Extracto
La telomerasa es una transcriptasa inversa asociada a la inmortalidad celular a través de mantenimiento de los telómeros. Esta enzima se activa en 90% de los cánceres humanos, y los inhibidores de la telomerasa se encuentran actualmente en ensayos clínicos para contrarrestar el crecimiento del tumor. Muchos aspectos de la biología de la telomerasa han sido investigados por la terapia, particularmente la inhibición de la enzima, pero poco se ha hecho en relación con su vaivén subcelular. Recientemente hemos demostrado que las mutaciones en la señal de exportación nuclear de hTERT, el componente catalítico de la telomerasa, condujeron a un mutante (
NES-hTERT) que falló para inmortalizar las células a pesar de la localización nuclear y la actividad catalítica. Expresión de
NES-hTERT en fibroblastos primario resultó en la senescencia prematura a base de los telómeros y la disfunción mitocondrial. Aquí mostramos que la expresión de
NES-hTERT en LNCaP, las células HeLa y SQ20B rápida y significativamente disminuye su tasa de proliferación y la capacidad de formar colonias en agar blando, mientras que no interfiere con la actividad de telomerasa endógena. Las células cancerosas mostraron un incremento en el daño del ADN en los telómeros y sitios extra-teloméricas, y se convirtieron en sensibles a la radiación ionizante y exposiciones de peróxido de hidrógeno. Nuestros datos muestran que la expresión de
NES-hTERT contrarresta eficazmente el crecimiento de células de cáncer
in vitro Hoteles en al menos dos formas diferentes, y sugieren la manipulación con la NES de hTERT o su vaivén subcelular como una nueva estrategia para el cáncer tratamiento
Visto:. Kovalenko OA, Kaplunov J, U Herbig, deToledo S, Azzam IE, Santos JH (2010) Expresión de
NES-hTERT en células cancerosas retrasos progresión del ciclo celular y aumenta la sensibilidad a genotóxico Estrés. PLoS ONE 5 (5): e10812. doi: 10.1371 /journal.pone.0010812
Editor: Marcelo G. Bonini, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Abril, 2010; Aceptado: 3 Mayo 2010; Publicado: 25 de mayo de 2010
Derechos de Autor © 2010 Kovalenko y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Comisión de Nueva Jersey para la Investigación del cáncer (NJCCR), el número de concesión 808033 (JHS), desde 09 hasta 1124-CCR-EO (UH) y 10 a 2412-CCR-E0 (JF), la Oficina de Investigación del Ejército, el número de concesión 56027LS (JHS), la Fundación médica Ellison otorgan AG-NS-0387-07 (UH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una propiedad clave de los tumores malignos es su capacidad para proliferar indefinidamente. Esto es mediado, en 90% de los casos, por la reactivación de la telomerasa, una transcriptasa inversa responsable del mantenimiento de los telómeros [1], [2]. La telomerasa se compone mínimamente por dos subunidades diferentes, un núcleo catalítico (hTERT) y un componente ARN (hTR), que trabajan en conjunto para reponer los telómeros con cada división celular. hTERT se ha demostrado recientemente para adquirir propiedades de una ARN polimerasa dependiente de ARN cuando se encuentra en un complejo con el componente de ARN de la endoribonuclease mitocondrial MRP [3]; dicha actividad no está involucrado en el mantenimiento de los telómeros. Considerando hTR está presente tanto en las células somáticas y germinales constitutivamente, la expresión de hTERT está estrechamente regulada. Actividad de la telomerasa es alta durante la embriogénesis y en la gran mayoría de los tumores, pero es baja o inexistente en la mayoría de las células somáticas adultas [1]. Por esa razón, la inhibición de la telomerasa se ha convertido en una estrategia prometedora para el tratamiento del cáncer.
Varios enfoques diferentes han sido desarrollados para bloquear la actividad de la holoenzima de telomerasa, que van desde los inhibidores de hTERT a G-quadruplex agentes estabilizantes a la degradación selectiva de el hTR asociado [4] - [17]. En todos los casos, los resultados directos o indirectos de inhibición de la telomerasa en la incapacidad de las células para mantener los telómeros y en última instancia las células detención del crecimiento o mueren. Un problema de estos enfoques es que se requieren varias semanas a meses para los efectos, ya que se basan principalmente en la amplia acortamiento de los telómeros [5]. Sin embargo, los inhibidores de la telomerasa se encuentran actualmente en ensayos clínicos [18].
