0946.
(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-nitrobenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6c): Rendimiento: 94%; pf 154 ° C; [Α]
D
25 = 68,0 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3490, 3078, 2931, 2901, 2837, 1751, 1620, 1520, 1499, 1389, 1343, 1274, 1213, 1080, 972, 852, 733, 610
1.HNMR (300 MHz, CDCl $
3) delta 8,13 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,30 (s, 1H), 6,01-5,92 (m, 3H), 5,62 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3.77Hz, 1H), 4,27 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,09 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 2,44-2,28 (m, 2H), 2.23 a 2.13 (m, 1H), 2,00-1,85 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 168,1, 152,3, 148,6, 147,8, 147,1, 147,0, 140,6, 140,3, 134,0, 131,7 , 129,0, 123,4, 119,9, 118,1, 117,7, 116,3, 102,4, 100,8, 81,4, 62,3, 61,4, 59,5, 59,4, 56,6, 46,0, 27,0. MS (ESI)
m
/
z
557 [M + H]
+; HRMS (ESI) Calculado para C
28H
26N
2O
9na: 557,1536, encontrado: 557.1557.
(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6d): Rendimiento: 92%; pf 66 ° C; [Α]
D
25 = 6,66 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3492, 2936, 2836, 1759, 1613, 1511, 1269, 1115, 1013, 970, 821, 713, 517 cm
-1 1.HNMR ( 300 MHz, CDCl $
3) 7,15 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,28 (s, 1H ), 6,12 (d, J = 8.12Hz, 1H), 5,93 (s, 2H), 5,58 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 3,55 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H ), 4,03 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,55 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,50-2,13 (m, 3H), 2,04-1,83 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 168,1, 158,5, 152,1, 148,4, 147,7, 141,2, 140,5, 133,9, 131,7, 130,0, 119,7, 118,1, 117,8, 113,4, 116,6, 102,4 , 100,6, 81,5, 62,3, 60,7, 59,3, 59,2, 56,7, 55,1, 44,8, 26.2.MS (ESI)
m
/
z
520 [m + H]
+ ; HRMS (ESI) Calculado para C
29H
29 NO
8NA: 542,1790, encontrado: 542.1817.
(S)-3-((R)-6-(3-chlorobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6e): Rendimiento: 92%; pf 62 ° C; [Α]
D
25 = 36,0 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3395, 3022, 2925, 2849, 1728, 1603, 1486, 1302, 1261, 1186, 1058, 811, 747
1.HNMR (300 MHz, CDCl
3) delta 7.29 a 7.12 (m, 4H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s , 2H), 5,67 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4.17 a 4.8 (m, 4H), 4,05 (s, 3H), 3,87 (s, 3H) , 3,63 (d, J = 13,59 Hz, 1H), 2,49-2,37 (m, 2H), 2.31 a 2.16 (m, 1H), 2,06-1,93 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 168,1, 152,2, 148,5, 141,2, 140,9, 140,4, 133,9, 131,8, 129,4, 128,4, 127,0, 126,7, 119,7, 118,1, 117,7, 116,6, 102,3, 100,7, 81,7, 64,3, 62,4, 61,2, 59.5, 59.3, 56.6, 45.5, 26.8. MS (ESI)
m
/
z 524
[M+H]
+.
(S)-3-((
R
)-6-(3-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6f): Rendimiento: 97%; pf 65 ° C; [Α]
D
25 = 52,0 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3503, 2940, 2837, 1759, 1621, 1498, 1387, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695
1.HNMR: (300 MHz , CDCl
3) delta 7,40-7,30 (m, 2H), 7.24 a 7.9 (m, 2H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H), 6,15 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4.17 a 4.6 (m, 4H), 4,04 (s , 3H) 3,87, (s, 3H), 3,63 (d, J = 13,78 Hz, 1H), 2,50-2,37 (m, 2H), 2,32-2,19 (m, 1H), 2,07-1,92 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) 168,1, 152,2, 148,5, 147,9, 141,5, 140,4, 134,0, 131,8, 131,4, 130,0, 129,7, 127,3, 122,2, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7 , 81,6, 81,1, 62,5, 61,1, 59,5, 59,3, 56,7, 45,4, 26,8. MS (ESI) m /z 568 [M+H]
+.