Recientemente hemos demostrado que un mutante hTERT defectuoso en su señal de exportación nuclear (
NES-hTERT) no pudo mantener los telómeros y la mitocondria "saludable" en ambos fibroblastos humanos primarios y SV40 transformadas [19]. A pesar de la localización nuclear y la actividad catalítica in vitro, la proteína mutante era biológicamente inactivo in vivo que conduce a la senescencia prematura con la activación de la respuesta al daño de ADN relacionadas telómero-clásico (DDR), cuando se expresa en células primarias. La expresión de la proteína mutante también se asoció con la disfunción mitocondrial y el daño del ADN tanto telomérica y sitios extra-telomérica [19]. Dados los efectos rápidos y dramáticos observados, la hipótesis de que la expresión ectópica de
NES-hTERT puede también ser un medio eficaz para contrarrestar el crecimiento de células cancerosas. En el presente estudio hemos expresado
NES-hTERT en diversas líneas de células cancerosas y muestran un retraso rápida y eficiente en la progresión del ciclo celular sin ningún cambio detectable en los niveles de actividad de la telomerasa enzimática endógena. La expresión de la proteína mutante disminuye de manera significativa la capacidad de las células para el crecimiento independiente de anclaje in vitro. Se encontró que la expresión ectópica de
NES-hTERT llevó a telomérica nuclear, el ADN extra-telomérica y mitocondrial (ADNmt) daños en las células cancerosas y sensibilizado al menos un tipo de células cancerosas tanto el estrés oxidativo y γ-radiación. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la orientación de la NES de hTERT o su movimiento intracelular como una nueva estrategia para contrarrestar eficazmente el crecimiento de células tumorales.
Resultados
La sobreexpresión de
NES-hTERT en la piel y líneas celulares de cáncer de próstata rápidamente bloques de progresión del ciclo celular
recientemente hemos demostrado que la expresión ectópica de un hTERT mutante en el que la NES se ha interrumpido (
NES-hTERT) provoca la senescencia prematura en los fibroblastos humanos telomerasa-negativos [19]. Las células primarias expresando
NES-hTERT dejado de crecer dentro de 5-20 duplicaciones de la población después de la introducción de la proteína mutante, que se asoció con signos clásicos de la senescencia celular, tales como el bloqueo en el G1 a S transición, la regulación positiva de p21
WAF1 , p16 y positividad para β-galactosidasa asociada a la senescencia (β-gal) la actividad [19]. Teniendo en cuenta estos efectos, nos preguntamos si la expresión de
NES-hTERT podría también afectar a la progresión del ciclo celular de las células cancerosas positivas de telomerasa. Para abordar esta cuestión, hemos expresado de forma estable
NES-hTERT en SQ20B (carcinoma de células escamosas - cáncer de piel) y LNCaP (cáncer de próstata) y el crecimiento de células en cultivos en masa seguida por varias semanas; Las células de control se dejaron no infectadas o infectadas con el vector vacío. No se observaron diferencias entre las células no infectadas y vacío en vectores transducidas (datos no mostrados). Las células se seleccionaron con antibióticos durante 2 semanas antes de la iniciación de los experimentos. transducciones virales se repitieron al menos dos veces independientes con cada línea celular que muestra los resultados reproducibles. Todos los experimentos presentados en este documento se basan en los datos obtenidos con las células derivadas de al menos dos infecciones virales independientes
Pronto llamó la atención que en los cambios de transducción viral en el fenotipo de las células producido.; No se observaron tales cambios mientras que todavía se están seleccionando células. Una fracción (~30-50%) de las células que expresan SQ20B
NES-hTERT había aplanado y morfología ampliada con algunas de estas células que muestran múltiples núcleos (Fig. 1A, paneles superiores), que recuerdan a los efectos observados en las células primarias [19]. A diferencia de los fibroblastos primarios, no se observó tinción β-gal positiva en las células que expresan SQ20B
NES-hTERT (datos no presentados), lo que sugiere que las células no fueron ampliadas senescente. Estas células también eran no apoptótica, ya que no eran ni formación de ampollas ni se separe de los platos (datos no mostrados). morfología ampliada no se observó en las células LNCaP que expresan el mutante hTERT; Sin embargo, mientras que estas células tienden a crecer en racimos /focos independientemente de su confluencia (véase también ATCC), expresión de
NES-hTERT suprimió este fenotipo (fig. 1A, los del centro).
(A ) SQ20B (paneles superiores) LNCaP (paneles intermedios) y sus derivados que expresan de forma estable
NES-hTERT se sembraron en placas en igual número y se analizaron 72 horas después. imágenes de contraste de fase se tomaron en un microscopio Olympus IX70. Tenga en cuenta la morfología ampliada de SQ20B
NES-hTERT y células que albergan múltiples núcleos (flechas). La agrupación se observa en LNCaP (véase el recuadro), pero no se ve en LNCaP
NES-hTERT. Los paneles inferiores muestran células HeLa que fueron transitoriamente transfectadas con el
NES-hTERT mutante. Las imágenes fueron tomadas 48 horas después de la transfección. Las flechas indican la agrandados y células multinucleadas (centro) observaron únicamente a transfección con el mutante hTERT. (B) SQ20B, LNCaP y su
derivados NES-hTERT se sembraron y se dejaron crecer durante un máximo de 144 horas. En varias ocasiones se recogieron las células y se contaron usando un hemocitómetro. En el caso de LNCaP, las células se volvieron a sembrar y se contaron de nuevo 72 horas más tarde. La media de tres análisis se muestra, las barras de error representan s.e.m. (* P = 0.05) (C) Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se calculó mediante citometría de flujo basado en la tinción PI. (D) Las células fueron privadas de suero durante la noche, luego se libera mediante la adición de suero. Las células se marcaron con [
3H] -timidina y se analizaron a intervalos de tiempo programados para la incorporación de timidina. La media de dos experimentos independientes se muestra, las barras de error son S. D.
Es posible que estos cambios morfológicos simplemente el resultado de la integración no específica de la
NES-hTERT pBabe vectorial. Para descartar esta posibilidad, transfectadas transitoriamente la proteína mutante en células HeLa (adenocarcinoma). Las células HeLa fueron escogidos debido a la alta eficiencia de las transfecciones transitorias (~ 60%) en comparación con las dos células SQ20B y LNCaP (~10-20%; los datos no presentados) y porque ellos también expresan telomerasa endógena. Para asegurar que las células analizadas estaban expresando la proteína mutante,
NES-hTERT se subclonó en el vector pCMV y, o bien transfectadas solo o co-transfectadas con GFP; los resultados fueron comparables con los dos enfoques. Las células transfectadas con el vector pCMV vacío (+ o - GFP) se utilizaron como controles negativos. Como se puede ver en la Fig. 1A (paneles inferior derecha), dentro de las 48 horas de la expresión de la proteína mutante, una fracción de células HeLa también mostró ampliada y aplanado morfología, que no se observó en las células transfectadas con el control de vector (Fig. 1A, panel inferior izquierdo). Estos datos sugieren que los cambios morfológicos observados estaban asociados específicamente con la expresión de
NES-hTERT. Curiosamente, se detectó ningún cambio en el número de células para la primera 96 h después de las transfecciones con la construcción de la proteína mutante (datos no mostrados), mientras que las células HeLa transducidas con el control de vectores se duplicaban 48 h después de la transfección (Fig. 1A, panel inferior izquierdo) .