(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(3-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-il) isobenzofuran-1 (3H) -ona (6 g): Rendimiento: 94%; pf 60 ° C; [Α]
D
25 = -144,01 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3501, 2941, 2836, 1760, 1620, 1598, 1497, 1387, 1268, 1212, 1012, 933, 786, 693
1.HNMR (300 MHz, CDCl
3) delta 7.21 hasta 7.11 (t, 1H), 7,00-6,89 (m, 2H), 6,84-6,72 (m, 2H), 6,33 (s, 1H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,67 (d, 4,53, 1H), 4,62 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 3,88-3,80 (m, 7H), 3,63 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,51-2,33 (m, 2H), 2,33-2,16 (m, 1H), 2,03-1,87 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 168,1, 159,6, 152,2, 148,4, 147,8, 141,2, 140,7, 140,5, 133,9, 131,9, 128,8, 120,9, 119,9, 118,2, 117,7, 116,8, 113,6, 113,0, 102,4, 100,7 , 81,5, 62,3, 61,6, 59,4, 59,3, 56,7, 55,2, 45,2, 26,4. MS (ESI) m /z 520 [M+H]
+.
(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(2-oxopropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-il) isobenzofuran-1 (3H) -ona (6h): Rendimiento: 98%; pf 179 ° C; [Α]
D
25 = -34,0 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3393, 2957, 2904, 2840, 1764, 1706, 1624, 1500, 1482, 1387, 1364, 1275, 1223, 1041, 1010, 941, 897, 828 , 710, 693, 538.cm
-1 1.HNMR (300 MHz, CDCl $
3) 6,90 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,00-5,88 (m , 3H), 5,51 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,64 (d, J = 4,15 Hz, 2H), 2,50-2,39 (m, 2H), 2,37-2,29 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,91-1,76 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 167,7, 153,2, 148,5, 140,3, 140,2, 131,8, 120,2, 118,0, 117,7, 116,8, 102,4, 100,7, 96,0, 81,8, 67,6, 62,1, 59,4, 59,0, 56,6, 47,3 , 29,6, 28,2, 27,2. MS (ESI)
m
/
z
456 [M + H]
+; HRMS (ESI) Calculado para C
24H
25NO
8NA: 478,1477, encontrado: 478,1470
metilo. 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6i): Rendimiento: 97%; pf 155 ° C; [Α]
D
25 = -66,6 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3488, 3006, 2947, 2919, 2851, 1755, 1627, 1590, 1484, 1387, 1265, 1214, 1085, 1017, 894, 789, 735, 696 , 546
1.HNMR (300 MHz, CDCl $
3) δ 6,96 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,03 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 3,21 Hz, 2H), 5,52 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,86 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,80 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 2,81-2,53 (m, 2H), 2,40-2,23 (m, 1H), 1,94-1,74 (m, 1H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl
3) δ 171,7, 167,8, 152,1, 148,3, 147,5, 140,2, 140,1, 134,2, 131,8, 120,1 , 117.9, 117.7, 117.3, 102.3, 100.7, 82.2, 62.1, 59.4, 58.2, 58.1, 56.6, 51.1, 47.3, 28.9.MS (ESI) m /z 494 [m + H]
+.
etil 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-
g
]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6j): Rendimiento: 98%; pf 92 ° C; [Α]
D
25 = -174,68 (c = 1, diclorometano); IR ν
max (cm
-1): 3511, 2945, 2921, 2839, 1763, 1727, 1625, 1481, 1389, 1270, 1203, 1111, 1032, 931, 817, 790, 703, 614
1.HNMR (300 MHz, CDCl $
3) δ 6,90 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,27 (s, 1H), 6,01-5,82 (m, 3H), 5,44 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,84 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,19-4,00 (m, 8H), 3,85 (s, 3H), 3,83 (d, 1H), 3,49 (d, J = 17,56 Hz , 1H), 2,75-2,54 (m, 2H), 2,38-2,20 (m, 1H), 1,91-1,71 (m, 1H), 1,24 (t, 3H)
13.CNMR (75 MHz, CDCl $
3) delta 171,2, 167,7, 152,1, 148,3, 147,5, 140,3, 140,1, 134,2, 131,9, 120,2, 117,8, 117,7, 117,4, 102,3, 100,7, 96,0, 82,2, 62,2, 60,1, 59,4, 58,1, 56,6, 47,3, 29.0, 14.1. MS (ESI) m /z 486 [M + H]
+; HRMS (ESI) Calculado para C
25H
27 NO
9na: 508,1583, encontrado:. 508.1578 datos
análisis cristalográfico de rayos X