a continuación, se define si
NES-hTERT la progresión del ciclo celular alterada de las células LNCaP y SQ20B utilizando tres enfoques diferentes. En primer lugar, sembramos número similar de células que expresan de forma estable o no la proteína mutante y seguido su crecimiento durante un período de 6 días. En cada punto de tiempo (24, 72 y 144 horas) las células se tripsinizaron y se contaron usando un hemocitómetro. Como se muestra en la Fig. 1B, la expresión de
NES-hTERT alteró la tasa de proliferación de ambos tipos de células. En estas condiciones, las células se sometieron a SQ20B 1 población se duplica cada 28 horas mientras SQ20B expresar el mutante hTERT duplicó cada ~36 horas. Los tiempos para duplicar en el caso de las células LNCaP y su
NES-hTERT derivado se estimaron en 36 y 57 horas, respectivamente (34 horas es el tiempo de duplicación de las células LNCaP de acuerdo con el proveedor (ATCC)). a continuación, que supervisó la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo. Las células se sincronizaron por la retirada del suero durante 16-18 horas. A las 8 horas después de la adición de suero, se recogieron las células y se incubaron con RNasa A y yoduro de propidio (PI). Los datos en la Fig. 1C son representativos de cuatro análisis independientes; en ambas líneas celulares de expresión
NES-hTERT aumentó el porcentaje de células en G1 mientras que disminuyó la fracción de células en S (Fig. 1C). Estos datos nos llevaron a cuantificar específicamente la fracción de células en fase S en base a la incorporación de timidina tritiada. poblaciones de células confluentes se subcultivaron a la densidad más baja y se incubaron en presencia de [
3H] -timidina. Movimiento en la fase S se monitorizó por autorradiografía a múltiples puntos de tiempo hasta 72 horas después del subcultivo. Estos experimentos se reproducen dos veces independientes y mostraron claramente una disminución significativa en el porcentaje de células en la fase S después de la expresión de la proteína mutante (Fig. 1D), en consonancia con los resultados obtenidos mediante citometría de flujo. En promedio, por ~20-70 horas después de células subcultura, SQ20B y LNCaP que expresan
NES-hTERT tenido el 40% y 60-80% menos de células en fase S, respectivamente, en comparación con sus respectivos controles.
Uno puede argumentar que los altos niveles de hTERT podrían estar manejando los efectos del ciclo celular, como se argumentó anteriormente [20]. Sin embargo, no estamos a favor de esta hipótesis como la expresión ectópica de tipo salvaje (WT) o hTERT R3E /R6e, un hTERT mutante que es incapaz de entrar en la mitocondria [21], no tuvo ningún efecto sobre la tasa de proliferación de las células (datos no presentados ). Otros grupos también han expresado ectópica WT hTERT de forma estable en varios tipos diferentes de células cancerosas y no se observaron defectos en la progresión del ciclo celular [22], [23]. Tomados en conjunto, los datos en la Fig. 1 muestran que la expresión de
NES-hTERT eficacia y rapidez retrasa la progresión de las células LNCaP y SQ20B través del ciclo celular.
sobreexpresión de
NES-hTERT en células de cáncer de próstata de la piel y disminuye la potencial formación de colonias
in vitro
Es necesaria una serie de transformaciones para que las células se vuelven tumorigénicas, incluyendo una mayor tasa de crecimiento y la capacidad de crecer de una manera independiente de anclaje [22] - [24]. La capacidad de las células transformadas para formar colonias en agar blando es un predictor útil en vitro de la formación de tumores in vivo [24]. Hemos tratado de investigar si los efectos observados sobre la tasa de proliferación después de la introducción de
NES-hTERT en células de cáncer de piel y de próstata afectarían su capacidad de formar colonias en agar blando. Con este fin, hacemos enchapado en igual número de SQ20B, LNCaP y su respectiva
derivados de NES-hTERT por triplicado en agar blando y les permitió crecer durante un máximo de 3 semanas; colonias se contaron todas las semanas con la tinción de cristal violeta. Dada la gran cantidad de colonias formadas en las semanas 2 y 3, en particular en los controles, marcamos el crecimiento después de 1 semana de crecimiento en el que las colonias individuales estaban todavía fácilmente distinguibles. Los resultados se reproducen dos veces independientes. Los paneles superiores en la Fig. 2 muestra el número de colonias formadas, paneles inferiores muestran imágenes representativas de las placas. En ambos tipos de células de cáncer, la introducción de
NES-hTERT disminuyó significativamente el número de colonias formadas, lo que sugiere la disminución potencial tumorigénico de las células en comparación con los respectivos controles vacíos vector que expresa.
5 × 10
3 células /pocillo de SQ20B, LNCaP y su
derivados NES-hTERT fueron cultivadas en agar blando por hasta 3 semanas. el crecimiento de colonias se evaluó cada semana y se contaron las colonias basa en tinción con cristal violeta. Los gráficos muestran resultados de colonias contadas en 1 semana cuando las colonias individuales, especialmente en las células de control, aún eran fácilmente distinguibles. Las colonias fueron anotados por dos observadores independientes. Los datos mostrados son la media de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras representan la media ± SD. Imágenes representativas de las placas se muestran debajo de cada gráfico.
Expresión de
NES-hTERT no altera los niveles endógenos de la actividad enzimática de la telomerasa, pero aumenta los niveles de daño en el ADN telomérico y extra-telomérica
la expresión ectópica de un hTERT mutante catalíticamente inactivo que se comportó como se demostró un dominante negativo de inhibir eficazmente la actividad enzimática de la telomerasa, lo que lleva a la erosión de los telómeros y la disminución de la proliferación de varios tipos de células cancerosas. Aumento de la apoptosis espontánea, disminución del crecimiento de la colonia en la formación de tumores agar y la disminución suave en ratones desnudos, también se observaron [9], [17]. Aunque
NES-hTERT es enzimáticamente activo in vitro, no es capaz de alargar los telómeros in vivo [19]. Por lo tanto, es posible que en el SQ20B telomerasa-positivas y las células LNCaP,
NES-hTERT se comporta de una manera dominante negativa, en última instancia conduce a la tasa de disminución de la proliferación se ha indicado anteriormente (Fig. 1). Para probar esta posibilidad, se analizaron los niveles de ARNm de hTERT y actividad de la telomerasa en extractos celulares enteros de células que expresan o no
NES-hTERT utilizando, respectivamente, RT-PCR y el protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP). Como era de esperar, los niveles de ARN de hTERT se incrementaron en las células que expresan ectópica el mutante (Fig. 3A). Sin embargo, no hay cambios en la actividad de la telomerasa enzimática se observaron mediante la expresión de la proteína mutante como se juzga por TRAP (Fig. 3B), lo que indica que
NES-hTERT no ejerce un efecto negativo dominante sobre la proteína endógena por lo menos en términos de la actividad enzimática.
(A) Los niveles de hTERT ARN se mide por RT-PCR. GAPDH se amplificó y se utilizó como control de carga. (B) 100 ng de extractos de células totales se utiliza para realizar la TRAP. La flecha indica el control interno del ensayo. Los controles positivos y negativos no se muestran.
En fibroblastos negativos telomerasa, la expresión de
NES-hTERT conduce a daños en el ADN telomérico y extra-telomérica [19]. Por lo tanto, otra posible explicación para la disminución de la tasa de proliferación es que
NES-hTERT induce daño en el ADN en las células cancerosas, que a su vez ve frenado por su capacidad para avanzar a través del ciclo celular. Hemos probado esta hipótesis mediante la evaluación de la presencia de la forma fosforilada de la variante de la histona H2A, γH2AX, y la proteína 1 (53BP1) 53 de unión. También se detectaron daños en el ADN en los telómeros directamente por inmuno-fluorescencia de hibridación in situ (FISH-inmuno) en las células individuales, el daño del ADNmt se evaluó mediante PCR cuantitativa de genes específicos (qPCR) [25] - [27].
Una forma de histona H2A fosforilada en la serina 139 (S139 de γH2AX) es esencial para el reconocimiento eficaz de rotura de ADN de doble hebra sitios (OSD). Cientos o miles de moléculas γH2AX generan focos nucleares que se puede encontrar en el sitio de cada DSB incipiente mediante inmunotinción con anticuerpos para γH2AX [28] - [30]. 53BP1 se activa como parte de la respuesta al daño del ADN (DDR) y también formar focos [28], [29], [31]. Se realizó el análisis de células individuales en SQ20B, las células LNCaP y su respectiva
derivados NES-hTERT como anteriormente hemos descrito [19], [29]. Las células se obtuvieron por tener daños en el ADN si fueran positivas tanto para γH2AX y 53BP1 focos. Número y tamaño de focos detectados en cada célula individual se cuantificaron y se representan en la Fig. 4A. En ambas líneas celulares la cantidad de focos se incrementó significativamente por la expresión de
NES-hTERT (
p = 0,006 para
SQ20B y 0,034 para las células LNCaP). Es digno de mención que la expresión de la proteína mutante dio lugar a un aumento significativo en las células presentadoras de focos de mayor tamaño. Por ejemplo, el número de SQ20B
células NES-hTERT mostrando 6 focos o más era 3 veces mayor que en las células control (SQ20B
p
= 0,004) (Fig. 4A).