de rayos X para. la 6h compuestos y 6i se recogieron a temperatura ambiente usando un difractómetro Bruker CCD inteligente Apex con grafito monocromática radiación MoKα (λ = 0.71073Å) utilizando ω-scan método [50]. parámetros de red preliminares y matrices de orientación se obtuvieron a partir de cuatro conjuntos de marcos. La integración y la ampliación de los datos de intensidad se realizó utilizando el programa SAINT. Las estructuras de 6h y 6i se resolvieron por métodos directos utilizando SHELXS97 y refinamiento se llevó a cabo por la matriz completa de mínimos cuadrados usando la técnica SHELXL97 [50]. los parámetros de desplazamiento anisotrópico se incluyeron para todos los átomos que no son hidrógeno. Todos los átomos de hidrógeno unidos a C y N se encuentran en los mapas de diferencia de Fourier y se geométricamente optimizado y permitieron que los átomos de montar, con CH = ,93-,97 Å, NH = 0,86 Å, con T
iso (H) = 1,5 U
eq (C) de metil H o 1.2U
eq (C, N). Se dejó que las grupos metilo para girar pero no hasta la punta de datos
Crystal durante 6 horas:. C
24H
25NO
8,
M
= 455,45, placa incolora, 0,17 x 0,15 x 0,07 mm
3, ortorrómbico, grupo espacial
P página 2
12
12
1 (N ° 19),
a = 8,7173
(12),
b
= 12,8144 (17),
c
= 19,436 (3) Å,
V
= 2171,2 (5) Å
3
Z
= 4,
D
c = 1,393 g /cm
3, F
000 = 960, detector de área CCD, la radiación MoKα, λ = 0,71073 Å,
T
= 294 (2) K, 2
θ
max = 50,0 °, 21015 reflexiones recogidas, 2200 único (R
int = 0,0227). Goof final = 1,045,
R1
= 0,0279,
wR2
= 0,0774,
R
índices basados en 2086 reflexiones con I & gt; 2σ (I) (refinamiento de F
2), 302 parámetros, 0 restricciones, μ
= 0,105 mm
-1. CCDC 914991 contiene datos cristalográficos complementarias para la estructura. La elucidación detallada de la estructura y análisis de cristales será publicado en otros lugares datos
Crystal para 6i:. C
24H
25NO
9,
M = 471,45
, de agujas incoloras , 0,18 0,12 0,08 mm
3, tetragonal, grupo espacial
P página 4
32
12 (N ° 96),
a
=
b
= 11,6748 (4),
c
= 32,753 (2) Å,
V
= 4464,3 (4) Å
3
Z
= 8,
D
c = 1,403 g /cm
3, F
000 = 1984, detector CCD de la zona, la radiación MoKα, λ = 0,71073 Å,
T
= 294 ( 2) K, 2
θ
max = 50,0 °, 43048 reflexiones recogió, 2346 único (R
int = 0,0252). Goof final = 1,051,
R1
= 0,0396,
wR2
= 0,1095,
R
índices basados en 2198 reflexiones con I & gt; 2σ (I) (refinamiento de F
2), 311 parámetros, restricciones, 0
μ
= 0,108 mm
-1. CCDC 914990 contiene datos cristalográficos complementarias para la estructura. La elucidación detallada de la estructura y análisis de cristales será publicado en otros lugares.
tubulina purificación.
tubulina carente de proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP) se purificó a partir de cerebro bovino por ciclos de polimerización dependiente de la temperatura 0.072⟨
U
vdw
⟩−0.006⟨
U
elec
⟩−0.951⟨
U
cav
⟩. 0.7-5.6916a-5.997-62.8167.520.820-5.707--6b-6.918-60.2557.270.988-5.622--6c-6.087-63.6841.560.846-5.63991 ± 8.0-5.5186d-6.882-64.8535.950.865-5.708--6e-6.907-61.8579.0910.972-5.852--6f-7.252-62.6276.071.287-6.18938 ± 4.0-6.0366g-5.767-61.3464.560.445-5.227--6h-7.196-65.0855.791.033-6.003--6i-5.712-62.1241.140.723-5.40779 0.072⟨
U
vdw
⟩−0.006⟨
U
elec
⟩−0.951⟨
U
cav
⟩. hours
Sub-G
1
G
0/G
1
S
G
2/M
Sub-G
1
G
0/G
1
S
G
2/M
Sub-G
1
G
0/G
1
S
G
2/M
Noscapine0.2958.8510.2424.297.2419.484.1962.3830.6219.058.5337.365a0.2763.3712.9319.458.4613.474.0866.3741.5710.747.0839.256a1.4467.069.5320.178.1216.284.9463.1844.829.067.3937.726b0.7455.3912.1728.797.3719.424.1664.4243.1811.387.5335.846c0.8260.6611.4924.298.0820.724.8563.4936.7315.388.2738.416d0.5256.8212.2828.397.2722.734.6259.4145.388.297.8336.186e0.8762.5711.9323.158.1712.844.5768.4245.427.026.8338.526f1.0464.269.5122.479.4711.826.2967.4850.446.384.7237.296g0.6263.3212.9221.3710.8620.944.0862.2840.2912.768.0737.936h0.3561.1612.2925.0911.3712.255.9268.5848.737.196.2836.186i0.4657.4111.0827.1412.2519.574.6263.3840.1814.376.4337.156j0.3959.159.4724.358.2925.713.0966.1727.2422.168.6339.48Table