Las células (a) se immunostained con anticuerpos contra γH2AX y en contra de 53BP1. ADN se contratinción con DAPI. El gráfico muestra el porcentaje de células positivas tanto para γH2AX y focos 53BP1 y el número y tamaño de focos por célula (representado por los diferentes colores de acuerdo con el etiquetado gráfico). Bares son la media ± S. D. (B) tinción ImmunoFISH para visualizar simultáneamente focos daño del ADN y telómeros. DAPI se utilizó para contrateñir ADN. El gráfico muestra el porcentaje de daño en el DNA focos localizados en los telómeros (TIF) por una sola célula. (C) la integridad ADNmt se analizó por QPCR en tres experimentos independientes. Gráfico muestran la frecuencia estimada de la lesión ± s.e.m.
A continuación, se evaluaron los niveles de focos inducidos por los telómeros (TIF), que han sido descritos como focos daño en el ADN presentada en sitios telomérica. TIF puede surgir por la erosión del telómero gradual debido a la proliferación celular continua o por estocástico daño del ADN telomérico [31] - [34]. Hemos adoptado un protocolo que ya hemos descrito anteriormente [29], y se calculó el número de células positivas TIF basado en el número total de células analizadas. Una célula se consideró TIF-positivo cuando 50% de mayor de daño en el DNA co-localizada con telómeros. Como se muestra en la Fig. 4B, los niveles de células TIF-positivas se incrementó significativamente por la expresión del hTERT mutante. De hecho, las células TIF-positivas aumentó aproximadamente 2 veces en el fondo mientras que en LNCaP SQ20B esta mejora fue menos pronunciado (Fig. 4B). En las células SQ20B, el nivel basal de TIF fue alta: alrededor del 45% de las células eran TIF-positivo. Tal nivel basal alto de daño de los telómeros fue inesperado ya que estas células expresan telomerasa endógena que, presumiblemente, mantiene sus telómeros. Sin embargo, la introducción de
NES-hTERT condujo a un aumento adicional de TIF que se detectó en el 70% de todas las células analizadas (Fig. 4B, barras de la izquierda).
Finalmente, analizamos ADNmt integridad por QPCR, como ya hemos demostrado que la expresión de
NES-hTERT se asocia con la disfunción mitocondrial, incluyendo la pérdida de la integridad ADNmt en fibroblastos primarios. Tales efectos fueron íntimamente ligados al daño en el ADN nuclear detectado en telomérica y sitios extra-telomérica [19].
Si se asume que el daño se distribuye al azar, QPCR permite una visión global de la integridad del genoma en estudio [25 ] - [27]. El ensayo mide la integridad de ADN utilizando objetivos largos de PCR, en este caso de 8,9 kb de longitud, que es aproximadamente 2/3 de todo el ADNmt. Dadas condiciones idénticas, el ADN de control y las muestras tratadas amplifican de manera diferente en función del número de las lesiones presentes en la plantilla por el tiempo de la reacción. Por ejemplo, el ADN de las células expuestas a UV amplifica menos de ADN del control no tratado correspondiente [35]. La cantidad de daño puede ser expresado como número de lesiones por cada 10 kb, suponiendo una distribución de Poisson de las lesiones en la plantilla. La presencia de lesiones que refleja la muestra de interés amplifica menos de su control, mientras que el número negativo de las lesiones se puede observar cuando el ADN de una muestra dada amplifica mejor que su respectivo control. Para vigilar los posibles cambios en el número de copias de ADNmt, un breve fragmento del genoma mitocondrial también se amplifica con el fin de normalizar los datos. límite de sensibilidad de la técnica es 1 lesión /10
5 bases (para más detalles sobre el ensayo, véanse las referencias [25] -.. [27] y [35]
Los datos de la figura 4C reflejan la media ± SEM de 3 análisis independientes. los niveles basales de las lesiones en los controles se calcularon con base en la amplificación promedio de las muestras de control de cada línea celular, que se utilizó a continuación como referencia para comparar cada control individual (para más detalles, véase el la sección Métodos). Como se esperaba, tanto en fondos expresión celular de
NES-hTERT aumentó significativamente los niveles basales de daño del ADNmt (Fig. 4C), lo que sugiere que la disfunción mitocondrial también se amplifica en las células cancerosas mediante la expresión de la proteína mutante.
en conjunto, los datos presentados en la Fig. 4 muestran que la expresión de
NES-hTERT en el SQ20B telomerasa-positivas y LNCaP células conduce al daño del ADN en los telómeros y extra-teloméricas sitios, que no son causado por una disminución en los niveles de enzima activa en el núcleo, pero puede estar asociada con mitocondrias disfuncionales.
NES-hTERT aumenta la sensibilidad a estrés genotóxico en células de cáncer de piel
expresión de la telomerasa se ha asociado con la modulación de la muerte celular inducida por agentes genotóxicos. Sensibilización, promoción y no se han reportado efectos sobre la apoptosis y /o necrosis, que parecen depender del tipo de células en estudio, el agente genotóxico utilizados y, sobre todo, de la longitud de los telómeros [17], [36] - [45]. Dado el significativo aumento en los niveles basales de daño nuclear y ADNmt observado tras la expresión del hTERT mutante, se investigó si las células se sensibilizan más a estrés genotóxico. Para estos experimentos, se seleccionaron células SQ20B, que se sabe que son altamente radioresistant tanto en términos de daño del ADN y pérdida de la capacidad proliferativa [46], [47].
En una primera serie de experimentos, hemos expuesto las células a los rayos gamma
137 Cs. SQ20B células y su
NES-hTERT derivado se sembraron a igual número y se enriquecieron en G1 durante 48 horas antes de la irradiación por el mantenimiento en el estado de confluencia. Esto es importante porque las células en diferentes fases del ciclo celular difieren en su sensibilidad a la radiación [48]. Las células se expusieron a 1 Gray (Gy) de radiación γ- (0,65 Gy /min), y analizaron el ADN nuclear (ADNn) daño por QPCR inmediatamente después de la exposición mediante el control de la integridad de un fragmento de 13,5 kb del gen de la β-globina [ ,,,0],25] - [27]. Los resultados presentados en la Fig. 5A demuestran claramente un aumento significativo en la cantidad de daño en el ADN γ inducida por los rayos en SQ20B
células hTERT-NES. Mientras que en las células SQ20B de control, se observó 1 lesión de cada 50 kb del genoma, el nivel de daño detectado en SQ20B
células NES-hTERT es 5 veces mayor, que se traduce en 1 lesión cada 10 kb de ADN de doble cadena ( Fig. 5A).
(daño a) el ADN nuclear se estimó en SQ20B y su
derivado NES-hTERT inmediatamente después de la exposición a 1 Gy de radiación gamma usando QPCR. Los resultados representan la media de tres experimentos independientes ± s.e.m. (B) Las células fueron tratadas con 200 mM de H
2O
2 durante 60 minutos y se dejaron recuperar durante 24 horas en medio condicionado. En este punto, se recogieron las células y el número de células apoptóticas, muertas y viables se evaluó por citometría de flujo utilizando PI y YOPRO-1. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. (C) La misma cantidad de células viables (500.000) fueron replated después de la H
2O
2 exposiciones y su tasa de crecimiento fue seguido por 2 semanas. El número de células se contó usando un hemocitómetro a las 24 horas y cada vez que las células se hizo confluente después. A medida que el número de SQ20B tratada
NES-hTERT no cambió en las 2 semanas siguientes, se muestran sólo los datos de las 24 horas posteriores al tratamiento. Resultados son la media de tres experimentos independientes ± s.e.m. (* P = 0.05).
A continuación se determinó si las células se sensibilizaron con otros tipos de estrés. Para este fin, se los expuso a peróxido de hidrógeno (H
2O
2) y analizamos la muerte celular por citometría de flujo. Elegimos H
2O
2 debido a nuestra experiencia con este factor de estrés oxidativo; Se llevaron a cabo experimentos como se describe por nosotros previamente [21], [49], [50]. En pocas palabras, el mismo número de células se sembró SQ20B 16 horas antes de la H
2O
2 exposiciones. Las células fueron tratadas con 200 mM H
2O
2 durante 60 minutos en medio basal en ausencia de FBS y se recogieron ya sea inmediatamente después de la exposición a H
2O
2 o dejaron recuperar durante 24 horas en medio de crecimiento condicionado. En ambos puntos, la cantidad de células muertas y apoptóticas se obtuvo sobre la base de la captación de yoduro de propidio (PI) y YOPRO-1 tinción. YOPRO-1 es un colorante verde fluorescente que detecta células apoptóticas específicamente [51] - [55]. Las células se analizaron por citometría de flujo para cuantificar con mayor confianza el porcentaje de células viables, muertas y apoptóticas. Como no se observaron cambios significativos en estos parámetros inmediatamente después de la H
2O
2 de tratamiento, los datos que se presentan a continuación se refieren al punto de recuperación de 24 horas.
La figura 5B ilustra los experimentos que son representativos de 3 análisis independientes. Se observó un gran aumento en la cantidad de células PI-positivos YOPRO-1 y en el fondo SQ20B tratado que expresa la hTERT mutante (Fig. 5B). La cuantificación del número de células viables, muertas y apoptóticas reveló que mientras que se observó un aumento de 2 veces en el número de células muertas (ya sea PI-positiva sólo o PI y YOPRO positivo) en SQ20B 24 horas después de los tratamientos, este aumento fue aproximadamente 5 veces en SQ20B expresando
NES-hTERT (Fig. 5B). No se detectaron diferencias significativas en la tasa basal de células muertas /apoptosis cuando se comparan SQ20B no tratadas con el derivado mutante que expresa (Fig. 5B, paneles superiores).
Para observar los efectos a largo plazo de la tratamientos, que luego siguieron las tasas de proliferación del control y SQ20B tratada y SQ20B
NES-hTERT durante 2 semanas después de la H
2O
2 exposición. Números iguales de control de viables y las células tratadas (0,5 × 10
6) se sembró y su número se contaron usando un hemocitómetro en las primeras 24 horas y cada vez que las células alcanzaron 100% de confluencia después de eso. Si bien los controles y tratados SQ20B duplicaron en número al menos una vez en las primeras 24 horas, no se observó ningún cambio en el número de células en el tratado SQ20B
NES-hTERT (Fig. 5C). Sorprendentemente, estas células se mantuvieron en reposo durante 2 semanas adicionales cuando finalmente comenzaron duplicar (datos no mostrados). Estos resultados son particularmente interesantes teniendo en cuenta que SQ20B albergan una mutación de p53 que es incapaz de inducir el punto de control G1-S tras el daño del ADN [46], [47].
En su conjunto, los datos que se muestran en la Fig. 5 demostrar que la expresión de
NES-hTERT es capaz de sensibilizar a SQ20B de radiación gamma y con el estrés oxidativo causado por H
2O
2.
Discusión
el presente estudio se demostró que la introducción de
NES-hTERT, un mutante que es defectuoso, en el transporte núcleo-citoplasma, en el carcinoma escamoso (SQ20B) y el cáncer de próstata (LNCaP) células da lugar a importantes retrasos en la progresión del ciclo celular, disminución de la proliferación tasa y el crecimiento independiente de anclaje (Figs 1, 2). Estos efectos no se asociaron con una disminución de la actividad enzimática de la telomerasa endógena ya que la expresión del mutante hTERT no alteró la actividad TRAP (Fig. 3). También se observó un aumento del daño del ADN en los telómeros y sitios extra-teloméricas, y mayor número de lesiones del ADN mitocondrial en condiciones normales tras la expresión de
NES-hTERT (Fig. 4). Sorprendentemente, el mutante hTERT sensibiliza las células SQ20B que de otro modo altamente resistente a la ionizantes daño en el ADN inducido por radiación y a la muerte celular inducida por H
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2 (Fig. 5). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la manipulación de la NES de hTERT o de vaivén subcelular de la telomerasa como novedoso y eficiente significa para contrarrestar el crecimiento de células tumorales.
NES-hTERT afecta ciclo celular y la tumorigenicidad de las células del cáncer de
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